專利名稱：檢測原發(fā)性肝癌特異性γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種用于原發(fā)性肝癌檢測的試劑盒，特別涉及一種檢測原發(fā)性肝癌特異性Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒。
背景技術(shù)：
目前在原發(fā)性肝癌(PHC)的實(shí)驗(yàn)室診斷方面多以甲胎蛋白(AFP)為特異性指標(biāo)。 目前，臨床較為公認(rèn)的用AFP診斷PHC的標(biāo)準(zhǔn)為AFP > 400ng/ml，影像學(xué)發(fā)現(xiàn)肝臟有實(shí)質(zhì)性占位性病灶且能排除肝炎活動、生殖胚胎性腫瘤等。但在臨床上，部分PHC患者血清AFP 陰性或輕度升高，僅靠AFP診斷PHC的靈敏度不足70%，因此，對于AFP陰性或輕度升高的 PHC的診斷仍是臨床上亟待解決的問題。作為PHC的輔助診斷指標(biāo)，Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)雖在大多數(shù)PHC中顯著升高， 但是臨床應(yīng)用的特異性不高。GGT同工酶診斷PHC雖具有較高的特異性，但是操作繁瑣、費(fèi)時，極大的限制了其在臨床中的應(yīng)用。所以除AFP外，目前仍需探索在診斷PHC方面特異性好、靈敏度高且操作方便的方法。
發(fā)明內(nèi)容為了探索現(xiàn)有技術(shù)存在的診斷PHC的特異性不夠好、操作繁瑣的缺點(diǎn)，本實(shí)用新型公開了一種檢測原發(fā)性肝癌特異性Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便。本實(shí)用新型的技術(shù)方案為一種檢測原發(fā)性肝癌特異性Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)設(shè)有9瓶試劑，分別為DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品1瓶、 1 100生物素標(biāo)記的DSA-GGT單抗1瓶、1 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶1瓶、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液1瓶、生物素化抗體稀釋液1瓶、酶結(jié)合物稀釋液1瓶、濃縮洗滌液1 瓶、TMB顯色劑1瓶、終止劑1瓶，另外還有封口膜、若干包被板條和一個包被板條支架，包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。所述包被板條為矩形板，板上設(shè)有12個盛液孔。檢測原理Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于人體的腎、胰、肝、脾和小腸組織中，以腎的含量最為豐富，而血清中的GGT主要來自于肝臟。當(dāng)患者為PHC患者時，患者的GGT會出現(xiàn)大幅的升高，這一現(xiàn)象主要是有肝癌細(xì)胞返祖產(chǎn)生胚胎性GGT所致。胚胎性GGT分子與正常人的肝細(xì)胞所產(chǎn)生的GGT的差別并不在蛋白質(zhì)一級的結(jié)構(gòu)上，而是在該酶的糖鏈分子結(jié)構(gòu)上。所以通過先從肝癌組織中分離純化GGT，用歐曼陀羅凝集素(DSA)-kphar0Se4B進(jìn)行親和層析分離純化，獲得與該凝集素強(qiáng)結(jié)合的GGT (DSA-GGT)，然后應(yīng)用單克隆技術(shù)制備單克隆抗體(McAb)，建立其生物素-鏈霉親和素酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測方法，本實(shí)用新型的試劑盒就是基于此基礎(chǔ)上制備得到。有益效果[0010]1. PHC患者的DSA-GGT診斷的靈敏度可以達(dá)到65. 5 %，特異度達(dá)到91. 1 %。 DSA-GGT為診斷PHC較為敏感的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。2.操作簡便。

圖1為本實(shí)用新型試劑盒打開狀態(tài)下的俯視圖。圖2為本實(shí)用新型的包被板條支架和包被板條俯視圖。
具體實(shí)施方式
一種檢測原發(fā)性肝癌特異性Y -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，所述試劑盒由盒體1和盒蓋組成，盒體1內(nèi)設(shè)有9瓶試劑5，分別為DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品1瓶、1 100生物素標(biāo)記的 DSA-GGT單抗1瓶、1 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶1瓶、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液1 瓶、生物素化抗體稀釋液1瓶、酶結(jié)合物稀釋液1瓶、濃縮洗滌液1瓶、TMB顯色劑1瓶、終止劑1瓶，另外還有封口膜3、若干包被板條4和一個包被板條支架2，包被板條4活動設(shè)于包被板條支架2。所述包被板條4為矩形板，板上設(shè)有12個盛液孔。包被板條4和包被板條支架2均為PP或是PE制成，包被板條支架2的形狀與包被板條4的形狀相適應(yīng)，包被板條4活動設(shè)于包被板條支架2上。試劑盒中的各個試劑瓶的瓶蓋顏色可以設(shè)置的不同，以示區(qū)分。具體使用方法為將標(biāo)本或是DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品以標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液稀釋到合適濃度，洗滌液以濃縮洗滌液按要求配制，1 100生物素標(biāo)記的DSA-GGT單抗以生物素化抗體稀釋液稀釋到合適濃度，1 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶以酶結(jié)合物稀釋液稀釋到合適濃度得到酶結(jié)合物工作液。從試劑盒中取出包被板條，將稀釋好的標(biāo)本或是DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品按100 μ 1/孔加入到相應(yīng)的包被板孔中，空白孔除外。用封口膜封孔，37°C 60min后用洗滌液洗滌包被板條 4次。再加入稀釋好的生物素化抗體同樣是100 μ 1/孔。用封口膜封孔，37°C30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。加入酶結(jié)合物工作液100 μ 1/孔，用封口膜封孔，370C 30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。然后各孔加100 μ 1顯色劑，37°C避光15min。每孔再加終止液 100 μ 1，充分混合后再450nm波長處測量吸光度(A)值。下面結(jié)合具體實(shí)施情況進(jìn)行進(jìn)一步的說明研究對象對照組為45例正常健康體檢者，其中男沈例，女19例，年齡23 45 歲。研究病例均為南京市第二醫(yī)院2004年1月至2007年6月診斷明確的住院患者。PHC 患者58例，男36例，女22例，年齡37 64歲，依據(jù)2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中31例經(jīng)組織病理學(xué)診斷為肝細(xì)胞癌(HCC)。肝良性病變患者167例， 均符合2000年(西安)病毒性肝炎防治方案的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中急性肝炎患者47例，男觀例，女19例，年齡23 62歲；慢性肝炎患者69例，男50例，女19例，年齡23 65歲；肝硬化患者51例，男36例，女15例，年齡47 69歲，其中胰腺癌9例，肺癌8例，腸癌肝轉(zhuǎn)移7例，胃癌8例，食道癌4例。AFP測定按常規(guī)方法測定診斷標(biāo)準(zhǔn)PHC患者以AFP > 400ng/ml或DSA-GGT > 3ng/ml為真陽性；肝良性病變和其他腫瘤患者如果存在AFP > 400ng/ml或DSA-GGT > 3ng/ml為假陽性；PHC患者以AFP ^ 400ng/ml或DSA-GGT ^ 3ng/ml為假陰性，肝良性病變和其他腫瘤患者如果存在AFP ( 400ng/ml或DSA-GGT ( 3ng/ml為真陰性。靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)X 100% ；特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)X 100% ；陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)X 100 % ；陰性預(yù)測值=真陰性/ (真陰性+假陰性)X 100 % ；診斷準(zhǔn)確度= (真陽性+真陰性)/ (真陽性+假陽性+真陰性+假陰性)X 100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。率的比較采用X2檢驗(yàn)；
計(jì)量資料以s表示，采用t檢驗(yàn)。以P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.正常參考水平45例正常對照者的血清DSA-GGT水平為0 2. 6ng/ml (Z±2S), 如果以> 3. Ong/ml (1+3”為診斷結(jié)果的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，則正常對照者的血清DSA-GGT均為陰性。45例正常對照血清AFP水平為O 20ng/ml 士3 ，正常對照血清AFP全部為陰性。2.生物素-鏈霉親和素ELISA法檢測DSA-GGT的臨床應(yīng)用結(jié)果58例PHC患者中， DSA-GGT陽性38例，診斷的陽性率為65. 5%，明顯高于其他疾病(P <0.01) ； 167例肝良性病變患者中，DSA-GGT陽性12例；36例其他腫瘤患者中，DSA-GGT陽性6例(表1)。生物素-鏈霉親和素ELISA法檢測DSA-GGT診斷PHC的特異度為91.1%，陽性預(yù)測值為67. 9%， 陰性預(yù)測值為90. 2%，診斷準(zhǔn)確度為85. 4%。另外，用兩份陽性樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出批內(nèi)及批間變異分別為8. 9%和11. 5%，提示此方法重復(fù)性良好。表1 261例患者血清DSA-GGT的檢測結(jié)果
權(quán)利要求1.一種檢測原發(fā)性肝癌特異性Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)設(shè)有9瓶試劑，分別為DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品1瓶、1 100生物素標(biāo)記的DSA-GGT單抗1瓶、1 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶1瓶、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液 1瓶、生物素化抗體稀釋液1瓶、酶結(jié)合物稀釋液1瓶、濃縮洗滌液1瓶、TMB顯色劑1瓶、終止劑1瓶，另外還有封口膜、若干包被板條和一個包被板條支架，包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測原發(fā)性肝癌特異性Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，其特征在于，所述包被板條為矩形板，板上設(shè)有12個盛液孔。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測原發(fā)性肝癌特異性γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)設(shè)有9瓶試劑，分別為DSA-GGT標(biāo)準(zhǔn)品1瓶、1∶100生物素標(biāo)記的DSA-GGT單抗1瓶、1∶100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶1瓶、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液1瓶、生物素化抗體稀釋液1瓶、酶結(jié)合物稀釋液1瓶、濃縮洗滌液1瓶、TMB顯色劑1瓶、終止劑1瓶，另外還有封口膜、若干包被板條和一個包被板條支架，包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。具有操作簡便，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/573GK202025007SQ20112009056
公開日2011年11月2日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者王念躍 申請人:南京市第二醫(yī)院