專利名稱：用于在真菌細胞中生產(chǎn)多肽的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于在蛋白酶缺陷的細胞中生產(chǎn)多肽的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述許多微生物能夠在寬pH范圍生長。這種能力需要保護細胞內(nèi)過程免受極端pH影響的有效pH穩(wěn)態(tài)機制和確保位于pH穩(wěn)態(tài)界限之外的活性只發(fā)生于適當環(huán)境pH的方法。
pacC基因編碼稱為PacC的蛋白質(zhì)，PacC是一種序列特異的DNA結(jié)合蛋白，激活優(yōu)先在堿性pH合成的產(chǎn)物之基因的表達，并抑制適于在酸性生長條件下的基因產(chǎn)物的合成。Tilburn等人(1995，歐洲分子生物學雜志(EMBO Journal)14779-790)提出，當存在由應答堿性環(huán)境pH的palA、B、C、F、H、和I基因產(chǎn)物介導的信號時，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的PacC激活堿性表達基因的轉(zhuǎn)錄。已知palA、B、C、F、H、和I基因?qū)儆赑acC pH信號轉(zhuǎn)導途徑。由此，當處于堿性環(huán)境pH時，堿性基因的表達升高，而酸性基因的表達降低。在酸性條件下，PacC處于非功能形式且其水平降低，導致酸表達基因產(chǎn)物的脫抑制和堿性表達基因(包括pacC自身)激活的缺乏。
pacC基因或Pac pH信號轉(zhuǎn)導途徑基因的一些突變能夠模仿處于實際環(huán)境pH之外時的生長效果(Caddick等人，1986，分子普通遺傳學(Molecular General Genetics)203346-353；Shah等人，1991，F(xiàn)EMS微生物學通訊(FEMS Microbiological Letters)77209-212；Espeso等人，1993，歐洲分子生物學雜志(EMBO Journal)123947-3956；Arst等人，1994，分子普通遺傳學(Molecular GeneralGenetics)24587-790)。6種基因palA、B、C、F、H、和I任一種中的一些突變模仿處于酸性pH的生長效果，并導致例如酸性磷酸(酯)酶水平升高和堿性磷酸(酯)酶水平降低。相反，pacC基因中的一些突變模仿處于堿性pH的生長效果，并導致例如堿性磷酸(酯)酶水平升高和酸性磷酸(酯)酶水平降低。模仿堿性條件生長的這些pacC基因突變除去了調(diào)節(jié)其活性的C端片段。當除去了酸性C端結(jié)構(gòu)域之后，PacC是有活性的，能夠激活堿性條件生長所需基因的表達并抑制酸性條件生長所需基因的表達。pacC基因的這些突變回避了對信號轉(zhuǎn)導途徑的需要，導致堿性表達基因的構(gòu)成和酸性表達基因的超抑制。
已經(jīng)由構(gòu)巢曲霉(Tilburn等人，1995，見上文)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Maccabe等人，1996，分子普通遺傳學(MolecularGeneral Genetics)250367-374)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)(Pinero和Keller，1997，植物病理學(Phytopathology)87S78)、和產(chǎn)毒青霉(Penicillium chrysogenum)(Suarez等人，1996，分子微生物學(Molecular Microbiology)20529-540)克隆了pacC基因。
已經(jīng)公開了PacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑中的基因，包括構(gòu)巢曲霉palA(Negrete-Urtasun等人，1997，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)1791832-1835)、構(gòu)巢曲霉palB基因(Denison等人，1995，生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)27028519-28522)；構(gòu)巢曲霉palF基因(Maccheroni等人，1997，基因(Gene) 194163-167；)、和構(gòu)巢曲霉palI基因(Arst等人，1994，見上文)。
Caddick等人(1986，分子普通遺傳學(Molecular GeneralGenetics)203346-352)和Arst等人(1994，分子普通遺傳學(Molecular General Genetics)245787-790)已經(jīng)描述了PacC pH信號轉(zhuǎn)導突變體。
在不需要破壞或刪除負責總蛋白水解活性的每一種基因的情況下，降低或消除對感興趣蛋白質(zhì)的生產(chǎn)有害的蛋白水解活性的能力(特別是在重組細胞中)，將提供本領(lǐng)域目前不可獲得然而非常有吸引力的替代物。
本發(fā)明的一個目的是提供用于在真菌細胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的改進方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在適合于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中突變細胞包含兩種核酸序列，第一種核酸序列包含pacCpH信號轉(zhuǎn)導途徑的至少一種基因或其同源物的修飾，第二種核酸序列編碼多肽；和(b)由培養(yǎng)液分離多肽。
附圖簡述


圖1顯示了米曲霉(Aspergillus orzae)palB基因的基因組核酸序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖2顯示了pJaL400的限制性圖譜。
圖3顯示了pMT1935的限制性圖譜。
圖4顯示了pJaL394的限制性圖譜。
圖5顯示了pMT1931的限制性圖譜。
圖6顯示了pMT1936的限制性圖譜。
圖7顯示了米曲霉palA基因的部分基因組核酸序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO3和4)。
圖8顯示了pBM1a的限制性圖譜。
圖9顯示了pBM7的限制性圖譜。
圖10顯示了pBM8的限制性圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在適合于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中突變型真菌細胞通過修飾與親本細胞有關(guān)，如pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的一種或多種基因或其同源物的破壞或刪除；和(b)由突變細胞培養(yǎng)液分離多肽。
術(shù)語“pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑”此處定義為感覺微生物生長環(huán)境的環(huán)境pH，并通過基因palA、palB、palC、palF、palH、和palI編碼的一組細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，促進PacC轉(zhuǎn)變成有活性的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白水解加工的途徑。激活的PacC開啟堿性條件生長所需基因的表達，并關(guān)閉酸性條件生長所需基因的表達?？梢岳斫?，本發(fā)明的方法包括palA、palB、palC、palF、palH、和palI基因的同源物。
在本發(fā)明的方法中，可以修飾參與pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的任何真菌細胞基因，包括(但不限于)絲狀真菌或相似同源酵母(如Rim9p；Denison等人，1998，分子微生物學(Molecular Microbiology)30259-264)的palA、palB、palC、palF、palH、和/或palI基因。在優(yōu)選的實施方案中，基因是palA基因。在另一個優(yōu)選的實施方案中，基因是palB基因。在更優(yōu)選的實施方案中，基因是具有核酸序列SEQ IDNO1的米曲霉palA基因。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，基因是具有核酸序列SEQ ID NO3的米曲霉palB基因。
如下文所示，真菌細胞pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑中的一種或多種基因的修飾降低了由細胞產(chǎn)生的蛋白水解活性的量。一種或多種蛋白酶可能負責蛋白水解活性。在堿性條件下由PacC引起的特定蛋白酶基因表達降低產(chǎn)生的缺陷，由于缺乏由palA、B、C、F、H、和I基因編碼的基因產(chǎn)物組介導的信號，并不激活堿性表達基因的轉(zhuǎn)錄。
使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，通過降低或消除一種或多種上述基因的表達，可以構(gòu)建pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑突變型細胞。例如，通過改變對活性必需的編碼區(qū)或其一部分或者表達編碼區(qū)所需調(diào)控功能，可以修飾或滅活基因。這種調(diào)控或控制序列的實例可以是啟動子序列或其功能性部分，即足以影響核酸序列表達的一部分?？赡苄揎椀钠渌刂菩蛄邪?但不限于)前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活子。
基因的修飾或滅活可以如下進行，對親本細胞進行誘變，選擇能夠在親本細胞標準生長pH之外生長的突變型細胞，隨后測量突變型細胞對親本細胞的蛋白水解活性。例如，可以通過使用合適的物理或化學誘變劑，或通過使用合適的寡核苷酸，或通過將DNA序列進行PCR誘變，來進行特異的或隨機的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任意組合來進行誘變。
適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的范例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。
使用這些試劑時，通常如下進行誘變，在合適條件下，在存在選定誘變劑時，溫育待誘變的親本細胞，并篩選展示pacCpH信號轉(zhuǎn)導途徑的基因表達降低的突變型細胞。
可以通過在基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需調(diào)控元件中導入、替代、或除去一個或多個核苷酸，來實現(xiàn)pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑中的一種或多種基因的修飾或滅活。例如，可以插入或除去核苷酸，從而導入終止密碼子、除去起始密碼子、或改變開放讀碼框?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域的已知方法，通過定點誘變或PCR誘變，實現(xiàn)這些修飾或滅活。雖然從理論上說，可以在體內(nèi)(即直接在表達待修飾基因的細胞上)進行修飾，但是優(yōu)選如下文例示的在體外進行修飾。
滅活pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的方便方法的范例是基于基因替換、基因刪除、或基因破壞的技術(shù)。在基因破壞的方法中，在體外對對應于感興趣的內(nèi)源基因或基因片段的核酸序列進行誘變以產(chǎn)生缺陷型核酸序列，然后用該序列轉(zhuǎn)化親本細胞以產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組，缺陷型核酸序列取代了內(nèi)源基因或基因片段?？赡芷谕毕菪突蚧蚧蚱芜€編碼可用于選擇其中核酸序列已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體的標記。
或者，可以通過已建立的反義技術(shù)，使用與基因的核酸序列互補的核苷酸序列，進行pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑中的一種或多種基因的修飾或滅活。更具體的說，可以通過導入與基因的核酸序列互補、可以在細胞中轉(zhuǎn)錄、并能夠與細胞中產(chǎn)生的mRNA雜交的核苷酸序列，來降低或消除基因的表達。在能使互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯的蛋白質(zhì)的量由此被降低或消除。
與涉及真菌細胞中pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的基因的核酸序列互補或同源的核酸序列可以由包含這些基因的微生物來源獲得。具有與米曲霉核酸序列SEQ ID NO1互補或同源的核酸序列的palA基因的優(yōu)選來源是構(gòu)巢曲霉。具有與米曲霉核酸序列SEQ ID NO3互補或同源的核酸序列的palB基因的優(yōu)選來源是構(gòu)巢曲霉。
pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑其它基因(可能與所選真菌細胞相應基因的核酸序列互補或同源)的優(yōu)選絲狀真菌來源包括(但不限于)來自構(gòu)巢曲霉的palF基因(Maccheroni等人，1997，見上文)和來自構(gòu)巢曲霉的palI基因(Arst等人，1994，見上文)。此外，核酸序列對于真菌細胞可能是天然的。
pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑基因同源物(可能與所選真菌細胞相應基因的核酸序列互補或同源)的優(yōu)選酵母來源包括(但不限于)釀酒酵母(Rim9p；Denison等人，1998，見上文)。
在優(yōu)選的實施方案中，突變型真菌細胞還包含兩個或多個拷貝的pacC基因。兩個或多個拷貝的pacC基因預防了pal突變表型的基因外抑制?；蛲庖种骑@示為導致PacC組成性活性的pacC的平截。
pacC對于真菌細胞可以是天然的或異源的。來自絲狀真菌的pacC基因的優(yōu)選來源包括(但不限于)構(gòu)巢曲霉(Tilburn等人，1995，見上文)、黑曲霉(Maccabe等人，1996，見上文)、寄生曲霉(Pinero和Keller，1997，見上文)、和產(chǎn)毒青霉(Suarez等人，1996，見上文)。來自酵母的pacC基因同源物的優(yōu)選來源包括(但不限于)Yarrowia lipolytica(Lambert等人，1997，分子和細胞生物學(Molecularand Cellular Biology)173966-3976)和釀酒酵母(Su和Mitchell，1993，核酸研究(Nucleic Acids Research)213789-3797)。
在本發(fā)明的方法中，PacC pH信號轉(zhuǎn)導條件的修飾導致一種或多種蛋白酶的產(chǎn)量降低或消除。
術(shù)語“一種或多種蛋白酶”此處定義為一種或多種外肽酶和/或內(nèi)肽酶。外肽酶切割接近底物氨基或羧基末端的肽鍵，而內(nèi)肽酶切割遠離底物末端的肽鍵(Rao，1998，微生物學和分子生物學回顧(Microbiology and Molecular Biology Reviews) 62597-635)。外肽酶可以是氨肽酶或羧肽酶。外肽酶或內(nèi)肽酶可以是絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶(Rao等人，1998，見上文，North，1982，微生物學回顧(Microbiological Reviews)46308-340；Otto如Schirmeister，1997，化學回顧(Chemical Reviews)97133-171)。在優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是金屬蛋白酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是氨肽酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是羧肽酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種或多種蛋白酶是絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、氨肽酶、和/或羧肽酶。
可以使用本領(lǐng)域眾所周知的任何方法測定蛋白酶的活性。還可以使用本領(lǐng)域眾所周知的、對絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶特異的蛋白酶抑制劑鑒定蛋白水解活性的類型。參閱例如North，1982，見上文；Otto和Schirmeister，1997，見上文；和Rao等人，1998，見上文。
在本發(fā)明的方法中，在相同條件下培養(yǎng)時，與相應的親本真菌細胞相比，優(yōu)選突變型真菌細胞產(chǎn)生的一種或多種蛋白酶少至少大約25％，更優(yōu)選至少大約50％，甚至更優(yōu)選至少大約75％，最優(yōu)選至少大約95％。在最優(yōu)選的實施方案中，在相同條件下培養(yǎng)時，與相應的親本真菌細胞相比，突變型真菌細胞不產(chǎn)生可檢測的蛋白酶。在適合于生產(chǎn)感興趣多肽的條件下，或者在適合于生產(chǎn)一種或多種蛋白酶的條件下，可以在一種或多種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方面比較親本和突變細胞。
在本發(fā)明的方法中，多肽可以是對于感興趣的突變型真菌細胞是天然的或異源的任何多肽。
術(shù)語“多肽”此處并非指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此包括肽、寡肽、和蛋白質(zhì)。術(shù)語“異源多肽”此處定義為對于真菌細胞不是天然的多肽、經(jīng)修飾而改變了天然序列的天然多肽、或由于對真菌細胞進行了重組DNA技術(shù)的操作從而其表達在數(shù)量上發(fā)生了改變的天然多肽。例如，可以重組生產(chǎn)天然多肽，如通過將編碼多肽的基因置于不同啟動子的控制之下以增強多肽的表達，通過使用信號序列以促進感興趣的天然天然外排到細胞外，并增加編碼由細胞正常產(chǎn)生的多肽的基因的拷貝數(shù)。突變型真菌細胞可以包含一個或多個拷貝的編碼多肽的核酸序列。
多肽優(yōu)選激素或其變體、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分、或報道基因。在更優(yōu)選的實施方案中，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
可以由任何原核、真核、或其它來源獲得編碼感興趣的多肽、能夠在真菌細胞中表達的核酸序列。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“由……獲得”如此處與指定來源一起使用時，指多肽由該來源或插入了來自該來源的基因的細胞產(chǎn)生。
用于分離或克隆編碼感興趣多肽的核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括由基因組DNA的分離方法、由cDNA的制備方法、或其組合。例如通過使用眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)，能夠由這種基因組DNA克隆核酸序列。參閱Innis等人，1990，《PCR方法和應用指南》(PCRA Guide to Method and Application)，AcademicPress，紐約?？寺〔襟E可能涉及切割并分離包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將片段插入載體分子，并將重組載體摻入將復制多個拷貝或克隆的核酸序列的突變型真菌細胞。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源、或其任意組合。
在本發(fā)明的方法中，多肽還可以包括融合或雜合多肽，其中另一種多肽融合在多肽或其片段的N端或C端。通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼各種多肽的編碼序列，使得它們處于同一讀碼框，且融合多肽的表達受相同啟動子和終止子的控制。雜合多肽可以包括至少兩種不同多肽的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種多肽對于突變型真菌細胞可能是異源的。
可以以多種方式操作編碼感興趣多肽的分離核酸序列，以提供多肽的表達。表達應理解為包括涉及多肽生產(chǎn)的任何步驟，包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。在插入載體前對核酸序列進行操作可能是希望的或必需的，這取決于表達載體。利用克隆方法用于修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。
“核酸構(gòu)建物”此處定義為由天然產(chǎn)生的基因分離的、或經(jīng)修飾包含以自然界中不存在的方式組合和并列的核酸片段的單鏈或雙鏈核酸分子。當核酸構(gòu)建物包含本發(fā)明編碼序列表達所需的所有控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建物”與術(shù)語“表達盒”同義。術(shù)語“編碼序列”此處定義為直接指示其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列?；蚪M編碼序列的邊界通常由正好位于mRNA開放讀碼框5’末端上游的ATG起始密碼子(真核生物)和正好位于mRNA開放讀碼框3’末端下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定。編碼序列可以包括(但不限于)DNA、cDNA、和重組核酸序列。
術(shù)語“控制序列”此處定義為包括對感興趣多肽的表達必需或有利的所有成分。每一種控制序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然的或外來的。這些控制序列包括(但不限于)前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，控制序列包括啟動子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。為了導入有助于將控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)連接的特異限制性位點，可以與接頭一起提供控制序列。術(shù)語“可操作連接”此處定義為其中控制序列被正確置于相對于DNA序列編碼序列的位置使得控制序列指導多肽表達的這樣一種構(gòu)象。
控制序列可以是恰當?shù)膯幼有蛄校从捎糜诒磉_核酸序列的真菌細胞識別的核酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選定的真菌細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的、和雜合的啟動子，而且可以由編碼對于真菌細胞是同源的或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。
用于在絲狀真菌細胞中指導核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的范例是由編碼米曲霉的TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉的脂酶、米曲霉的堿性蛋白酶、米曲霉的磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉的乙酰胺酶、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)的胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)獲得的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(黑曲霉的中性α-淀粉酶基因和米曲霉的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因啟動子的雜合體)，及其突變的、截短的、和雜合的啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子由釀酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母的半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母的醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因、和釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因獲得。Romanos等人(1992，酵母(Yeast)8423-488)描述了用于酵母宿主細胞的其它有用的啟動子。
控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即由真菌細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3’端可操作連接。在選定的真菌細胞中發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌細胞的優(yōu)選終止子由編碼米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉的α-糖苷酶、和尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得。
用于酵母細胞的優(yōu)選終止子由編碼釀酒酵母的烯醇化酶、釀酒酵母的細胞色素C(CYC1)、或釀酒酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。Romanos等人(1992，見上文)描述了用于酵母細胞的其它有用的終止子。
控制序列還可以是合適的前導序列，即對于真菌細胞進行的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5’端可操作連接。在選定的真菌細胞中發(fā)揮功能的任何前導序列都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌細胞的優(yōu)選前導序列由編碼米曲霉的TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉的磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因獲得。
用于酵母細胞的合適前導序列由編碼釀酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母的α-因子、和釀酒酵母的醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得。
控制序列還可以是多聚腺苷酸化序列，即與核酸序列的3’端可操作連接、當轉(zhuǎn)錄時由真菌細胞識別作為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號的序列。在選定的真菌細胞中發(fā)揮功能的任何多聚腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌細胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列由編碼米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉的α-糖苷酶的基因獲得。
Guo和Sherman(1995，分子細胞生物學(Molecular CellularBiology)155983-5990)描述了用于酵母細胞的有用的多聚腺苷酸化序列。
控制序列還可以是編碼與多肽的氨基末端連接并引導編碼的多肽進入細胞分泌途徑的氨基酸序列的信號肽編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列的5’端可能固有的包含在翻譯讀碼框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)天然連接的信號肽編碼區(qū)?；蛘撸幋a序列的5’端可能包含對于編碼序列是外源的信號肽編碼區(qū)。當編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)時，可能需要外源信號肽編碼區(qū)。或者，為了增強多肽的分泌，可以僅僅用外源信號肽編碼區(qū)取代天然信號肽編碼區(qū)。但是，引導表達的多肽進入選定真菌細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌細胞的有效信號肽編碼區(qū)是由編碼米曲霉的TAKA淀粉酶、黑曲霉的中性淀粉酶、黑曲霉的葡糖淀粉酶、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens的纖維素酶、和Humicolalanuginosa的脂酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。
用于酵母細胞的有用信號肽由編碼釀酒酵母的α-因子和釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。Romanos等人(1992，見上文)描述了其它有用的信號肽編碼區(qū)。
控制序列還可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。產(chǎn)生的多肽稱為前酶或前多肽(或者在某些情況中稱為酶原)。前多肽通常是無活性的，而且可以由前多肽通過前肽的催化或自催化切割轉(zhuǎn)變成成熟的有活性多肽。前肽編碼區(qū)可以由釀酒酵母的α-因子基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)的漆酶基因(WO 95/33836)獲得。
當信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)緊靠多肽的氨基末端，而信號肽區(qū)緊靠前肽區(qū)的氨基末端。
可能還需要添加能夠相對于真菌細胞的生長調(diào)控多肽表達的調(diào)控序列。調(diào)控系統(tǒng)的范例是應答化學或物理刺激(包括存在調(diào)控化合物)引起基因表達開啟或關(guān)閉的調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子、和米曲霉的葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)控序列。調(diào)控序列的其它范例是能夠用于擴增基因的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，包括當存在氨甲喋呤時擴增的二氫葉酸還原酶基因和當存在重金屬時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的核酸序列將與調(diào)控序列可操作連接。
在本發(fā)明的方法中，可以使用用于改變編碼感興趣多肽的內(nèi)源基因表達的核酸構(gòu)建物。該構(gòu)建物可以包含改變內(nèi)源基因表達所需最小數(shù)目的成分。在一個實施方案中，該核酸構(gòu)建物優(yōu)選包含(a)靶向序列、(b)調(diào)控序列、(c)外顯子、和(d)剪接供體位點。將核酸構(gòu)建物導入細胞后，構(gòu)建物通過同源重組插入細胞基因組中的內(nèi)源基因位點。靶向序列指導元件(a)-(d)整合到內(nèi)源基因中，使得元件(b)-(d)與內(nèi)源基因可操作連接。在另一個實施方案中，核酸構(gòu)建物包含(a)靶向序列、(b)調(diào)控序列、(c)外顯子、(d)剪接供體位點、(e)內(nèi)含子、和(f)剪接受體位點，其中靶向序列指導元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)與內(nèi)源基因可操作連接。但是，構(gòu)建物可以包含其它成分，諸如選擇標記。
在這兩個實施方案中，這些成分的導入產(chǎn)生了內(nèi)源基因表達改變了的新的轉(zhuǎn)錄單位。在本質(zhì)上，新的轉(zhuǎn)錄單位是通過靶向構(gòu)建物導入的序列和內(nèi)源基因的融合產(chǎn)物。在內(nèi)源基因改變了的一個實施方案中，基因被激活。在該實施方案中，使用同源重組，插入將引起基因以高于相應親本細胞的水平表達的調(diào)控序列，從而替代、破壞、或滅活與親本細胞內(nèi)源基因正常相連的調(diào)控序列。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法(參閱美國專利號5,641,670)，通過在構(gòu)建物中包含可擴增的選擇標記，可以進一步擴增激活的基因。在內(nèi)源基因改變了的另一個實施方案中，基因表達降低了。
靶向序列可以位于內(nèi)源基因內(nèi)、直接與基因相鄰、位于上游基因內(nèi)、或位于內(nèi)源基因上游且相距一定距離?？梢允褂靡环N或多種靶向序列。例如，環(huán)狀質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選采用單個靶向序列，而線性質(zhì)粒或DNA片段優(yōu)選采用兩個靶向序列。
構(gòu)建物的調(diào)控序列可以包含一種或多種啟動子、增強子、支架附著區(qū)或基質(zhì)結(jié)合位點、負調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點、或這些序列的組合。
構(gòu)建物還包含內(nèi)源基因的一個或多個外顯子。外顯子定義為拷貝成RNA、并存在于成熟mRNA分子中的DNA序列，因此外顯子序列與內(nèi)源基因的編碼區(qū)處于同一讀碼框。外顯子可以任選的包含編碼一個或多個氨基酸和/或部分編碼氨基酸的DNA?；蛘?，外顯子包含對應于5’非翻譯區(qū)的DNA。當外源外顯子或外顯子編碼一個或多個氨基酸和/或部分氨基酸時，核酸構(gòu)建物被設計成在轉(zhuǎn)錄和剪接后，讀碼框與內(nèi)源基因編碼區(qū)處于同一讀碼框，因此由第二個外顯子衍生的mRNA部分的正確讀碼框沒有改變。
構(gòu)建物的剪接供體位點指導一個外顯子與另一個外顯子的剪接。通常，第一個外顯子位于第二個外顯子的5’，而且位于第一個外顯子3’側(cè)翼且有交疊的剪接供體位點識別位于第二個外顯子5’側(cè)翼的剪接受體位點。剪接受體位點和剪接供體位點一樣，是指導一個外顯子與另一個外顯子發(fā)生剪接的序列。剪接系統(tǒng)利用剪接受體位點與剪接供體位點聯(lián)合作用以除去內(nèi)含子。
在本發(fā)明的另一個方面，突變型真菌細胞還可以包含一種或多種編碼可能有害于感興趣多肽的生產(chǎn)、回收、和/或應用的蛋白質(zhì)的第三種核酸序列的修飾。修飾降低或消除了一種或多種第三種核酸序列的表達，導致在相同條件下培養(yǎng)時，包含經(jīng)修飾的第三種核酸序列的突變細胞可以比不含第三種核酸序列的修飾的突變細胞產(chǎn)生更多的多肽。第三種核酸序列可以編碼任何蛋白質(zhì)或酶。例如，酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
可以將上述各種核酸和控制序列連接在一起，以產(chǎn)生重組表達載體，該載體可以包含一個或多個方便的限制性位點，使得能夠在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘呖梢酝ㄟ^將包含該核酸序列的序列或核酸構(gòu)建物插入用于表達的適當載體來表達編碼多肽的核酸序列。在構(gòu)建表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得編碼序列與用于表達(和可能的分泌)的適當控制序列可操作連接。
重組表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA步驟并能夠表達編碼多肽的核酸序列的任何載體(如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與將要導入該載體的真菌細胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體、或人工染色體。載體可以包含確保自我復制的任何手段?；蛘咻d體可以是當導入真菌細胞后整合到基因組中并與它所整合的染色體一起復制的載體。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒或者兩個或多個載體或質(zhì)粒(它們共同包含將要導入真菌細胞基因組中的總DNA)或者轉(zhuǎn)座子。
載體優(yōu)選包含一種或多種能夠容易選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞的選擇標記。選擇標記是其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、使營養(yǎng)缺陷型變成原養(yǎng)型、等等的基因。用于酵母細胞的合適標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌細胞的選擇標記包括(但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。優(yōu)選用于絲狀真菌細胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉素(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
載體優(yōu)選包含能夠使載體穩(wěn)定整合到細胞基因組中或能夠使載體在細胞中不依賴于基因組而自主復制的元件。
“導入”指將包含編碼感興趣多肽的核酸序列的載體導入細胞，使得載體作為染色體整合載體或自我復制的染色體外載體獲得維持。通常認為整合是有利的，因為這樣核酸序列更有可能在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在。載體整合到染色體中的過程通過同源重組、非同源重組、或轉(zhuǎn)座發(fā)生。
表達載體整合到真菌細胞中可能涉及由以本質(zhì)上已知形式的原生質(zhì)體的形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、和細胞壁的再生組成的過程。用于整合曲霉屬細胞的合適步驟描述于EP 238 023和Yelton等人，1984，美國國家科學院進展(Proceedings ofNational Academy of Sciences USA)811470-1474。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的合適方法描述于Malardier等人，1989，基因(Gene)78147-156和WO 96/00787?？梢允褂肂ecker和Guarente(J.N.Abelson和M.I.Simon編，酵母遺傳學和分子生物學指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶學方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187頁，Academic Press公司，紐約；Ito等人，1983，細菌學雜志(Journal ofBacteriology)153163；和Hinnen等人，1978，美國國家科學院進展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA) 751920)描述的步驟轉(zhuǎn)化酵母。
為了整合到細胞基因組中，載體可以依賴編碼多肽的核酸序列或用于通過同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合到基因組中的任何其它元件?；蛘咻d體可以包含用于通過同源重組指導整合到細胞基因組中的其它核酸序列。上述其它核酸序列使得載體能夠在染色體中的精確位點整合到基因組中。為了提高在精確位點整合的可能性，整合元件應當優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，諸如100-1,500個堿基對，優(yōu)選400-1,500個堿基對，最優(yōu)選800-1,500個堿基對，這些核酸序列與相應的靶序列高度同源以增強同源重組的幾率。整合元件可以是與細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到細胞基因組中。
為了自主復制，載體還可以包含使得載體能夠在所述細胞中自主復制的復制起點。用于在酵母細胞中使用的復制起點的范例是2μ復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。復制起點可以是具有使其在真菌細胞中的功能為溫度敏感型的突變的復制起點(參閱Ehrlich，1978，美國國家科學院進展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)751433)。
可以理解，本發(fā)明的方法不限于用于獲得突變型真菌細胞的特定目?？梢栽跇?gòu)建用于生產(chǎn)多肽的細胞的過程中的任何步驟，將涉及pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的基因的修飾導入細胞。優(yōu)選的是，在導入編碼多肽的基因之前，真菌突變型細胞的pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑中的基因已經(jīng)通過本發(fā)明的方法進行了修飾。
用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達載體的步驟對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的(參閱J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第2版，冷泉港，紐約)。
在本發(fā)明的方法中，真菌細胞可以是野生型細胞或突變型細胞。
“真菌”，如此處所用，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(由Kawksworth等人在《Ainsworth和Bisby氏真菌字典》(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)中定義的，第8版，1995，CAB International，University Press，劍橋，英國)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人記錄的，1995，見上文，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，見上文)。
在優(yōu)選的實施方案中，真菌細胞是酵母細胞?！敖湍浮?，如此處所用，包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母、和屬于半知菌綱的酵母(芽孢綱(Blastomycete))。由于酵母的分類將來可能改變，為了本發(fā)明的目的，應當如《酵母的生物學和活性》(Biology and Activities of Yeast)(F.A.Skinner、S.M.Passmore、和R.R.Davenport編，應用細菌學學會第9次座談會(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series NO.9)，1980)所述定義酵母。
在更優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬的細胞。
在最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，真菌細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人定義的，1995，見上文)的亞門的所有絲狀形態(tài)。絲狀真菌的特點通常在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、和其它復雜多糖組成的菌絲壁。通過菌絲的延長進行營養(yǎng)生長，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母(諸如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽進行的，碳代謝可以是發(fā)酵性的。
在更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、線黑粉菌屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrathecium)、Neocallimastix屬、脈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces屬、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium屬、或木霉屬(Trichoderma)的細胞。
在最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細胞。
在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的同義詞)、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、茄病鐮孢、側(cè)孢樣鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、或Fusariumvenenatum細胞。
Fusarium venenatum細胞最優(yōu)選Fusarium venenatum A3/5，最初作為禾谷鐮孢ATCC 20334保藏、最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遺傳學和生物學(Fungal Genetics and Biology)2362-80)以及O’Donnell等人(1998，真菌遺傳學和生物學(Fungal Genetics andBiology)2357-67)重新分類為Fusarium venenatum；以及Fusariumvenenatum的分類學同等物，不論這些物種現(xiàn)在的名稱如何。在另一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)usarium venenatum細胞是Fusariumvenenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形態(tài)學突變體，公開于WO 97/26330。
在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是虱狀赤霉(Gibberella pulicaris)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉、露濕漆斑菌(Myrothecium roridin)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、或產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)的細胞。
在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei、或綠色木霉(Trichoderma viride)的細胞。
在本發(fā)明的方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法，在適合于生產(chǎn)感興趣多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變型真菌細胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)和在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進行的小量或大量發(fā)酵(包括連續(xù)、成批、補料分批、或固態(tài)發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基中和在能夠表達和/或分離多肽的條件下，培養(yǎng)細胞。在包含碳源、氮源、和無機鹽的合適培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知步驟進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以由供應商處購買，或者可以根據(jù)發(fā)表的組成成分配制(如美國典型培養(yǎng)物收藏中心的目錄)?？梢杂膳囵B(yǎng)基直接回收分泌型多肽。
可以使用對多肽特異的本領(lǐng)域已知方法檢測多肽。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，酶實驗可以用于測定多肽活性。用于測定許多酶的酶活性的步驟在本領(lǐng)域是已知的。
可以通過本領(lǐng)域的已知方法分離產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過傳統(tǒng)步驟由培養(yǎng)液分離多肽，包括(但不限于)離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。然后可以通過本領(lǐng)域的多種已知步驟純化分離的多肽，包括(但不限于)層析(如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳步驟(如制備性等電聚焦)、差異溶解(如硫酸銨沉淀)、或抽提(參閱《蛋白質(zhì)純化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，紐約，1989)。
本發(fā)明由下列實施例進一步描述，這些實施例不應當理解為本發(fā)明范圍的限制。
實施例材料作為緩沖液和底物使用的化學藥品是至少試劑級的商品。材料和溶液PDA平板含有39g/L馬鈴薯右旋糖瓊脂(Difco)，并添加10mM尿苷用于pyrG營養(yǎng)缺陷型。
MY25培養(yǎng)基(pH6.5)每升含有25g麥芽糖、2.0g MgSO4·7H2O、10g KH2PO4、2.0g檸檬酸、10g酵母提取物、2.0g K2SO4、2.0g尿素、和0.Sml微量金屬溶液。將MY25搖瓶培養(yǎng)基用玻璃蒸餾水1∶100或1∶1000稀釋以用于微量滴定培養(yǎng)實驗(MY25/100或MY25/1000)。將培養(yǎng)物于34℃培養(yǎng)。
2X MY鹽溶液(pH6.5)每升含有4g MgSO4·7H2O、4g K2SO4、20g KH2PO4、4g檸檬酸、1ml微量金屬溶液、和2ml CaCl2·2H2O(100g/L原液)。
基本培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化平板(pH6.5)每升含有6g NaNO3、0.52g KCl、1.52g KH2PO4、1ml微量金屬溶液、1g葡萄糖、500mg MgSO4·7H2O、342.3g蔗糖、和20g Noble瓊脂?；九囵B(yǎng)基轉(zhuǎn)移平板(pH6.5)每升含有6g NaNO3、0.52g KCl、1.52g KH2PO4、1ml微量元素、10g葡萄糖、500mg MgSO4·7H2O、和20g Noble瓊脂。
微量金屬溶液(1000X)每升含有22g ZnSO4·7H2O、11g H3BO3、5g MnCl2·4H2O、5g FeSO4·7H2O、1.6g CoCl2·5H2O、1.6g(NH4)6Mo7O24、和50g Na4EDTA。
COVE平板每升含有343.3g蔗糖、20ml COVE鹽溶液、10ml1M乙酰胺、10ml 3M CsCl、和25g Nobel瓊脂。COVE鹽溶液(50X)每升含有26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4、和50ml COVE微量金屬溶液。COVE微量金屬溶液每升含有0.04g NaB4O7·10H2O、0.040g CuSO4·5H2O、0.70g FeSO4·H2O、0.80g Na2MoO2·2H2O、和10g ZnSO4。
NZY平板每升含有5g NaCl、2g MgSO4·7H2O、5g酵母提取物、10g NZ胺、和15g Bacto瓊脂。
YEG培養(yǎng)基每升含有5g酵母提取物和20g右旋糖。
STC含有1.2M山梨醇/10mM CaCl2/10mM Tris(pH7.5)。
SM緩沖液每升含有5.8g NaCl、2g MgSO4·7H2O、50ml 1MTris-HCl(pH7.5)、和5ml 2％明膠。實施例1用pDSY82轉(zhuǎn)化米曲霉HowB430如WO 98/11203所述構(gòu)建米曲霉HowB430。
按照下面的方案制備米曲霉HowB430的原生質(zhì)體。將米曲霉HowB430在100ml培養(yǎng)基(1％酵母提取物/2％胨/1％葡萄糖)中于32℃以150rpm振搖培養(yǎng)16-18小時。通過0.45mm濾器過濾回收菌絲體直至濾器上剩下大約10ml，用25ml 1.0-1.2M MgSO4/10mM磷酸鈉(pH6.5)清洗，如前過濾，再次如前清洗直至剩下10ml，然后重懸于裝在125ml Ehrlenmeyer燒瓶中的10ml 5mg/ml NOVOZYM234TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvrd，丹麥)(溶于1.2M MgSO4/10mM磷酸鈉(pH6.5)，0.45mm過濾)。將懸浮液以50rpm溫和振搖于37℃溫育1小時以產(chǎn)生原生質(zhì)體。將10ml原生質(zhì)體/菌絲體制備物加到30ml Corex離心管中，用5ml 0.6M山梨醇/10mM Tris-HCl(pH7.5)封蓋，并在旋轉(zhuǎn)桶狀轉(zhuǎn)頭中以3600xg離心15分鐘以回收原生質(zhì)體。使用巴斯德移液管由緩沖液界面回收原生質(zhì)體。然后將原生質(zhì)體用5倍體積的STC清洗，離心，如前清洗并離心。將原生質(zhì)體重懸于STC至終濃度2x107原生質(zhì)體/ml。
在14ml Falcon聚丙烯管中加入0.1ml濃度為2x107原生質(zhì)體/ml的原生質(zhì)體、5-15μl用15U BamHI線性化的pDSY82(WO98/11203)、和250μl 60％PEG4000/10mM CaCl2/10mM Tris-HCl(pH7)，溫和混勻，并于37℃溫育30分鐘。將懸浮液與12ml熔化的上層瓊脂(1X COVE鹽/1％NZ胺/0.8％蔗糖/0.6％Nobel瓊脂)或3ml STC混合，并將懸浮液倒在基本培養(yǎng)基平板上。將平板于37℃溫育3-5天。
BamHI REMI pDSY82轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率的范圍為大約80-100轉(zhuǎn)化體/μg DNA。獲得了米曲霉HowB430的BamHI REMI文庫，含大約27,000個DNA標簽轉(zhuǎn)化體。
米曲霉HowB430標簽突變庫集合稱為“b”，因為pDSY82經(jīng)BamHI消化，且隨后轉(zhuǎn)化時存在BamHI，將文庫合并成大約1000個轉(zhuǎn)化體的組并在10％甘油中保存于-80℃。實施例2脂酶表達篩選對實施例1中所述HowB430標簽突變庫“b”集合測驗脂酶表達。
對于96孔板篩選，使用等體積無菌水和2X MY鹽溶液(pH6.5)制成的稀釋液將MY25培養(yǎng)液稀釋1000倍。對于24孔板篩選，使用等體積無菌水和2X MY鹽溶液(pH6.5)制成的稀釋液將MY25培養(yǎng)液稀釋100倍。
最初的96孔板篩選包括用MY25//1000稀釋來自不同匯合體的孢子，使得將50ml培養(yǎng)液分裝到孔中時每個孔平均接種1個孢子。接種后，將96孔板于34℃靜止培養(yǎng)7天。然后如下文所述測驗培養(yǎng)物的脂酶活性。直接在裝有MY25/100的24孔板中接種感興趣的突變體，并于34℃培養(yǎng)7天。然后如下文所述測驗培養(yǎng)物的脂酶活性。然后將感興趣的突變體涂布在COVE平板上以產(chǎn)生孢子，傳布到PDA平板上以產(chǎn)生單菌落，然后使用上述24孔板方法測試每種分離菌的4個單菌落。
臨使用前將對-硝基苯丁酸底物原液(21ml對-硝基苯丁酸/mlDMSO)用MC緩沖液(4mM CaCl2/100mM MOPS(pH7.5))150稀釋，由此配制脂酶測驗底物。將標準脂酶(LIPOLASETM，NovoNordisk A/S，Bagsvrd，丹麥)用含0.02％ α-烯烴磺酸酯(AOS)去污劑的MC緩沖液配制成40LU/ml。將標準液保存于4℃直至使用。臨使用前將標準脂酶用MC緩沖液1/40稀釋。將培養(yǎng)液樣品用含0.02％AOS去污劑的緩沖液稀釋，并將20μl分裝至96孔板的孔中，隨后加入200μl經(jīng)稀釋底物。使用平板讀數(shù)儀記錄405nm吸光值的2個讀數(shù)，間隔大約1分鐘。相對于脂酶標準計算脂酶單位/ml(LU/ml)。
96孔板篩選及隨后24孔板篩選的結(jié)果鑒定了命名為DEBY10.3的DNA標簽突變體以用于進一步的評價，該菌株產(chǎn)生的脂酶水平比對照菌株米曲霉HowB430高。實施例3米曲霉DEBY10.3的搖瓶評價將實施例2中所述米曲霉DEBY10.3涂布在COVE平板上以產(chǎn)生用于搖瓶評價的孢子。
搖瓶評價如下進行，用300-500ml孢子懸浮液(0.02％吐溫80和來自COVE平板的孢子)接種裝在125ml搖瓶中的25ml MY25培養(yǎng)基(pH6.5)。將搖瓶于34℃以200rpm溫育3天。在第2天和第3天取樣，并如實施例2中所述測量脂酶活性。
所得結(jié)果顯示于下文表1，其中將作為對照的米曲霉HowB430的脂酶產(chǎn)量標準化為1.0。表1.DNA標簽突變體的脂酶表達菌株描述構(gòu)建 集合 #96孔板篩選 24孔板結(jié)果 搖瓶結(jié)果(LU/ml) (LU/ml)HowB430HowB425+pBANe8 NANA1.01.0DEBY10.3 pDSY81+BamHIb1808 1.72.2如表1中所示，在搖瓶中培養(yǎng)時米曲霉DEBY10.3產(chǎn)生的脂酶比對照菌株米曲霉HowB430多大約2.2倍。實施例4由米曲霉DEBY10.3拯救質(zhì)粒DNA和側(cè)翼DNA由米曲霉DEBY10.3分離pDSY82 DNA和基因組側(cè)翼基因座。
按照下面的步驟由米曲霉DEBY10.3分離基因組DNA。用每種突變體的孢子原種接種150ml YEG培養(yǎng)基，并于37℃以250rpm培養(yǎng)過夜。使用Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)通過過濾由每種培養(yǎng)物收獲菌絲體，并用10mM Tris/0.1mM EDTA(pH8)(TE)漂洗2次。然后將菌絲體制備物在液氮中快速凍結(jié)，并用研缽和杵磨成細分。將每種粉狀菌絲體制備物轉(zhuǎn)移到50ml管中，并加入20ml裂解緩沖液。向每種制備物中加入RNA酶至終濃度20μg/ml，并將制備物于37℃溫育30分鐘。然后向每種制備物中加入蛋白酶K至終濃度0.1mg/ml，并將制備物于50℃溫育1小時。然后將制備物以15,000xg離心20分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。將每種上清液加到用制造商提供的QBT平衡的Qiagen MAXI柱(Qiagen，Chatsworth，CA)上。然后用30ml制造商提供的QC清洗柱子。用15ml制造商提供的QF由柱子洗脫DNA，然后通過加入0.7倍體積的異丙醇沉淀并以15,000xg離心20分鐘來回收。最后將沉淀用5ml 70％乙醇清洗，空氣干燥，并溶于200μl TE。
取2μg米曲霉DEBY10.3基因組DNA制備物，分別用BalI、HpaI、NarI、NdeI、SphI、和StuI消化。限制性內(nèi)切酶不切割pDSY82，使得能夠分離整合的質(zhì)粒和側(cè)翼基因組DNA。然后將經(jīng)消化的基因組DNA在20μl反應體系中用T4DNA連接酶進行連接。
用每種經(jīng)連接的DNA制備物轉(zhuǎn)化E.coli HB101。然后如下篩選轉(zhuǎn)化體，由轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，限制性消化插入片段以確認它們衍生自pDSY82，并使用Applied Biosystems公司373A型自動測序儀(Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequencer)(Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)，使用引物行走技術(shù)和染料終止物化學法(Giesecke等人，1992，病毒學方法雜志(Journalof Virol.Methods)3847-60)，使用M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)(New England Biolabs，Beverly，MA)，使用對pDSY82特異的引物，在兩條鏈上對插入片段進行測序。
轉(zhuǎn)化體大腸桿菌HB101-pDSY109包含由米曲霉DEBY10.3 SphI回收的基因座。實施例5米曲霉DEBY10.3拯救基因座pDSY109的定性鑒定使用Applied Biosystems公司373A型自動測序儀，使用引物行走技術(shù)和染料終止物化學法，使用M13反向引物(-48)和M13正向引物(-20)，使用對待測序DNA特異的引物，在兩條鏈上對米曲霉DEBY10.3回收基因座pDSY109整合事件兩側(cè)的3.4和2.2kb區(qū)域進行測序。核酸序列說明整合事件發(fā)生于palB基因的開放讀碼框內(nèi)。palB基因編碼涉及pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的半胱氨酸蛋白酶，pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑傳遞環(huán)境pH信號。
使用實施例4中所述方案，分離米曲霉HowB430的基因組DNA。通過首先用Tsp509I部分消化米曲霉HowB430基因組DNA來構(gòu)建米曲霉HowB430基因組文庫。使用制造商推薦的條件，使用4個單位的Tsp509來消化3.5μg米曲霉HowB430基因組DNA。反應于65℃進行，由0-50分鐘間隔5分鐘取樣。將反應液置于冰上，并通過加入EDTA至10mM來終止。然后將這些消化物在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上電泳，并切下含3-9kb DNA的凝膠區(qū)域。然后使用β-瓊脂糖酶I，使用制造商(New England Biolabs，Beverly，MA)提供的方案，由凝膠塊純化DNA。然后按照制造商(Life Technologies公司，Gaithersburg，MO)的指示，于16℃過夜將根據(jù)大小選擇的DNA連接到λZipLox EcoRI臂中。使用Gigapack GoldIII包裝試劑盒(Gigapack GoldIII Packaging Kit)(Stratagene，La Jolla，CA)，按照制造商的指示，包裝并滴定連接產(chǎn)物?？傆?，獲得了8x106個重組噬菌斑，并使用制造商提供的方案擴增文庫。
篩選基因組文庫以獲得palB基因組克隆。如隨λZipLox臂提供的方案中所述，將基因組文庫適當稀釋以獲得7000噬菌斑/150mm平板。使用標準方案(Sambrook等人，1989，見上文)將噬菌斑點到Hybond N+濾膜(Amersham，Cleveland，OH)上。使用UV交聯(lián)固定濾膜，并在DIG Easy Hyb中于42℃預雜交。將濾膜與DIG標記的0.25kb palB探針雜交。使用下列引物經(jīng)PCR擴增探針，這些引物使用Applied Biosystems公司394型DNA/RNA合成儀(AppliedBiosystems Model 394 DNA/RNA Synthesizer)按照制造商的指示合成，并使用Genius試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)用薯蕷皂苷元(dioxygenin)標記5’-CTGCCGTCGAAGGTGTCCAAG-3’(SEQ ID NO5)5’-ATTGTGGCCCCTATGTGGATT-3’(SEQ ID NO6)使用大約0.2μg pDSY109作為模板來制備100μl擴增反應體系。每個反應體系包含下列成份0.2μg質(zhì)粒DNA，48.4pmol正向引物和48.4pmol反向引物，1mM dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，1X Taq聚合酶緩沖液，和2.5U Taq聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。將反應體系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中溫育，編程如下95℃5min，1個循環(huán)；95℃1min，55℃1min，72℃2min，30個循環(huán)。
清洗濾膜，并使用隨Genius試劑盒提供的方案進行后雜交。鑒定了幾個陽性噬菌斑，并使用標準方案(Sambrook等人，1989，見上文)純化至均一。
按照實施例1中所述方法測定了一個palB克隆的核苷酸序列。
圖1顯示了核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推導的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。palB基因編碼4700bp的開放讀碼框，該讀碼框編碼854個氨基酸的多肽。開放讀碼框由3個內(nèi)含子中斷。
使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比對參數(shù)，進行了palB氨基酸序列的比較性比對缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，框＝5，對角線＝5。
比較性比對顯示米曲霉PalB蛋白(SEQ ID NO2)與構(gòu)巢曲霉PalB蛋白(Denison等人，1995，見上文)具有66.4％的同一性。
如上所述制備了經(jīng)BalII消化的米曲霉DEBY10.3和米曲霉HowB101基因組DNA的Southern印跡。用DIG標記的0.25kb palB探針探查印跡以確認回收的側(cè)翼DNA是米曲霉DEBY10.3中分裂的基因。
來自米曲霉HowB101的大約7.5kb BalII條帶與探針雜交，同時來自米曲霉DEBY10.3的12kb條帶也與探針雜交。大小差異符合整合一個質(zhì)?？截惖念A期大小，從而確認了回收基因座在米曲霉DEBY10.3中分裂。
由于預測米曲霉DEBY10.3中的整合事件將導致PalB蛋白失去功能，因此測試在pH8.0和pH6.5培養(yǎng)米曲霉DEBY10.3。構(gòu)巢曲霉palB-菌株不能在pH8.0生長，但是能夠在pH6.5生長。在添加10mM尿苷的基本培養(yǎng)基中，在pH8.0和pH6.5培養(yǎng)米曲霉HowB430和米曲霉DEBY10.3。正如預測的，米曲霉DEBY10.3不能在pH8.0生長。實施例6pMT1936的構(gòu)建使用在Applied Biosystems公司394型DNA/RNA合成儀上按照制造商的指示合成的下列引物，構(gòu)建了包含palB分裂盒的pTM1936100752 5’-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3’(SEO ID NO7)100753 5’-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3’(SEQ ID NO8)100754 5’-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3’(SEQ ID NO9)100755 5’-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3’(SEQ ID NO10)由按照實施例4中所述方案制備的米曲霉A1560(Christensen等人，1988，生物技術(shù)(Bio/Technology)61419-1422)的基因組DNA經(jīng)PCR擴增米曲霉palB 5’側(cè)翼序列和編碼palB產(chǎn)物N端部分的序列。使用了大約0.5μg基因組DNA和兩種引物100754和100755各5pmol。使用聚合酶Pwo，如制造商(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)所述進行擴增。擴增進行了40個循環(huán)。將部分反應產(chǎn)物進行酚抽，乙醇沉淀，EcoRI和XhoI消化，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離了大約1.05kb的片段。
如上所述該用引物100752和100753獲得了米曲霉palB 3’側(cè)翼序列和編碼palB基因產(chǎn)物C端部分的序列，并用XhoI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，然后進行凝膠電泳回收了大約1.5kb的片段。
將上述兩種經(jīng)消化和純化的PCR片段與來自載體pJaL400(圖2)的經(jīng)純化2.7kb EcoRI-XbaI片段一起進行三片段連接，產(chǎn)生pMT1935(圖3)。pMT1935的palB 5’和3’側(cè)翼由經(jīng)PCR引物100754和100753導入的BssHII、SpeI、和XhoI位點分開。
將在PyrG側(cè)翼含重復片段的pJaL394(圖4)的3.5kb HindIII片段克隆到將HindIII切割、去磷酸化、并純化的pBluescriptII SK(-)中。獲得了包含兩種取向的插入片段質(zhì)粒。選擇了一種質(zhì)粒pMT1931(圖5)，其中pBluescript多接頭的SpeI位點位于pyrG基因的下游，XhoI位點位于pyrG基因的上游。以3.5kb SpeI-XhoI片段分離PyrG基因，并插入經(jīng)SpeI和XhoI消化并純化的pMT1935，產(chǎn)生分裂質(zhì)粒pMT1936(圖6)。
可以由pMT1936以6.2kb NotI片段(切割多接頭中的NotI)或5.5kb AseI-PvuI片段(切割實際的palB 5’和3’側(cè)翼序列內(nèi)的AseI和PvuI)分離pyrG可選擇palB分裂盒。實施例7用來自pMT1936的AseI/PvuI palB分裂盒轉(zhuǎn)化米曲霉使用實施例1中所述相同轉(zhuǎn)化方案，用由pMT1936獲得的5.5kbAseI-PvuI片段轉(zhuǎn)化米曲霉HowB430。通過用AseI和PvuI消化pMT1936并使用Qia快速凝膠提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的指示在1％瓊脂糖凝膠上分離片段，由此分離用于轉(zhuǎn)化的線性片段。然后測試轉(zhuǎn)化體在pH6.5或pH8.0的基本培養(yǎng)基平板上的生長。
結(jié)果顯示測試的128個轉(zhuǎn)化體中13個擁有palB-表型，表現(xiàn)為不能在pH8.0生長。將13種palB-菌株和13種能夠在pH8.0生長的轉(zhuǎn)化體進行孢子純化。
對來自米曲霉palB-突變體、米曲霉palB+菌株、和米曲霉HowB430的基因組DNA進行Southern印跡，以確認AsnI-PvuI轉(zhuǎn)化DNA片段作為清除取代而整合到palB基因座中。按照實施例4中所述步驟制備基因組DNA，用PvuI消化，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。使用0.4NNaOH和毛細管作用將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+濾膜上。將印跡UV交聯(lián)，然后于65℃在Rapid Hyb中預雜交。然后用含來自pMT1936的0.9kb AsnI-SpeI片段的探針探查印跡。在1％瓊脂糖凝膠上電泳后，使用Qia快速旋轉(zhuǎn)柱(QiaQuick spin column)分離0.9kb片段。使用隨機引發(fā)標記試劑盒Vistra ECF Random Prime Labeling Kit標記片段。將印跡預雜交，并于65℃在Rapid Hyb(Amersham，Cleverland，OH)中雜交，然后在2X SSC/0.1％SDS中于65℃5min清洗2次，在0.2X SSC/0.1％SDS中于65℃ 10min清洗2次。清洗后，使用信號放大試劑盒Vistra ECF Signal Amplification Kit(Amersham，Cleveland，OH)和成像系統(tǒng)STORM860 Imaging System(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)檢測印跡。
Southern印跡結(jié)果證明了探針與來自米曲霉HowB430的6kb條帶雜交。預計清楚的分裂(片段)將與大約8kb PvuI條帶雜交。Southern印跡結(jié)果還顯示了一些palB-菌株具有清楚分裂(片段)，而其它菌株則沒有。實施例8米曲霉ΔpalB菌株的細胞外蛋白酶生成將實施例7中所述3種米曲霉palB-和3種米曲霉palB+菌株，在裝有培養(yǎng)基(Nutriose、酵母提取物、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸、K2SO4、CaCl2·H2O、和微量金屬溶液)的2升發(fā)酵罐中于34℃、pH7、1000-2000rpm培養(yǎng)8天。每天對細胞外培養(yǎng)液取樣，并在第6天使用下文所述FTC-酪蛋白測驗法對樣品測驗總細胞外蛋白酶活性。
FTC-酪蛋白測驗法如下進行。向10μl用0.1M MOPS緩沖液(pH7.0)適當稀釋的酶溶液中加入40μl與0.1M MOPS緩沖液(pH7.0)1∶1混和的FTC-酪蛋白(Twining，1984，分析生化(AnalyticalBiochemistry)14330-34)啟始反應。將反應體系于37℃溫育2小時，隨后用150μl 5％三氯乙酸猝滅反應。猝滅反應在5℃下置2小時然后離心10分鐘。將20ul上清液轉(zhuǎn)移到裝有2ml 0.5M硼酸鹽緩沖液(pH9.0)的試管中并混和。然后將該溶液的200μl樣品轉(zhuǎn)移到黑色U形底96孔板(Dynatech公司，Chantiily，VA)中，將硼酸鹽緩沖液用作空白將儀器標零。使用Fluorolite 1000儀器(Dynatech公司，Chantiily，VA)使用參照設置1176的頻道3和4.1V燈泡電壓，測量熒光。儀器的動態(tài)范圍處于0-4000熒光單位之間，最佳“孔與孔”重復性處于400-3500單位之間。
表2中顯示的結(jié)果指出米曲霉palB-菌株產(chǎn)生的細胞外蛋白酶比米曲霉palB+菌株平均低10倍。還在存在絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF或金屬蛋白酶抑制劑1，10-鄰二氮雜菲時進行測驗。表2中顯示了由所示抑制劑抑制的總蛋白酶活性百分比。米曲霉palB+和palB-樣品的抑制模式相似，說明palB刪除影響絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的生成。表2.palB-和野生型菌株中的細胞外蛋白酶水平菌株 蛋白酶熒光單位+ ％PMSF抑制**％1，10-鄰二氮雜菲抑制**DEBY10.3palB-1120 734DEBY10.3palB-1370 7715DEBY10.3palB-810 693DEBY10.3palB+111008737DEBY10.3palB+9785 8334DEBY10.3palB+130508437+于37℃和pH7溫育2小時。**抑制劑濃度為1mM。
如上所述還將其它3種米曲霉palB-和其它3種米曲霉palB+菌株在2升發(fā)酵罐中培養(yǎng)8天，并每天進行細胞外取樣。在第6天使用上述FTC-酪蛋白測驗法在存在或不存在抑制劑時測驗樣品。
表3中顯示的結(jié)果指出米曲霉palB-菌株產(chǎn)生的總蛋白酶活性比米曲霉palB+菌株平均低10倍。表3.米曲霉palB-和野生型菌株中的細胞外蛋白酶水平菌株 蛋白酶熒光單位+ ％PMSF抑制**％1，10-鄰二氮雜菲抑制**DEBY10.3palB-485 77 35DEBY10.3palB-345 48 0DEBY10.3palB-540 52 0DEBY10.3palB+4580 92 23HowB430palB+5025 86 39HowB430palB+3765 77 37+于37℃和pH7溫育1小時。**抑制劑濃度為1mM。
如上所述還將2種米曲霉palB-菌株和1種米曲霉palB+菌株在2升發(fā)酵罐中培養(yǎng)8天。米曲霉palB-菌株是palB基因的清楚分裂。8天每天進行細胞外取樣。在第6天使用上述FTC-酪蛋白測驗法在存在或不存在抑制劑時測驗樣品。結(jié)果顯示于下文表4。米曲霉palB-菌株產(chǎn)生的細胞外蛋白酶活性比米曲霉palB+菌株平均低20倍。表4.米曲霉palB-和野生型菌株中的細胞外蛋白酶水平菌株 蛋白酶熒光單位+ ％PMSF抑制**％1，10-鄰二氮雜菲抑制**DEBY10.3palB-1095 35 0HowB430ΔpalB76-11-1 715 44 3.5HowB430ΔpalB76-11-1 16360 91 36pLRF2-10(palB+)+于37℃和pH7溫育2小時。**抑制劑濃度為1mM。實施例9構(gòu)巢曲霉palA基因的PCR擴增由如實施例4中所述制備的基因組DNA，使用PCR和下列引物，擴增來自構(gòu)巢曲霉的palA基因。palA2540R5’-TCGCGCAGTCGTGATTCAAAG-3’(SEQ ID NO11)pal1725’-CCGCACTGGAGTAAATAACAT-3’(SEQ ID NO11)反應體系包含50ng構(gòu)巢曲霉基因組DNA、palA2540R和palA172各50pmol、Perkin Elmer PCR緩沖液、1mM dNTP、和0.5U Taq DNA聚合酶。將反應體系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中循環(huán)，編程如下95℃3min，1個循環(huán)；95℃1min，50℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5min，1個循環(huán)。取一部分反應液在瓊脂糖凝膠上電泳，并獲得了大約2.5kb的預期產(chǎn)物。將一半反應液在制備性凝膠上電泳，切下含想要的產(chǎn)物的凝膠塊，并使用Qia快速凝膠提取試劑盒由凝膠分離DNA。
使用引發(fā)試劑盒Prime-It Kit(Stratagene，La J0lla，CA)按照制造商的指示，用32P-dCTP標記1/10的凝膠分離PCR產(chǎn)物。在TEMidi G-50柱(5’至3’，Boulder，CO)上進行標記反應后，純化palA探針。實施例10用構(gòu)巢曲霉palA探針進行米曲霉基因組DNA的Southern分析將如實施例4中所述制備的米曲霉HowB430的基因組DNA用BamHI、EcoRI、或HindIII消化，并在瓊脂糖凝膠上電泳。如實施例7中所述，在堿性條件下，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+濾膜上。將相同3個印跡在低度、中度、和高度嚴謹度雜交緩沖液中于42℃雜交1小時(預雜交和雜交在5X SSPE/0.3％SDS/200μg/ml剪斷并變性鮭魚精DNA中進行，低度、中度、和高度及很高嚴謹度分別含25、35、或50％甲酰胺)。加入實施例10中所述32P-dCTP標記的palA探針，并將印跡于4℃雜交過夜。將印跡于42℃在2X SSC/0.1％SDS中5min清洗2次，在0.2X SSC/0.1％SDS中10min清洗2次。在中度和低度嚴謹度緩沖液中雜交的印跡上觀察到特異性條帶。實施例11palA米曲霉基因組克隆的分離按照制造商的指示在λZipLox中構(gòu)建米曲霉HowB425的基因組文庫。文庫含有630,000個噬菌斑形成單位，其中73％含有插入片段。平均插入片段大小為3.5kb。將大約7000個重組噬菌體與大腸桿菌Y1090(Life Technologies，Gaithersburg，MD)一起涂布在NZY大平板上。使用標準方案將噬菌斑點到Hybond N+濾膜上。將濾膜UV交聯(lián)，并如實施例10中所述于42℃在中等嚴謹度雜交緩沖液中預雜交1小時。加入32P標記的構(gòu)巢曲霉palA探針，并將濾膜于42℃雜交過夜。如上所述清洗濾膜并使X-射線膠片暴光。
獲得了2個陽性克隆。挑取陽性噬菌斑并在1ml SM緩沖液中洗脫。將洗脫液稀釋104，并取50或100μl與大腸桿菌Y1090細胞一起涂布在NZY大平板上。如前點取噬菌斑并處理濾膜。由每個平板分離一個純化陽性噬菌斑。通過依照提供的方案(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)與大腸桿菌DH10B細胞一起涂布，由陽性克隆切下質(zhì)粒DNA。實施例12palA米曲霉基因組克隆的分析使用Qia快速制備試劑盒Qiaquick Prep8 Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)由實施例11中所述2個陽性克隆(palA5A和palA6A)分離質(zhì)粒DNA。用PstI消化質(zhì)粒DNA以確認它們包含插入片段。使用應用生物系統(tǒng)377 XL型自動DNA測序儀(APPliedBiosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer)，使用M13正向和反向引物，進行基因組克隆的部分核苷酸測序。部分測序確認了克隆包含米曲霉palA同源物。測定了最大克隆palA5A的核苷酸序列。使用應用生物系統(tǒng)377XL型自動DNA測序儀，使用染料終止物化學法，進行DNA測序。使用轉(zhuǎn)座子插入策略(引物島轉(zhuǎn)座試劑盒Primer Island Transposition Kit，Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)產(chǎn)生了重疊群序列。經(jīng)測序，palA5A的2.9kb插入片段的平均度為5.3。
palA5A克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO3)證明分離了palA的部分克隆，根據(jù)與構(gòu)巢曲霉palB基因(Negrete-Urtasun等人，1997，見上文)的同源性，缺失編碼palA最后大約245個氨基酸的DNA。部分核苷酸序列(SEQ ID NO3)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO4)顯示于圖7。palA基因編碼2855bp的開放讀碼框，該讀碼框編碼549個氨基酸的多肽。開放讀碼框由4個內(nèi)含子中斷，它們的定位在構(gòu)巢曲霉和米曲霉克隆之間是嚴格保守的。
使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比對參數(shù)，進行了部分米曲霉PalA推導氨基酸序列與其它PalA氨基酸序列的比較性比對缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，框＝5，對角線＝5。
比較性比對顯示部分米曲霉PalA蛋白(SEQ ID NO2)與構(gòu)巢曲霉PalA蛋白(Negrete-Urtasun等人，1997，見上文)具有88％的同一性。實施例13米曲霉菌株中palA的刪除構(gòu)建用pyrG基因取代600bp palA開放讀碼框的質(zhì)粒pBM8。
使用應用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀(Applied BiosystermsModel 394 DNA/RNA Synthesizer)，按照制造商的指示，合成了設計用于PCR擴增兩種分開的palA片段的下列合成寡核苷酸引物。第一組包括設計用于加入XhoI位點的5’引物和用于加入HindIII位點的3’引物。第一組引物9801635’-AGTAGCCGTCTATCTCTCCAGCAGTAGTGT-3’(SEQ ID NO13)引物9801645’-AAGCTTACTCGCAATTAGCCTTCTCGGTGAATCG-3’(SEQ ID NO14)第二組包括設計用于加入HindIII位點的5’引物和用于加入NotI位點的3’引物。第二組引物9801655’-AAGCTTTACGATGTCATGCTGGGCAACGGTCAAG-3’(SEQ ID NO15)引物9801665’-GCGGCCGCCTCTGCGTGATACTCTAGGGTCTGG-3’(SEQ ID NO16)粗體字母表示編碼序列。
建立100μl的PCR反應體系，包括50ng palA5A DNA模板、各種引物各50pmol、1X PCR緩沖液含2mM MgSO4(BoehringerMannheim)、1mM dNTP、和2.5單位Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim)。將反應體系在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中循環(huán)，編程如下95℃5min，1個循環(huán)；95℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30個循環(huán)；95℃1min，55℃1min，72℃3min，1個循環(huán)。
取10μl PCR反應體系在1.0％瓊脂糖凝膠上于100伏電泳1小時。由凝膠切下第一組引物大約1100bp的主要產(chǎn)物和第二組引物大約730bp的主要產(chǎn)物，并使用Qia快速凝膠提取試劑盒(Qiaquick GelExtraction Kit)純化。隨后按照制造商的指示，將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO(Invitrogen，San Diego，CA)中，并轉(zhuǎn)化TOP10細胞(Invitrogen，San Diego，CA)。
獲得了2個克隆，1100bp插入片段的命名為大腸桿菌pPalA1，730bp插入片段的命名為大腸桿菌pPalA2。使用Perkin-Elmer應用生物系統(tǒng)377XL型測序儀(Perkin-Elmer APPlied Biosystems Model 377Sequencer XL)，使用染料終止物化學法，使用lac正向測序引物和lac反向測序引物，通過測序來分析這兩個克隆。
用HindIII消化pBluescript KS-，并用Klenow片段處理產(chǎn)生平末端。將DNA在制備性凝膠上電泳，并切下含經(jīng)切割質(zhì)粒DNA的條帶。使用Qia快速凝膠提取試劑盒由凝膠分離DNA。然后將質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并由幾個菌落分離質(zhì)粒DNA。通過HindIII限制性消化對克隆篩選HindIII位點的缺失。將缺失HindIII位點的一個克隆命名為pBM1a(圖8)。使用Qiaquick Prep8方案(Qiagen，Chatsworth，CA)由pBM1a制備質(zhì)粒DNA。用0.5μl XhoI和NotI(每種10U/μl)消化pBM1a。用0.5μl XhoI和HindIII(每種10U/μl)消化pPalA1。用0.5μl NotI和HindIII(每種10U/μl)消化pPalA2。將經(jīng)消化DNA在1％瓊脂糖凝膠上于100伏電泳1小時。由凝膠切下pPalA1的1100bp片段、pPalA2的730bp片段、和pBM1a的2.9kb片段，并重懸于200μl 10mM Tris(pH7.5)。隨后將三種DNA片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pBM7(圖9)。
用1μl HindIII(10U/μl)消化來自pJal394的DNA。將經(jīng)消化DNA在0.7％瓊脂糖凝膠上于100伏電泳1小時，產(chǎn)生3539bp條帶。由凝膠切下3539bp片段，并重懸于200μl 10mM Tris(pH7.5)。
用1μl HindIII(10U/μl)消化來自pBM7的DNA。將HindIII于65℃熱滅活10分鐘，隨后使用蝦堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim，Indinopolis，IN)按照制造商的指示去磷酸化。將經(jīng)消化DNA在0.7％瓊脂糖凝膠上于100伏電泳1小時，產(chǎn)生3630bp條帶。由凝膠切下3630bp片段，并重懸于300μl 10mM Tris(pH7.5)。將兩種DNA片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。產(chǎn)生的克隆命名為pBM8(
圖10)。
為了分離pBM8的刪除片段，用NotI和XhoI消化質(zhì)粒，并將消化物在制備性凝膠上電泳。使用Qia快速凝膠提取試劑盒由凝膠分離5.3kb刪除片段。用片段轉(zhuǎn)化如實施例1中所述制備米曲霉HowB430原生質(zhì)體，并在基本培養(yǎng)基平板上選擇。總計獲得了93個轉(zhuǎn)化體。在pH8.0的基本培養(yǎng)基平板上測試轉(zhuǎn)化體的pal-表型。93個中的3個不能在pH8.0生長。Southern分析確認了3個菌株為清楚分裂。實施例14米曲霉ΔpalA菌株中的細胞外蛋白酶生成將實施例13中所述2株米曲霉palA+和2株米曲霉palA-菌株如實施例8中所述在2升發(fā)酵罐中于34℃培養(yǎng)8天。使用實施例8中所述FTC-酪蛋白測驗法測定第6天樣品的總細胞外蛋白酶活性。
下文表5中所示結(jié)果證明米曲霉palA-菌株產(chǎn)生的細胞外蛋白酶水平是米曲霉palA+菌株的大約1/10。表5.HowB430 ΔpalA菌株和細胞外蛋白酶菌株蛋白酶熒光單位DEBY599.3(wt) 7450ΔpalA1-3 710palA6-1(wt) 5150ΔpalA7-1 565生物材料的保藏下列生物學材料已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)，北方地區(qū)研究中心(Northern Regional Research Center)，Peoria，伊利諾斯州(Illinois)，保藏號如下保藏物 編號 保藏日期大腸桿菌HB101 pDSY109 NRRL B-21623 1996年9月5日大腸桿菌XL-1Blue pDSY174 NRRL B-30089 1999年1月28日這些菌株已經(jīng)進行了保藏，在該專利申請的待審期內(nèi)，保證根據(jù)37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122授權(quán)的專利和商標委員會所確定的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物代表了保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本或其后續(xù)申請的國家中，可以按照該國專利法的要求提供該保藏物。但是，應當明白保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對以侵犯由政府行為授予的專利權(quán)來實施本發(fā)明的許可。
由于此處公開的特殊實施方案意欲作為此處描述和要求的發(fā)明的多個方面的例示，所以本發(fā)明并非限制在這些實施方案的范圍之內(nèi)。任何相當?shù)膶嵤┓桨妇鶎儆诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。甚至于本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述描述顯然能夠理解本發(fā)明除了此處所示和所述之外的各種變化。這些變化也屬于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。當發(fā)生沖突時，以本說明書包括定義為準。
此處引用的多處參考文獻完整引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，包括a)培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中突變細胞包含兩種核酸序列，第一種核酸序列包含pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的一種或多種基因的修飾，第二種核酸序列編碼多肽；和b)由培養(yǎng)液分離多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的一種或多種基因選自palA、palB、palC、palF、PalH、和palI；及其同源物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中基因是palA基因。
4.權(quán)利要求1的方法，其中基因是palB基因。
5.權(quán)利要求1的方法，其中基因是palC基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中基因是palF基因。
7.權(quán)利要求1的方法，其中基因是palI基因。
8.權(quán)利要求1的方法，其中多肽對于真菌細胞是天然的或異源的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中真菌細胞是絲狀真菌細胞或酵母細胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中絲狀真菌細胞是頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球酵母屬、線黑粉菌屬、鐮孢屬、赤霉屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、漆斑菌屬、Neocallimastix、脈孢霉屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium、或木霉屬的細胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中酵母細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或Yarrowia屬的細胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中在相同條件下培養(yǎng)時突變體產(chǎn)生的一種或多種蛋白酶的量比親本真菌細胞少。
13.權(quán)利要求12的方法，其中一種或多種蛋白酶是一種外肽酶或一種內(nèi)肽酶。
14.權(quán)利要求12的方法，其中一種或多種蛋白酶是一種外肽酶和一種內(nèi)肽酶。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中外肽酶或內(nèi)肽酶是絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶。
16.權(quán)利要求12-15任一項的方法，其中當在相同條件下培養(yǎng)時突變細胞產(chǎn)生的一種或多種蛋白酶比親本真菌細胞至少少大約25％。
17.權(quán)利要求12-16任一項的方法，其中突變真菌細胞不產(chǎn)生蛋白酶。
18.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中突變真菌細胞包含至少兩個拷貝的第二種核酸序列。
19.權(quán)利要求1-18任一項的方法，其中多肽是激素、激素變體、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分、或報道基因。
20.權(quán)利要求19的方法，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
21.權(quán)利要求20的方法，其中酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
22.權(quán)利要求1-21任一項的方法，其中突變細胞還包含一種或多種pacC基因的兩個或多個拷貝。
23.權(quán)利要求1-22任一項的方法，其中突變細胞還包含一種或多種第三種核酸序列的一種或多種修飾，其中修飾降低或消除了一種或多種第三種核酸序列的表達。
24.權(quán)利要求23的方法，其中第三種核酸序列編碼的酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
25.由權(quán)利要求1-24任一項的方法生產(chǎn)的多肽。
26.一種真菌細胞的蛋白酶缺陷型突變體，包含兩種核酸序列，第一種核酸序列包含pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的一種或多種基因的修飾，第二種核酸序列編碼多肽，其中在相同條件下培養(yǎng)時突變細胞產(chǎn)生的一種或多種蛋白酶的量比親本真菌細胞少。
27.權(quán)利要求26的突變細胞，其中多肽相對于突變細胞是天然的或異源的。
28.一種包含核酸序列SEQ ID NO.3的分離的核酸序列。
29.權(quán)利要求28的核酸序列，該核酸序列包含于大腸桿菌NRRL B-30089所含質(zhì)粒pDSY174中。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)多肽的方法,包括(a)在適合于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體,其中突變細胞包含兩種核酸序列,第一種核酸序列包含pacC pH信號轉(zhuǎn)導途徑的一種或多種基因或其同源物的修飾,第二種核酸序列編碼多肽;和(b)由培養(yǎng)液分離多肽。
文檔編號C12N9/62GK1342204SQ00804506
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月2日
發(fā)明者D·S·雅弗爾 申請人:諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司