專利名稱：非核糖體肽合成酶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)經(jīng)修飾的非核糖體肽合成酶(NRPS)的方法，及該酶在生產(chǎn)天然或經(jīng)加工的肽和蛋白原中的用途。
非核糖體肽合成酶(NRPS或肽合成酶)是“模塊化(modular)”酶，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和重要的生物學(xué)功能。制藥和生物技術(shù)上感興趣的大量的肽，尤其是例如生物表面活性劑、鐵載體、抗體、細(xì)胞抑制劑、免疫抑制劑及抗腫瘤劑，都是通過大的酶復(fù)合物“NRPS”進(jìn)行生物合成的(Marahiel等(1997)，Chem.Rev.97第2651-2673頁)。此外還包括已知的藥物，如環(huán)孢菌素A和萬古霉素。由于“NRPS”結(jié)構(gòu)多種多樣，使得由此產(chǎn)生的生物活性肽也是多種多樣。除了20種蛋白質(zhì)氨基酸外，NRPS還常形成特殊的殘基，例如α-羥基氨基酸或非蛋白質(zhì)氨基酸。各個殘基由肽鍵或通過形成酯或內(nèi)酯相互連接起來。通過N-甲基化或形成雜環(huán)或者差向異構(gòu)化使這些殘基進(jìn)一步被修飾。許多由天然NRPS合成的多肽都通過肽鍵或酯鍵進(jìn)一步環(huán)化。一般來說，NRPS在合成復(fù)雜的肽類生物化合物的過程中起重要作用。
人們已發(fā)現(xiàn)，多功能的蛋白模板基本上是以一種“模塊”化的方式構(gòu)成的?！澳K(modular)”是指催化單元，它使得特定的氨基酸摻入至產(chǎn)物(肽)中(Marahiel等(1997)，Chem.Rev.97第.2651-2673頁)。
各單獨的模塊由“域”組成，所述域在每一種情況下負(fù)責(zé)一個特定的反應(yīng)。腺苷?；?adenylation)域(A域)決定底物進(jìn)入肽，因為A域可選擇底物，并使其腺苷?；龅孜锿ǔ榘被?。被活化的氨基酸再通過硫酯鍵與一個輔因子相連接，該輔因子是硫醇化作用域(T域)中的4’-磷酸泛酰巰基乙胺。從而，氨酰基和肽基縮合成相鄰的環(huán)化模塊，該反應(yīng)由縮合域(C域)催化。這三個域即C，A及T域。形成了多模塊的(mutimodular)NRPS的基本單元。最后一個NRPS模塊通常含有一個終止域(Te域)，該域負(fù)責(zé)釋放合成產(chǎn)物。NRPS中模塊的次序決定了肽的結(jié)構(gòu)。
在被修飾的氨基酸摻入處，修飾域摻入到適當(dāng)?shù)哪K中。
EP0789078 A2中僅指出可通過域的改變來改變已知化合物，其中僅從技術(shù)角度說明了關(guān)于控制肽鏈終止的原理。
具體說來，例如伴隨ATP的水解，腺苷?；蜃R別并活化關(guān)連底物氨基酸，成為酶聯(lián)氨酰腺苷酸。然后這些相對不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物通過將共價連接于硫醇化域的4’-磷酸泛酰巰基乙胺輔因子(4-PAN)轉(zhuǎn)移到硫醇基團(tuán)上而得以穩(wěn)定。在縮合(C)域的參與下，以此方式被活化的氨基酸的轉(zhuǎn)肽作用依次進(jìn)行，從而使鏈不斷生長，直到肽產(chǎn)物形成為止。所摻入的單體的修飾(例如差向異構(gòu)化，N-甲基化)或肽主鏈的修飾(如?；蚱咸腔?能夠進(jìn)一步改變所形成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。這種功能化由NRPS主體中特定的域或多聚乙酰合成酶模塊來催化。
已證明，A域通過其底物特異性和在某一特定NRPS系統(tǒng)中的相對次序來決定所形成非核糖體肽的一級結(jié)構(gòu)(序列)。搞清腺苷酸形成酶超家族中兩個成員的晶體結(jié)構(gòu)，表明盡管就其一級結(jié)構(gòu)來說僅有16％的同一性，但這兩種酶具有明確的同源折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。上述兩種腺苷酸形成酶超家族成員為，來自Photinus pyralis的螢光素酶(Conti等，1996，結(jié)構(gòu)(Structure)4287-298)和來自短小芽孢桿菌(Bacillus brevis)的短桿菌肽S合成酶1的A域(以下以PHeA表示)(Conti等，1997，EMBO J.164174-4183)。在底物ATP和苯丙氨酸存在時測定的PheA(圖1A)的結(jié)構(gòu)允許人們首次對底物識別和底物活化的分子機(jī)制進(jìn)行研究。
NRPS A域的序列比較結(jié)果證明，其中存在高度保守的序列區(qū)域，即“核心基元”，它在A域內(nèi)的位點及氨基酸序列幾乎不變。先前的突變分析和現(xiàn)在PheA的晶體結(jié)構(gòu)表明絕大多數(shù)的所述核心序列本質(zhì)上都參與ATP結(jié)合及ATP水解。此外一些核心基元還有與底物氨基酸結(jié)合的功能。例如，PheA中的底物L(fēng)-苯丙氨酸的α-氨基和α-羧基分別與235位的天冬氨酸(核心A4)和517位的賴氨酸(核心A10)形成靜電配位(Marahiel等1997，Chem.Rev.97第2651-2673頁)。實際介導(dǎo)底物特異性的PheA區(qū)域位于約100個氨基酸長的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域在A域群體中保守性較低。這一區(qū)域形成底物苯丙氨酸側(cè)鏈的結(jié)合口袋(圖1B)，口袋的一側(cè)由第236位的丙氨酸殘基、第330位的異亮氨酸殘基、和第331位的半胱氨酸殘基組成，另一側(cè)由第332位的丙氨酸殘基、第301位的丙氨酸殘基、第299位的異亮氨酸殘基和第278位的蘇氨酸殘基組成。兩側(cè)被位于口袋底部的第239位色氨酸殘基的吲哚環(huán)所分隔開。
通過先前對NRPS A域的計算機(jī)模擬研究(計算機(jī)模擬)可能說明A域的底物特異性決定區(qū)估計位于核心基元A3和A6之間。這一區(qū)域相對保守性較低，但就相同底物特異性的域而言，估計其同源關(guān)系應(yīng)增高。據(jù)此，活化相同底物的域在進(jìn)化樹中應(yīng)成組出現(xiàn)。但詳細(xì)分析不能證明這種相互關(guān)系。相反，顯然，A域的進(jìn)化起源(宿主生物)較它們的底物特異性對它們的聚類具有更大的影響。
為得到共有序列，通過與PheA和螢光素酶進(jìn)行序列比較，我們確定了從公共序列數(shù)據(jù)庫中可獲得的160個A域中推測的結(jié)合口袋的相應(yīng)10個殘基。對于每個A域僅使用上述10個氨基酸殘基作為獨立的氨基酸序列，以便用Laser Gene MegAlign程序(獲自例如GATC，GmbH，F(xiàn)ritz-Arnold Str.23，D-78467 Konstanz，德國)進(jìn)行對比和系統(tǒng)發(fā)生研究。通過以上研究，得到了一個系統(tǒng)發(fā)生家族樹(圖2)，其中按照其起源域的特異性出現(xiàn)了10個氨基酸長度序列的族。這一研究結(jié)果清楚地證明了所選擇的氨基酸殘基的確參與底物識別。根據(jù)這些研究結(jié)果，就可能對推測和所觀察到的A域底物特異性之間的差異作出解釋，并且推測NRPS系統(tǒng)的特異性。
本發(fā)明的目的在于，提供一種修飾A域的方法，以便提供并生產(chǎn)經(jīng)適當(dāng)修飾的用于生產(chǎn)新肽的非核糖體肽合成酶。本發(fā)明允許以特異的方式生產(chǎn)所期望的非核糖體肽。
出乎意料的是，基于系統(tǒng)發(fā)生的研究結(jié)果，能得到共有序列，該序列可理解為NRPS的非核糖體密碼(表1)。與核糖體密碼類似，該密碼是簡并的(冗余的)，例如，迄今可鑒定出四種不同的亮氨酸活化域的密碼，三種纈氨酸活化域的密碼，和兩種半胱氨酸活化域的密碼。由此可以設(shè)想，對于其他底物，也有大量的底物識別策略存在，這可由本發(fā)明所述方法確定。
因此，本發(fā)明還涉及列于表1中的編碼非核糖體多肽的非核糖體密碼。
基于由序列比較確定的“密碼子”，可以推測底物結(jié)合口袋的一般形狀，在圖3中作為實例，對底物氨基酸天冬氨酸、鳥氨酸和纈氨酸推測的結(jié)合口袋進(jìn)行了描述。雖然在所有A域中，第235位的天冬氨酸和517位的賴氨酸介導(dǎo)與底物氨基、羧基基團(tuán)的關(guān)鍵相互作用，并因此高度保守，其余的殘基則在很大程度上決定特定氨基酸側(cè)鏈的特異性。所述3個實例中相應(yīng)的殘基(第236位到331位)支持了這一理論，并很好地反映出關(guān)于被活化底物極性和大小的要求。(1)天冬氨酸活化(‘天冬氨酸’密碼子)堿性的第322位組氨酸殘基(可能還包括第278位的賴氨酸)確定了與酸性側(cè)鏈的極性相互作用，而236位的亮氨酸殘基則為長側(cè)鏈底物(如谷氨酸)的攝入鎖住結(jié)合口袋。(2)鳥氨酸活化(‘鳥氨酸(2)’密碼子)酸性的第278位的谷氨酸和第331位的天冬氨酸似乎在識別大的堿性側(cè)鏈中起關(guān)鍵作用。(3)纈氨酸活化(‘纈氨酸(3)’密碼)完整的結(jié)合口袋由疏水殘基構(gòu)成。考慮到由于β位分枝需要相對大的空間，則(1)上部用小的側(cè)面基團(tuán)，且(2)下部用較大的殘基，這樣將擴(kuò)展結(jié)合口袋。
除了簡并性，就出現(xiàn)可變(擺動樣)位點而言，非核糖體密碼與核糖體密碼有進(jìn)一步的同質(zhì)性。如表1所示，擺動樣殘基位于278，299，331位，這些殘基在特定的密碼子中具有更大的可變性。一般的觀察是，識別相對小的氨基酸的結(jié)合口袋在靠近結(jié)合口袋底部的部位有更高的可變性，而對于識別大的底物的結(jié)合口袋，其頂部具有更大的可變性(見表1)。
計算機(jī)模擬研究結(jié)果表明結(jié)合口袋的各個組分對特定底物的特異性的形成有不同的重要性，該結(jié)果匯總于圖3和表1中。為確證這一觀察結(jié)果，更加詳細(xì)地研究了160個結(jié)合口袋的殘基。圖4和表2所顯示的研究結(jié)果表明結(jié)合口袋的10個組分可以分成3組。它們不均等的可變性或許反映它們在介導(dǎo)底物特異性方面不同的重要性(1)‘不變’位點(第235位和517位)僅僅在活化不帶有α-氨基的底物的A域中缺少第235的天冬氨酸。例如AcvA合成酶的α-氨基己二酸活化域或腸桿菌(大腸桿菌)和耶爾森氏桿菌(Yersiniabactin)體系(鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis))中的羧酸活化域。與此相反，第517位的賴氨酸是絕對不變的，它結(jié)合關(guān)連氨基酸的α-羧基和ATP/AMP核糖單元的04’和05’位，結(jié)果，預(yù)計兩底物均進(jìn)入最佳相互作用的位置。因此這兩個殘基介導(dǎo)與底物中(基本上)不變的α-氨基和α-羧基之間重要的相互作用，這也可以解釋它們自身的不變性。(2)‘部分變化’位點(第236位、第301位和第330位)這些殘基在所有已研究的域中僅表現(xiàn)出低的可變性，93％的情況下在這些位點形成疏水氨基酸。就這些位點的低可變性和帶電及極性側(cè)鏈不成比例的低出現(xiàn)率來說，可以排除這些位點對介導(dǎo)底物特異性存在實質(zhì)上的重要性。(3)‘高變’位點(第239位、第278位、第299位、第322位和第331位)這些位點具有與所用氨基酸相關(guān)的最高的可變性。除了第229位和第331位，這兩個位點具有高度的適應(yīng)性和擺動樣性質(zhì)(參見表1)，所有位點都預(yù)先確定用來確立底物的特異性。就它們在結(jié)合口袋中的相對位置及表1+2及圖3所示的數(shù)據(jù)而言，可以推測第322位對較小的底物殘基具有更大的影響，而第239位和第278位則影響較大的殘基。這一假說得到下面的例子的支持，例如，活化天冬氨酸(第322位組氨酸)、谷氨酸(第239位賴氨酸)和鳥氨酸(第278位谷氨酸)的A域的密碼子(參見表1+2)。在所有提到的例子中，被識別底物的極性和結(jié)合口袋的高變位點恰好匹配(參見表2，于深灰背景中)。
經(jīng)改變的DNA可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的方法，在染色體或染色體外插入至宿主生物中(Sambroo k，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
因此，本發(fā)明涉及權(quán)利要求中列出的實施方案。
為進(jìn)行實驗確證，我們突變了PheA結(jié)合口袋中大量的介導(dǎo)特異性氨基酸組分，并對導(dǎo)致了下列改變的突變體進(jìn)行了研究，該改變指(1)ATP-焦磷酸交換速率(酶活性)(2)非關(guān)連氨基酸的活化(酶特異性)。關(guān)于這后一點，不能不提及野生型蛋白自始即表現(xiàn)出對非關(guān)連底物色氨酸(18％)、亮氨酸(7％)顯著的活化作用。PheA的誘變實驗結(jié)果匯總于表3中，其可概述如下(1)用稍大的氨基酸來進(jìn)行替換不可避免地要以付出結(jié)合口袋中可利用的空間為代價。由此造成突變體中ATP-焦磷酸轉(zhuǎn)交換速率降低，而對關(guān)連底物苯丙氨酸的特異性提高(例如T278M，T278Q，A301V，A322S和C311L)。在所有的情況下，均可以降低非關(guān)連底物色氨酸和亮氨酸的位點特異性20倍。(2)用稍小的氨基酸進(jìn)行替換所觀察到的結(jié)果恰恰相反，結(jié)合口袋稍稍得以擴(kuò)大。在這些突變體中保留野生型蛋白的催化活性，但區(qū)別非關(guān)連底物的能力下降可達(dá)5倍(例如A301G，A322G，和I330V)。(3)“高變”側(cè)鏈的突變(位點為29，278，322和331)造成酶活損失高達(dá)5倍(例如W239L，T278M和C331L)。極性和帶電荷側(cè)鏈基團(tuán)的引入改變了整個結(jié)合口袋的極性，結(jié)果造成相應(yīng)的酶完全失去活性(例如A322D，A322K和A322N)。(4)依照特異性密碼(參照表1)，所觀察到的特定非關(guān)連底物活化的提高是可預(yù)見的。
例如，突變體PheA(I330V)中對苯丙氨酸的活性和特異性都沒有受到影響，但這一結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出對非關(guān)連底物色氨酸和酪氨酸活化作用的明顯提高。有意思的是，所有的色氨酸和酪氨酸活化域都在330位處有纈氨酸。對于朝‘亮氨酸(4)’密碼子(表1)方向突變的突變體也可以觀察到類似的情況，該情況如下所述。
苯丙氨酸和亮氨酸(4)密碼子(表1)具有約60％的同源性，其主要區(qū)別在于位點278，301和322(注三個位點中的兩個為‘高變’組)。因此，估計并經(jīng)實驗證實，向亮氨酸(4)方向進(jìn)行點突變(→T278M和A301G)表現(xiàn)出增強(qiáng)的亮氨酸活化作用(表3)。有趣的是，突變體PheA(T278M)對L-亮氨酸非特異活化的催化效率實際上不受到影響(相同的Vmax)，與此同時對關(guān)連底物(D-，L-苯丙氨酸)的催化活性降低了大約3倍。對突變體PheA(A301G)的觀察結(jié)果與此恰恰相反。此處苯丙氨酸活化的Vmax不受影響，而同時L-亮氨酸的催化活化作用實際上提高了兩倍。所有這些底物特異性和底物活性的變化都是顯著的，可重復(fù)的且明顯高于標(biāo)準(zhǔn)差。密碼子中僅三點不同如何區(qū)分苯丙氨酸和亮氨酸至今仍不清楚，但至少對第301位，可以推測，這種辨別是由于相應(yīng)氨基酸δ位的CH基團(tuán)(Phe)相對CH3基團(tuán)(Leu)在空間上的擴(kuò)展不同造成的。所有活化在空間結(jié)構(gòu)上需要γ或δ位的底物的域在第301位都具有最小的可能側(cè)鏈基團(tuán)(甘氨酸)(表2和3)。
為改變PheA使其底物特異性完全針對亮氨酸，我們構(gòu)建了雙突變體PheA(T278M/A301G)。該突變體密碼子與“Leu(4)”密碼子的相似性約為80％(參見表1)，且其在系統(tǒng)發(fā)生樹中的位置與亮氨酸活化域緊密相鄰(圖2；中間灰色背景部分)。如圖5A所示，這種結(jié)構(gòu)的確更傾向于活化亮氨酸，事實上其各方面的催化效率均等同于野生型的酶，甚至超過后者的活性(突變體對L-Leu的催化活力為Kcat與Km之比為86mM-1min-1，而野生型催化L-Phe的活性為69 mM-1min-1，表4)。經(jīng)檢測，其對L-Leu特異活化效率增加了至少30倍。令人驚訝的是，雙突變體對D-Phe的活化作用僅受到輕微的負(fù)影響，而對另一個立體異構(gòu)體L-Phe進(jìn)行活化時，其催化效率顯著降低了約7倍(圖5A和表4)。與此相反，可以發(fā)現(xiàn)，野生型蛋白PheA與兩個配體L-Phe和D-Phe間的相互作用幾乎是一樣的。如圖1B所示，D-Phe側(cè)面基團(tuán)的芐環(huán)相對于L-Phe的芐環(huán)旋轉(zhuǎn)了約30度，結(jié)果，β碳原子而非α碳原子的相對位置有了輕微的改變。
根據(jù)本發(fā)明所述方法，我們改變了其立體結(jié)構(gòu)尚不清楚的A域的特異性。這個實驗的出發(fā)點在于下述發(fā)現(xiàn)即天冬氨酸和天冬酰胺活化域的已測密碼子非常相似(約為80％，參見表1)。其主要區(qū)別在于第322位(組氨酸對谷氨酸，“高變”組)和330位(纈氨酸對異亮氨酸，“部分可變”組)。因此，我們選擇了已作了深入研究的枯草菌脂肽生物合成復(fù)合物的天冬氨酸活化A域[Cosmina，P.等，1993，分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)8821-831]，并試圖將其改變?yōu)樘於０诽禺愋缘??？梢源_定野生型的蛋白AspA對L-Asp，而非L-Asn具有中等活性的特異活化作用(對L-Asp的野生型活性Kcat與Km之比為10 mM-1min-1；參見圖5B和表4)。與此相反，點突變產(chǎn)物AspA(H322E)形成了對L-Asn的高選擇性(圖5B)，雖然這種特異性改變與催化活性降低相關(guān)(10倍)(突變體對L-Asn的催化活性Kcat與Km之比為1 mM-1min-1；參見表4)。通過構(gòu)建AspA(H322E)還可說明通過引入單個點突變可以完全改變酶對底物的特異性。此外，結(jié)果表明，突變體AspA(H322E)對大小相似的脂肪族天冬酰胺類似物例如異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的活化效率提高了約5倍。
通過引入Ile330Val點突變，還可能進(jìn)一步將對L-Asn特異活化作用的效率提高約70倍。同時也獲得了目前天冬酰胺活化域的催化活性，所述天冬酰胺活化域的大小(腔隙)與原先的AspA域相同。
對谷氨酸和谷氨酰胺活化域密碼子的分析表明，在這些域中形成了非常相似的密碼子(表1)。主要的區(qū)別在于第239位(賴氨酸對谷氨酰胺；“高變”組)。于是我們選擇了枯草菌脂肽生物合成復(fù)合物的谷氨酸活化域(SrfA-A1)，試圖將其改變?yōu)楣劝滨０诽禺愋缘摹τ谝吧偷鞍譍luA，可以確證其對L-Glu而非L-Gln具有中等活性的特異活化作用(其Kcat與Km之比為25/mM-1min-1)。與此對照，點突變體GluA(K239Q)對L-Gln產(chǎn)生了高選擇性，同時催化活性稍稍降低(Kcat與Km之比為20/mM-1min-1)。由于突變體和谷氨酰胺域的密碼子的原因，該結(jié)果是可預(yù)計的，這表明，采用結(jié)構(gòu)GluA(K239Q)也可能通過引入單個點突變完全改變底物特異性。
如下述所示，A域改變的底物特異性也能應(yīng)用在體內(nèi)合成一級結(jié)構(gòu)改變了的肽。為此，例如，通過以同源重組的方式將對谷氨酰胺特異的雙突變體AspA(I330V/H322E)的基因片段轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生枯草菌脂肽的枯草芽孢桿菌ATCC21332的染色體上。這一整合采用兩步重組的方法[Schneider，A，等，1998，Mol.Gen.Genet.257第308-318頁]進(jìn)行，并且導(dǎo)致在枯草菌脂肽生物合成操縱子srfA-B基因中用aspA(H322A/I330V)’替換aspA’。通過從染色體PCR擴(kuò)增突變的asp(H322A/I330V)’基因片段和接下來對該擴(kuò)增片斷的DNA序列分析，驗證這一克隆枯草芽孢桿菌Asn-5的同一性。
生物表面活性劑枯草菌脂肽是一種脂七肽，其帶有一可變的β-羥基脂肪酸部分(6-9個亞甲基團(tuán))，該脂七肽在細(xì)胞向穩(wěn)定生長階段轉(zhuǎn)變時，產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中。據(jù)此，通過發(fā)酵枯草芽孢桿菌ATCC21332和Asn-5，從培養(yǎng)基的上清液中制備野生型枯草菌脂肽和[Asn-5]枯草菌脂肽，可以檢測經(jīng)修飾的脂七肽。接下來的高壓液相層析-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析顯示，和野生型相比較，[Asn-5]枯草菌脂肽(1)產(chǎn)量相同，(2)延遲期較長，(3)在ESIMS分析中質(zhì)量相差1Da。該質(zhì)量不同是顯著的，且在負(fù)離子模式下可以對野生型m/z992到1034和突變體m/z991到1033確定增量為14(可變脂肪酸部分)的離子系。這一發(fā)現(xiàn)與[Asn-5]枯草菌脂肽降低的溶血活性可以視為是在枯草菌脂肽中用脲基(Asn-5；突變體)替代羧基基團(tuán)(Asp-5；野生型)的明確指示?？傊?，這些結(jié)果說明，可以通過特異地改變NRPS基體中A域的底物特異性來改變體內(nèi)相應(yīng)的肽產(chǎn)物。
本發(fā)明涉及一種肽的特異合成方法，其基本上可按如下進(jìn)行按照本發(fā)明所述方法，可以從天然存在的具有功能活性的NRPS系統(tǒng)開始，通過在A域內(nèi)點突變特異地改變所形成非核糖體肽產(chǎn)物的每一個氨基酸位點。為此，要首先從生產(chǎn)生物的染色體擴(kuò)增出待改變的A域的DNA，然后將其克隆到大腸桿菌(E.coli)His標(biāo)記表達(dá)載體上。借助此結(jié)構(gòu)可以得到足夠多的具有功能活性的A域蛋白，將所述蛋白純化，并在體外研究其底物特異性。接下來，就可以依照表1向重組的A域DNA中特異地引入點突變，該突變導(dǎo)致底物特異性改變。所述改變通過下述方式來證明首先在大腸桿菌中過表達(dá)、純化突變的A域，并針對它們的底物特異性對突變的A域進(jìn)行研究。若由此證實了所期望的特異性改變，則可用同源重組的方法將突變的A域DNA替代生產(chǎn)生物的染色體上的天然A域DNA。由此形成的帶有突變的A域的生產(chǎn)菌株即可用于生產(chǎn)改變了的非核糖體肽。
本發(fā)明的方法還可以用于影響已知生物學(xué)活性肽的特異性和/或活性。為此，按照已知的密碼，改變特定的A域，使由改變了的NRPS所合成的肽具有所期望的性質(zhì)。例如，在這里必須指出，可利用親水性氨基酸替代疏水性氨基酸產(chǎn)生溶解度的改善，反之亦然。
本發(fā)明的結(jié)果還可以具體預(yù)測那些已被測序但其功能尚不明確的NRPS基因的底物特異性。由于各種基因組測序工程的進(jìn)行，使得基因序列數(shù)量穩(wěn)步增長，鑒于此，本發(fā)明的上述作用就顯得越來越重要。舉例來說，應(yīng)用此處所述方法，就可根據(jù)一個NRPS族的DNA序列，預(yù)測所形成的產(chǎn)物肽的可能結(jié)構(gòu)。這樣，對這些基因的結(jié)構(gòu)—功能分析變得容易得多。
為獲得一種具有已知DNA序列的NRPS A域的底物特異性，首先要將其與PheA的DNA序列進(jìn)行序列比較。由此可確定待研究的A域中推定的結(jié)合口袋中10個相應(yīng)氨基酸殘基。接下來，這10個氨基酸殘基用作獨立的氨基酸序列與所有已知的其它A域的結(jié)合口袋中的10個氨基酸殘基一起進(jìn)行對比和系統(tǒng)發(fā)生研究。由此形成關(guān)于A域成員的底物特異性的嚴(yán)格序列分類。從而可通過分組特性(grouping behavior)確定所研究的A域的底物特異性。
應(yīng)用本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還可從特別是A、C和T域(如果適合，還包括其它域，見Mahariel等(同上)所述)的已知DNA序列合成不是來自天然合成酶的NRPS。
實施例實施例1PheA和AspA突變體的PCR擴(kuò)增和克隆所有PheA突變體都是通過反向PCR的方法，在質(zhì)粒pPheA上通過定向誘變形成的。完整質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增是遵循生產(chǎn)商建議的方法，應(yīng)用“擴(kuò)展長范圍PCR系統(tǒng)”進(jìn)行的(Boehringer Mannheim；Mannheim，德國，目錄號1681842)。應(yīng)用了下列5’磷酸化的寡核苷酸(MWG-Biotech，Ebersberg，德國)(每個寡核苷酸序列中突變的密碼子已添加了下劃線)(Seq ID-NO1)3′A2365′-ATCAAA AGA GAT GCT GGC A-3′；(Seq ID-NO2)5′-A236L5′-TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3′；(Seq ID-NO.3)3′-W-2395′-TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3′；(Seq ID-NO4)5′-W239G5′-GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3′；(Seq ID-NO.5)5′-W239L5′-TTA GAG ATG TTT ATG GCTTTG TTA-3′；(Seq ID-NO6)3′-T2785′-AAT AAC AGT GATTTC CTT TTG G-3′；(Seq ID-NO7)5′-T278M5′-ATG CTGCCA CCT ACC TAT GTA GTT-3′；(Seq ID-NO8)5′-T278Q5′-CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3′；(SeqID-NO9)3′-12995′-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3′；(Seq ID-NO10)5′-1299T5′-ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3′；(Seq ID-NO11)3′-A301G5′-TCC TGT AAT TAA CGT TTGTAT CG-3′；(Seq ID-NO12)3′-A301V5′-AAC TGT AAT TAACGT TTG TAT CG-3′；(Seq ID-NO13)5′-A3015′-GGC TCAGCT ACC TCG CCT-3′；(Seq ID-NO14)3′-A3225′-AAT GTAAGT TAC TTT CTC CTT C-3′；(Seq ID-NO15)5′-A322D5′-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID NO16)5′-A322E5′-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO17)5′-A322G5′-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO18)5′A322I5′-AAT ATT TAT GGC CCT ACGGAA ACA-3′；(Seq ID-NO19)5′-A322K5′-AAT AAG TATGGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO20)5′-A322N5′-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO21)5′-A322Q5′-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(Seq ID-NO22)5′-A322S5′-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3′；(SeqID-NO23)3′-I3305′-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3′；和(Seq ID-NO24)5′-I330V5′-GTT TGT GCG ACTACA TGG G-3′.
采用“QIAquick-spin PCR純化”系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化(Qiagen；Hilden，德國，目錄號28104)，其粘末端平端化后，進(jìn)行分子內(nèi)連接。添加需要甲基化的識別序列的限制性內(nèi)切酶Dpnl(Amersham/Buchler；Braunschweig，德國；訂貨號E0302Z)來特異地降解PCR基質(zhì)(pPheA；自dam+大腸桿菌菌株中純化的)，從而排除了假陽性克隆。對所有DNA操作和從大腸桿菌XL-1-blue(Stratagene，Heidelberg，德國，Order No.；200268)制備重組質(zhì)粒，均采用標(biāo)準(zhǔn)的方法[Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY]。通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆獲得了下列質(zhì)粒pPheA(A236L)(用寡核苷酸序列Seq ID-NO1和Seq ID-NO2)，pPheA(W239G)(Seq ID-NO3加Seq ID-NO4)，pPheA(W239L)(Seq ID-NO3加Seq ID-NO5)，pPheA(T278M)(Seq ID-NO6加Seq ID-NO7)，pPheA(T278Q)(Seq ID-NO6加Seq ID-NO8)，pPheA(I299T) (Seq ID-NO 9 加 Seq ID-NO10)，pPheA(A301G) (Seq ID-NO11 加 Seq ID-NO13)，pPheA(A301V) (Seq ID-NO12 加 Seq ID-NO13)，pPheA(A322D) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO15)，pPheA(A322E) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO16)，pPheA(A322G) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO17)，pPheA(A322I) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO18)，pPheA(A322K) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO19)，pPheA(A322N) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO20)，pPheA(A322Q) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO21)，pPheA(A322S) (Seq ID-NO14 加 Seq ID-NO22)和pPheA(I330V) (Seq ID-NO23 加 Seq ID-NO24)。所有結(jié)構(gòu)的序列均經(jīng)“ABI prism310 Genetic Analyzer”DNA序列分析儀的序列測定進(jìn)行了檢測和確證(ABIWeiterstadt，德國，OrderNo.310-A)。
編碼SrfA-B天冬氨酸活化A域的DNA片段是用下列寡核苷酸對枯草芽孢桿菌JH642的染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的(Seq ID-NO25)5’AspA5’-AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3’和(Seq ID-NO26)3’-AspA5’AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3’。純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(見上)，再用限制性內(nèi)切酶Ncol和BamHI(mersham/Buchler；Braunchschweig，德國，Order No.E1160Z和E1010Y)消化后，克隆到以同樣方式制備的‘His-標(biāo)記’載體pQE60上(Qiagen；Hilden，德國，Order No.33603)。這一克隆過程構(gòu)建了質(zhì)粒pAspA，該質(zhì)粒能用做利用反向PCR(見上)生成pAspA(H322E)的模板(Seq ID-NO27)5’-AspA(H322E)5’-TAA TGA GTA CGG CCC GAC AGA AGC-3’和(Seq ID-NO28)3’-AspA(H322E)5’-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3’。所構(gòu)建的質(zhì)粒pAspA(H322E)接下來作為模板用于采用下列引物(Seq ID-NO29)5’-AspA(I330V)5’-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3’和(Seq ID-NO30)3’-AspA(I330V)5’-CTG TGG GCC CGT ACT CATTAA TAA ATT CGG-3’通過反向PCR的方法生成pAspA(H322E/I330V)。以上所有結(jié)構(gòu)的同一性均經(jīng)DNA測序反應(yīng)檢測并確證。編碼SrfA-A的谷氨酸活化A域的DNA片段是由下列寡核苷酸以枯草芽孢桿菌JH642的染色體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的(Seq ID-NO31)5’GluA5’-TATGGATCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3’和(Seq ID-NO32)3’-GluA5’-TATGGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT-3’。純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(見上)再用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，OrderNo.E1010Y)消化后，克隆到經(jīng)限制性內(nèi)切酶BgIII(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，Order No.E1021Y)消化的‘His-標(biāo)記’載體pQE60上(Qiagen；Hilden，Germany，Order No.33603)。這一克隆過程構(gòu)建了質(zhì)粒pGluA，該質(zhì)粒能用做利用反向PCR(見上)生成pGluA(K239Q)的模板(Seq ID-NO33)5’-GluA(K239Q)5’-GTG CAG CAAATC TTC GCG TCG CTT C-3’和(Seq ID-NO34)3’-GluA(K239Q)5’-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3’。以上所有結(jié)構(gòu)的同一性均經(jīng)DNA測序反應(yīng)檢測并確證。實施例2腺苷?；?野生型和突變體)的表達(dá)和純化(突變的)基因片段的表達(dá)和其產(chǎn)物His6融合蛋白的純化依照本發(fā)明以外的文獻(xiàn)[Mootz等，1997，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1786834-6850]描述的方法進(jìn)行。每種情況下，與質(zhì)粒pQE60的經(jīng)BamHI切割的一側(cè)相連接使氨基酸序列“GSRSHHHHHH”與特定的重組蛋白的羧基端相融合。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，用Ni2+親和層析的方法，大多數(shù)的蛋白都可被純化到接近均一。但有兩個結(jié)構(gòu)是不溶性的(參見表3)。合并包含特定重組蛋白的組分并在分析緩沖液(HEPES，50mM pH8.0；氯化鈉，100mM；氯化鎂，10mM；二硫赤蘚糖醇(DTE)，2mM；EDTA，1mM)中透析。加入10％的甘油(體積比)，可在-80℃保存該蛋白，而檢測不到任何催化活性的損失。蛋白質(zhì)在各溶液中的濃度通過其在280納米下計算的消光系數(shù)(A280nm)來確定PheA和除PheA(W239Xaa)外所有的PheA突變體均為64060 M-1cm-1，PheA(W239Xaa)為58370 M-1cm-1，AspA和AspA(H322E)為39780 M-1cm-1，GluA和GluA(K239Q)為35490 M-1cm-1。實施例3ATP焦磷酸交換反應(yīng)ATP焦磷酸交換反應(yīng)的進(jìn)行是為了測定純化的重組A域的催化活性和特異性的[Mootz和Marahiel，1997，細(xì)菌學(xué)雜志1786843-6850]。在此方面，每種情況的特異性都采用20種蛋白質(zhì)氨基酸和L-鳥氨酸及D-苯丙氨酸予以檢測。反應(yīng)混合物包含(終體積為100μL)HEPES，50 mM pH8.0；氯化鈉，100mM；氯化鎂，10mM；二硫赤蘚糖醇(DTE)，2mM；EDTA，1mM；氨基酸，0到2mM；酶，250nM。各種反應(yīng)均通過添加下列物質(zhì)來起始，所述物質(zhì)為2mM ATP，0.2mM焦磷酸鈉和0.15μCi(16.06Ci/mmol)的[32P]焦磷酸鈉(NEN/DuPont；Germany；Order No.NEX019)，在37攝氏度下溫育10分鐘。然后加入0.5毫升的終止液終止交換反應(yīng)，所述終止液由1.2％(w/v)活性炭，0.1M的焦磷酸鈉和0.35M的高氯酸組成。離心收集活性炭，用1mL雙蒸水洗一次，再懸浮于0.5mL的水中。加入3.5mL閃爍液(Rotiscint Eco Plus；Roth；Art.No.0016.2)后，可在閃爍分析儀中確定與碳結(jié)合的放射性(1900CA Tri-Carb“液體閃爍分析儀”；Packard)。實施例4通過計算機(jī)分析確定假定的底物結(jié)合口袋從公共數(shù)據(jù)庫(如http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html)中獲得160個A域蛋白序列，將其減少到核心基元A4和A5(Marahiel等，1997，Chem.Rev.972651-2673)之間約100個氨基酸的區(qū)域。然后利用DNAStar程序包中的MegAlign子程序，采用“clustal”方法和默認(rèn)設(shè)置，對這些序列進(jìn)行同源性對比。這第一步對比的主要目的是使接下來對假設(shè)的底物結(jié)合口袋的組件進(jìn)行分類容易一些。為此，可以以它們相對于高度保守的序列基元(核心基元A4和A5及基元‘TPS’和‘GE’；結(jié)構(gòu)‘錨’)的位置為依據(jù)來進(jìn)行分類。然后將所有的序列均削減到結(jié)合口袋的確定組分，再對這些僅包含10個氨基酸的序列進(jìn)行新的對比及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究。每一種方法和每一套參數(shù)使得這些編碼序列能根據(jù)其原始域的底物特異性進(jìn)行歸組。應(yīng)用下列參數(shù)空缺罰分為12，空缺長度罰分為6，Ktuple為2，以Jotun Hein的方法確定如圖2所示的系統(tǒng)發(fā)生樹。實施例5將編碼AspA(H322E/I330V)的基因片段整合到枯草芽孢桿菌AS20的染色體上將編碼AspA雙突變體(Asp(H322E/I330V)的基因片段引入到枯草芽孢桿菌的srfA生物合成操縱子中(Cosmina，P.等，1993，分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)，8821-831)，以便驗證經(jīng)特異修飾的肽抗生素所有體內(nèi)合成方法的有效性。為構(gòu)建其要求的整合質(zhì)粒，首先需要用PCR的方法從枯草芽孢桿菌ATCC21332的染色體DNA上擴(kuò)增出合適的srfA-B基因片段，該片段編碼天冬氨酸活化模塊(堿基對14195-18200)(Cosmina，P.等，1993，分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)，8821-831)，其中所用到的引物序列如下(加下劃線的限制性酶切位點)(seq NO35)5’-homo Asp(ClaI)5’-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG-3’和(seq NO36)3’-homo Asp(SpeI)5’-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGCCCA GT-3’。獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化及限制性內(nèi)切酶ClaI和SpeI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，Germany，Order No.E11034Y和E1086Z)消化后克隆到經(jīng)同樣方式制備的載體pBluescrept SK(-)(Stratagene，Heidelberg，德國，Order No.212206)上。該克隆過程獲得質(zhì)粒pSK-homoAsp，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI(Amersham/Buchler；Braunchschweig，德國，Order No.E1040Y和E1073Y)切下該質(zhì)粒上約1.3kb的aspA’片段(堿基對15212-16559)(Cosmina，P.等，1993，分子微生物學(xué)，8821-831)，上述片段用質(zhì)粒pAspA(H322E/I330V)上經(jīng)兩次突變的互補(bǔ)片段替換。所得重組質(zhì)粒pSK-homoAsp(H322E/I330V)的同一性，經(jīng)DNA序列測定驗證。
突變的aspA’片段通過經(jīng)證明的共轉(zhuǎn)化技術(shù)整合到枯草菌肽生物合成操縱子上(“集合法”(congression))[Schneider，A.等，1998Mol.Gen.Genet.257308-318]，所用宿主為枯草芽孢桿菌AS20[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]，該菌株所帶有的aspA’基因(堿基對15245-17177；Cosmina，P.等1993，分子微生物學(xué)8821-831)已被缺失，并由氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因所替代。使枯草芽孢桿菌AS20能攝入DNA，再用整合載體pSK-homoAsp(H322E/I330V)和輔助質(zhì)粒pNEXT33A[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]共轉(zhuǎn)化。上述輔助質(zhì)粒通過其新霉素抗性基因首先介導(dǎo)了一次正篩選，接下來可對所得克隆進(jìn)行研究，以檢查其是否失去了氯霉素DNA片段，并由此整合了aspA(H322E/I330V)’基因片段。對篩選出的克隆的染色體上這一區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及DNA測序，可確證構(gòu)建的克隆枯草芽孢桿菌Asn-5的同一性。實施例6枯草菌脂肽的制備和分析依照標(biāo)準(zhǔn)的方法[Schneider，A.等，1998 Mol.Gen.Genet.257308-318]制備枯草芽孢桿菌Asn-5產(chǎn)生的枯草菌脂肽。為進(jìn)行分析，所得甲醇溶液經(jīng)“HP1100 Series LC/MSD”高壓液相層析系統(tǒng)用一種PepRPC HR5/5柱(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，Germany，Order No.18-0383-01)分離。各組分采用線性梯度的存在于0.1％三氟乙酸(v/v)中的35％-70％乙腈(v/v)以0.7mL min-1的流速進(jìn)行分離。通過質(zhì)譜在線分析于214nm波長下檢測洗脫物。作為對照，從枯草菌脂肽產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌ATCC21332中提取野生型枯草菌肽進(jìn)行類似的分析。


圖1苯丙氨酸識別和活化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Conti等[Conti等，1997，EMBOJ.164174-4183])。(A)帶狀圖表明PheA包括兩個折疊域，一個大的N端域(底部)和一個較小的C端域。AMP和底物苯丙氨酸用黑色表示。(B)苯丙氨酸的結(jié)合口袋由10個氨基酸形成。第235位的天冬氨酸和第517位的賴氨酸介導(dǎo)與底物α-氨基和α-羧基的靜電相互作用(虛線)?？蓪Ρ奖彼醾?cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行特異識別的真正的結(jié)合口袋是由一側(cè)的第236位的丙氨酸、330位的異亮氨酸、331位的半胱氨酸和另一側(cè)的第322位的丙氨酸、第301位的丙氨酸、第299位的異亮氨酸和第278位的蘇氨酸形成。兩側(cè)由位于底部的第239位色氨酸的吲哚環(huán)分割開。這種構(gòu)造使得PheA結(jié)合口袋可以結(jié)合兩種立體異構(gòu)體的苯丙氨酸L-Phe(淺灰)和D-Phe(深灰)而沒有發(fā)生任何可檢測到的構(gòu)象變化。圖2用A域的10個介導(dǎo)特異性的氨基酸所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)發(fā)生研究結(jié)果顯示，根據(jù)其原始域(淺灰色框)的特異性，已確定的密碼子可以歸組。這證明了A域之間結(jié)構(gòu)同質(zhì)性概念的正確性，而且表明每種情況下所確定的這10個氨基酸的確形成關(guān)連底物氨基酸的識別密碼子。所給出的例子表明通過這一技術(shù)的方法可預(yù)測最新檢測到的域的特異性，而且分組是由實驗觀察到的特異性(深灰色框)所控制的。對于構(gòu)建的突變體PheA(T278M/A301G)和AspA(H322E)這同樣正確，所述突變體在ATP焦磷酸交換反應(yīng)中表現(xiàn)出亮氨酸和天冬酰胺特異性(中灰背景)。圖3圖示三個腺苷?；虻耐茰y的結(jié)合口袋。三種不同底物(天冬氨酸，鳥氨酸(2)，纈氨酸(3)；參見表1)已測定的密碼子投射于圖1B中所示Phe結(jié)合口袋的位置。脂肪族的(淺灰)、極性的(陰影)、酸性的(白色)和堿性的(深灰)側(cè)鏈基團(tuán)如圖中所示。在所有三種情況下，第235位的天冬氨酸和第517位的賴氨酸介導(dǎo)與特定底物α-氨基和α-羧基之間的相互作用，而所有其它的氨基酸殘基，Xaa236到Xaa331介導(dǎo)真正的底物側(cè)鏈識別作用。在所有的例子中，都可以觀察到結(jié)合口袋的極性與底物之間完美的相關(guān)性。圖4所觀察到的各種底物結(jié)合口袋組分的可變性研究了160個假定的底物結(jié)合口袋各位置的氨基酸組分的可變性。在中灰框中描述了所研究的各A域中底物性質(zhì)的分布比例。與結(jié)合口袋每一位置相連接的淺灰色框代表所觀察到的各種殘基的數(shù)量(頻率＝1％)，以及在這些位置疏水的、極性的、酸性的、堿性的側(cè)鏈基團(tuán)出現(xiàn)的比例。根據(jù)所示結(jié)果，10個氨基酸組分可以分為3個亞組(1)第235位(天冬氨酸酸性，白色)和第517位(賴氨酸堿性，深灰)是不變的。(2)第236位、301位、和330位僅部分可變。它們表明帶電荷的和極性的側(cè)鏈基團(tuán)的出現(xiàn)率低于平均水平，所研究的A域中的絕大多數(shù)(93％)在這些位置使用了脂肪族的殘基(灰色)。第239，278，299，322和331位可被視為“高變”位點，就使用不同的氨基酸而言所述位點表現(xiàn)出高度的可變性。圖5PheA和AspA底物特異性的特異改變。借助ATP焦磷酸交換反應(yīng)研究了野生型(白色)和突變體(各種形狀的灰色)的底物特異性。X軸表示所用底物，所觀察到的每種蛋白最大活性定為100％。(A)在PheA中向‘亮氨酸(4)’密碼子方向的點突變(T278M和A301G)稍稍提高了對亮氨酸的特異性，而苯丙氨酸依然是最適底物。另一方面，相應(yīng)的雙突變(PheA(T278M/A301G)；深灰)能很好的活化亮氨酸，其催化活性在各個方面均與野生型酶PheA對苯丙氨酸的催化效率相等。(B)AspA中的H322E點突變足以將突變體的底物特異性由對天冬氨酸完全轉(zhuǎn)變?yōu)閷μ於０?。所觀察到的突變體的活化模式與圖2所示系統(tǒng)發(fā)生樹中它們密碼子的位置相一致(中灰背景)。圖6-9為表1-4。
權(quán)利要求
1.具有期望結(jié)構(gòu)的肽的特異性非核糖體合成方法，該方法包括根據(jù)列于表1的非核糖體密碼，在編碼非核糖體肽合成酶的給定DNA序列內(nèi)改變一個或多個A域編碼區(qū)，以致經(jīng)改變的DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)具有期望結(jié)構(gòu)的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在至少一個待改變的A域中，替換了僅10個氨基酸，優(yōu)選僅6個氨基酸，特別優(yōu)選僅3個氨基酸，尤其特別優(yōu)選1個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中為了產(chǎn)生更長或更短的肽，在給定的DNA序列中特異地添加或除去A域編碼區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之至少一項的方法，其中所合成的肽具有抗生素、免疫抑制、抑制細(xì)胞生長、抗病毒、抗蠕蟲、殺真菌或表面活性作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3之至少一項的方法，其中至少一種經(jīng)改變的非核糖體肽合成酶包含在宿主生物內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述宿主生物選自細(xì)菌、真菌和酵母，且優(yōu)選桿菌、放線菌、粘細(xì)菌、假單孢菌和大腸桿菌，特別優(yōu)選枯草芽孢桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述宿主生物為植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述宿主生物為哺乳動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述宿主生物為人。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4之至少一項的方法，其中經(jīng)改變的非核糖體肽合成酶以分離的形式(在體外)使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中經(jīng)改變的非核糖體肽合成酶是固定化的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中經(jīng)改變的非核糖體肽合成酶與支持物結(jié)合。
13.編碼非核糖體肽合成酶的DNA序列，其中根據(jù)表1的非核糖體密碼，改變了一個或多個A域，以致所改變的DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)預(yù)定結(jié)構(gòu)的肽，該肽優(yōu)選不與天然肽一致。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA序列，其中在至少一個待改變的A域中替換僅10個氨基酸，優(yōu)選僅6個氨基酸，特別優(yōu)選僅3個氨基酸，尤其特別優(yōu)選1個氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的DNA序列在采用根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意一種方法合成肽中的用途。
16.可基于根據(jù)表1的非核糖體密碼獲得的肽，其中表1是該權(quán)利要求的一部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制造經(jīng)修飾的非核糖體肽合成酶(NRPS)的方法,本發(fā)明還涉及該合成酶在制備天然的或人工的肽或蛋白原中的用途。特別地,通過新的非核糖體密碼可制備目的肽。
文檔編號C12N15/52GK1342201SQ00804496
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月3日
發(fā)明者穆罕默德·A·馬拉黑爾, 托爾斯滕·施塔赫爾豪斯, 亨寧·穆茨, 德克·康茲 申請人:穆罕默德·A·馬拉黑爾, 托爾斯滕·施塔赫爾豪斯, 亨寧·穆茨, 德克·康茲