專利名稱：改變植物開花時(shí)間的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過基因工程改變植物的開花時(shí)間。具體地說，本發(fā)明涉及通過操控開花基因座(FLC)基因家族的活性來控制開花時(shí)間。
背景技術(shù)：
植株由營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向開花是植株生命周期中一個(gè)重要的發(fā)育轉(zhuǎn)變。開花的開始時(shí)間對(duì)于野生型植物的成功繁殖至關(guān)重要，大多數(shù)植物都已進(jìn)化形成了可準(zhǔn)確調(diào)節(jié)開花時(shí)間的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)同時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境信號(hào)和植物的發(fā)育狀態(tài)，從而控制開花過程。
所監(jiān)測(cè)的兩種常見環(huán)境信號(hào)是光周期和溫度。在光周期響應(yīng)性植物中，由葉子感知日照時(shí)間，開花信號(hào)似乎是由葉子轉(zhuǎn)移到分生組織的(Zeevaart，光與開花過程，Process，eds.，D.Vince-Prue，B.Thomas&K.E.Cockshull，137-142，AcademicPress，Orlando，1984)。低溫可通過被稱為春化作用的過程促進(jìn)開花。春化直接作用于分生組織，可能是通過使得它們能夠認(rèn)知開花信號(hào)發(fā)揮作用(Lang，植物生理學(xué)百科，ed.，W.Ruhland，15(第1部分)，1371-1536，Springer-Verlag，Berlin，1965)。其他可影響開花的環(huán)境信號(hào)包括光的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)狀況。
植物的發(fā)育狀態(tài)也會(huì)影響開花時(shí)間。大多數(shù)植物都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)開花被抑制的不成熟期，最后過渡到成熟期，此時(shí)植物已具備了開花的條件(Poethig，科學(xué)，250，923-930，1990)?！半A段轉(zhuǎn)變”使得植物可達(dá)到適當(dāng)?shù)拇笮∫赃m合開花繁殖。
在談到開花時(shí)，發(fā)育性的開花途徑通常指自發(fā)性的，以表示與環(huán)境改變無關(guān)。然而，自發(fā)性和環(huán)境性途徑不可能完全割裂。例如，煙草中的日-中性品種在形成一定數(shù)量結(jié)瘤后開花，因而可歸為完全通過自發(fā)途徑開花的品種，但是，嫁接研究發(fā)現(xiàn)，日-中性和光周期響應(yīng)性煙草對(duì)類似的可轉(zhuǎn)移開花信號(hào)有響應(yīng)(Lang等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，74，2412-2416，1977；McDaniel等，植物雜志，9，55-61，1996)。因此，這些途徑潛在的生物化學(xué)反應(yīng)似乎是保守性的。
對(duì)幾個(gè)品種的基因分析已鑒定到了影響開花時(shí)間的基因。對(duì)開花時(shí)間基因最廣泛的基因研究是對(duì)擬南芥進(jìn)行的。在擬南芥中，曾用兩種方法鑒定了開花時(shí)間基因。方法之一是在早開花的品種內(nèi)誘導(dǎo)會(huì)影響開花時(shí)間的突變。這樣的突變會(huì)延遲開花，或使得開花更早。延遲開花的突變鑒定其野生型作用為促進(jìn)開花的基因，提早開花突變鑒定抑制開花的基因。以擬南芥進(jìn)行的研究已鑒定了20個(gè)以上經(jīng)突變可特異性地影響開花時(shí)間的基因座，以及影響開花又影響其他發(fā)育過程的其他幾個(gè)基因座(例如，det2，copl，gal和phyB)(Koornneef等，植物生理學(xué)植物分子生物化學(xué)年度回顧，49，345-370，1998；Weigel，遺傳學(xué)年度回顧，29，19-39，1995)。
鑒定開花時(shí)間基因的另一種方法是確定自然發(fā)生的開花時(shí)間改變的基因基礎(chǔ)。雖然實(shí)驗(yàn)室常用的擬南芥品種是早開花型的，但大多數(shù)擬南芥是晚開花型的。晚開花品種與早開花品種的區(qū)別之一在于，晚開花品種在兩個(gè)基因座FRIGIDA(FRI)開花基因座(FLC)處具有抑制開花的顯性等位基因(Sanda等，植物生理學(xué)，111，641-645，1996；Lee等，植物學(xué)雜志，6，903-909，1994；Clarke等，分子基因遺傳學(xué)，242，81-89，1994；Koornneef等，植物學(xué)雜志，6，911-919，1994)。
對(duì)開花時(shí)間突變株和對(duì)開花時(shí)間自然改變的生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，開花受到多種途徑的控制(Koornneef等，植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度回顧，49，345-370，1998)。一組晚開花突變體(fca，fpa，fve，fy，ld)和含有晚開花FLC和FRI等位基因的植株表現(xiàn)為在誘導(dǎo)條件下(長(zhǎng)日照)開花延遲，日照短時(shí)，則延遲更嚴(yán)重。對(duì)這些晚開花品系的春化可抑制晚開花表型。另一組晚開花突變體(co，fd，fe，fha，ft，fwa，gi)在短日照和長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)的開花時(shí)間幾乎沒有差異。而且，該組對(duì)春化也幾乎沒有反應(yīng)。同組雙突變株與單突變親本相比，開花并未顯著延遲，但各組一個(gè)的雙突變株則開花遲于單突變的親本(Koornneef等，遺傳學(xué)，148，885-92，1998)。因此，似乎存在著平行的開花途徑，介導(dǎo)對(duì)于環(huán)境和發(fā)育信號(hào)的開花響應(yīng)。光周期途徑在長(zhǎng)日照時(shí)促進(jìn)開花。文獻(xiàn)中稱為自發(fā)性的途徑(因?yàn)楣庵芷陧憫?yīng)不受途徑中突變的影響)似乎控制著開花的年齡，更具體地說是能夠開花發(fā)育階段。最近有信息可支持該途徑在發(fā)育方面的作用，即，自發(fā)性途徑突變株表現(xiàn)出諸如毛狀體改變之類變化，表明這樣的突變株由不成熟向成熟的轉(zhuǎn)變延遲(Telfer等，發(fā)育，124，645-654，1997)。
因fca，fpa，fve，fy，ld等位基因突變或因存在顯性的晚開花FLC和FRI等位基因而造成的自發(fā)性途徑阻滯可被春化作用避繞(Koornneef等，植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度回顧，49，345-370，1998)。因此，可將FLC和FRI看作造成春化需求的基因。其他品種，尤其是蕪菁，似乎有著與擬南芥相同的“周期”。在對(duì)蕪菁內(nèi)開花顯性抑制和春化劑之間關(guān)系的分析中，對(duì)這種相似性進(jìn)行了最全面的分析。油籽蔓菁和蕪菁一年生品種和兩年生品種的主要區(qū)別來自于控制春化響應(yīng)性開花時(shí)間的基因(Osborn等，美國(guó)遺傳學(xué)協(xié)會(huì)，146，1123-1129，1997)。比較蔓菁和蕪菁一年生和兩年生品種分離種群的數(shù)量性狀基因座(QTL)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)主要QTL賦予蔓菁春化響應(yīng)性晚開花特征，蕪菁可能也是如此(Osborn等，美國(guó)遺傳學(xué)協(xié)會(huì)，146，1123-1129，1997)。在蕪菁中，這兩個(gè)開花時(shí)間QTL在重組近交種群中是分開的，對(duì)開花時(shí)間影響最大的QTL是VFR2(蕪菁2中的春化響應(yīng)性開花時(shí)間)。而且，VFR2似乎對(duì)應(yīng)于擬南芥的FLC用雜交探針制定VFR2的高分辨率圖譜，由此可在晚期等位基因滲入早開花一年生品種后進(jìn)行擬南芥和蕪菁之間的比較，只有對(duì)應(yīng)于FLC的探針監(jiān)測(cè)到VFR2(＜0.44cm)沒有發(fā)生重組，這說明VFR2是FLC的類似物。
開花時(shí)間對(duì)農(nóng)業(yè)和園藝來說至關(guān)重要。園藝作物通常以其花朵作為產(chǎn)品。例如稻米、小麥、玉米、大麥和燕麥等食物、飼料或纖維作物，以及大豆、低芥酸菜籽和棉花等雙子葉植物，以及向日葵、西紅柿、椰菜及其他豆科植物，通常以它們的花朵或開花后的結(jié)果--果實(shí)、種子或種莢作為產(chǎn)品。了解開花時(shí)間調(diào)控的分子機(jī)制將可以通過基因操作改變開花時(shí)間，優(yōu)化花朵、果實(shí)和種子的生產(chǎn)。例如，在某些作物中提早開花將可以在生長(zhǎng)季節(jié)過短的地區(qū)種植該作物，或者在目前只可以種植一種作物的地區(qū)種植多種作物。
在另一些作物中，有用的是植株的非開花部分。在這樣的作物中，避免或延遲開花時(shí)間可提高這些有用部分的得率。此類植物的例子包括紫花苜蓿和三葉苜蓿等飼料，卷心菜等芥菜、菠菜和萵苣等蔬菜。在甜菜或土豆等使用地下部分的作物中，延遲或避免開花可提高得率。而且，避免甜菜開花還可以使得能量更多地用于產(chǎn)糖。同理，延遲開花也可以提高木料或植株體作物的得率。因此，理解開花時(shí)間控制的分子機(jī)制不僅有必要，而且具有重要意義。
發(fā)明概述本發(fā)明包括了一族基因，即開花基因座(FLC)基因，它們是開花抑制的重要調(diào)控因素。本發(fā)明包括這些基因的DNA序列，及這些基因表達(dá)的多肽和蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物，它們因具有影響FLC蛋白質(zhì)活性的水平及時(shí)機(jī)的轉(zhuǎn)基因，與同種的非轉(zhuǎn)基因植株相比改變了開花特性。
本發(fā)明的目的之一是提供可創(chuàng)造出新的植物品種的一種工具，從而可改變植物的開花時(shí)間。可根據(jù)種植者的需要，通過改變植物內(nèi)FLC基因的水平，將開花時(shí)間提前或延遲。
這可以使得植物經(jīng)修飾而變得非常有用。因?yàn)殚_花是開花植物一個(gè)重要生理階段，所以，能夠控制開花時(shí)間將可以促進(jìn)其營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)或開花，從而更復(fù)合需要。
通過以下說明和附圖，本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征將變得更明顯。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是植物基因中MADS盒成員之間相關(guān)程度的系統(tǒng)發(fā)生圖。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及植物開花基因座(FLC)基因家族基因的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。如后文所述，植物的基因組內(nèi)通常有一個(gè)以上FLC基因。然而，F(xiàn)LC基因之間相似或同源。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用這些基因可產(chǎn)生改變開花特征的轉(zhuǎn)基因植物。有了本發(fā)明對(duì)FLC基因的認(rèn)識(shí)，就可以通過抑制FLC活性提早轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間，或通過提高FLC活性延遲開花時(shí)間。這就為種植者和育種者提供了一種獨(dú)特的工具，從而可改變作物的開花時(shí)間特征使之更符合種植者的需要。
以下是幾個(gè)FLC基因的核苷酸序列和氨基酸序列。本發(fā)明的工作是由從擬南芥中分離出基因FLC1并進(jìn)行測(cè)序開始的。利用這一信息以及其他基因信息發(fā)現(xiàn)了后文中的其他幾個(gè)FLC基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥(因?yàn)槠浠蚪M是植物中最小的之一，所以在植物遺傳實(shí)驗(yàn)室中研究較多)具有至少3個(gè)FLC基因，在此稱為FLC1，F(xiàn)LC2和FLC3。利用擬南芥中這3個(gè)FLC基因的信息，目前已鑒定了蕓苔屬的2個(gè)FLC基因。這些基因有幾個(gè)特征與所有其他植物的FLC基因是共同的。
FLC基因?qū)儆谝活愃^MADS盒基因。MADS盒是一段高度保守的基序，為一組進(jìn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子所共有。MADS是首次鑒定出具有MADS盒共有序列區(qū)的原基因的首字母縮寫。至今已鑒定到許多MADS盒基因，目前正致力于進(jìn)一步將這些基因區(qū)分成亞組。在植物中，MADS盒基因被認(rèn)為影響著植物發(fā)育的許多方面，包括結(jié)構(gòu)性發(fā)育。本發(fā)明鑒定的2個(gè)FLC基因(擬南芥FLC2和FLC3)曾是過去擬南芥基因組測(cè)序的一部分，但是其功能是此前未知的。
圖1采用了原由Martin Yanofsky和Elean Alvarez-Buylla，UC San Diego匯總的數(shù)據(jù)，是說明迄今為止在擬南芥和玉米中鑒定的MADS盒蛋白質(zhì)之間相關(guān)程度的系統(tǒng)發(fā)生樹。值得注意的是，本發(fā)明鑒定的3個(gè)FLC基因的彼此關(guān)系比它們與任一其他MADS盒基因都更緊密。
后文序列表中列出的是擬南芥FLC1、FLC2和FLC3，以及蕪菁BrFLC1A和BrFLC1B的cDNA序列，和推導(dǎo)氨基酸序列。還有一些序列比較數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)表明擬南芥的FLC1和FLC2在其全長(zhǎng)范圍內(nèi)的相同性為60％，除MADS盒基因以外全部區(qū)域的相同性仍在50％以上。后一比較更重要，因?yàn)樗蠱ADS區(qū)的MADS盒基因之間本身具有較高的保守性。為了進(jìn)行這一項(xiàng)分析，MADS盒區(qū)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)序列氨基端的前60個(gè)氨基酸。這種序列相似性程度似乎是跨種類的。實(shí)際上，蕓苔屬基因BrFLC1A和BrFLC1B與FLC1的相似性大于FLC1與FLC2相似性。MADS盒之外FLC2與蕓苔屬基因的相同性略低于50％，所以，一般認(rèn)為FLC基因家族變體間氨基酸水平上的相同性高于40％。因此，除MADS盒區(qū)之外氨基酸相同性高于40％是FLC基因家族成員的表征之一。
再次看
圖1系統(tǒng)發(fā)生樹，重要的是本發(fā)明鑒定的3個(gè)擬南芥FLC基因的彼此關(guān)系比它們與其他擬南芥BADS盒基因之間的更緊密。因?yàn)閾?jù)信對(duì)MADS盒基因已完全了解(至少根據(jù)近期完成的擬南芥全基因組測(cè)序)，所以可以用常規(guī)序列分析方法及匹配軟件，從圖中得出任一新測(cè)序的基因與
圖1所示MADS盒家族成員之間的關(guān)系。FLC基因家族成員是，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生圖分析，與擬南芥FLC1、FLC2和FLC3的關(guān)系比其與任一其他擬南芥MADS盒基因更緊密的基因。
確認(rèn)某基因是FLC基因族成員的方法之一是測(cè)定該基因?qū)﹂_花時(shí)間的影響。后文實(shí)施例描述了證明FLC基因?qū)嶋H上延遲轉(zhuǎn)基因植物開花的試驗(yàn)。以擬南芥為模型，通過測(cè)試一個(gè)可能的FLC基因是否在轉(zhuǎn)基因植物中具有類似的效果，可確認(rèn)其他植物種類推定FLC基因的活性。
需要強(qiáng)調(diào)的是，以上工具所實(shí)現(xiàn)的是對(duì)植物開花時(shí)間的改變。FLC的正常功能是延遲或抑制開花。然而，獲得FLC基因的序列可使得植物的開花時(shí)間向兩個(gè)方向改變。目前已有數(shù)種方法可下調(diào)或上調(diào)某內(nèi)源性植物基因的表達(dá)。要下調(diào)基因表達(dá)，可在植物內(nèi)插入一段該基因編碼序列的反義鏈，或者可通過共同抑制來下調(diào)基因表達(dá)水平，這是一種知之尚少的現(xiàn)象，即，一段人造基因構(gòu)建物的插入有時(shí)會(huì)引起對(duì)該插入基因及與之同源的其他基因的抑制。要上調(diào)植物基因，可通過植物基因組的胚系轉(zhuǎn)化，在植株內(nèi)引入此基因的額外拷貝，或通過選擇強(qiáng)度和特性適當(dāng)?shù)闹参飭?dòng)子，提高植物細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)天然基因所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的活性水平。
需要理解的是，目前植物基因工程的水平以可以將任意基因構(gòu)建物引物任何有用的植物品種。然而，這一過程仍具有一定隨機(jī)性，最主要的是，外源DNA插入植物基因組仍是在植物基因組內(nèi)任意位置發(fā)生的。結(jié)果，在植物轉(zhuǎn)化所得的任何一組植株中，不同的基因插入的結(jié)果有時(shí)會(huì)差異極大。例如，就單基因插入某內(nèi)源性植物基因的另一拷貝而言，所得許多植株的該內(nèi)源性蛋白質(zhì)活性會(huì)略有提高，另一些則沒有可測(cè)知的改變，甚至可測(cè)得所述活性的降低，而有少數(shù)的活性則顯著提高。然而，這種變數(shù)并不意味著不可能獲得穩(wěn)定的結(jié)果，因?yàn)閷?duì)每一具體的基因插入來說，代與代之間的結(jié)果傾向于一致。因此，高活性植株具有的有效的高活性等位基因可通過正常的孟德爾遺傳傳遞給它們的后代。
為了制造轉(zhuǎn)基因植物，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，需要在植株內(nèi)制造一個(gè)能夠表達(dá)插入的蛋白質(zhì)編碼序列(外源或內(nèi)源)的基因構(gòu)建物。還需要將該基因構(gòu)建物插入所述植物的方法。
目前已知許多制造可在植物內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物的工具和技術(shù)。欲在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物必需包含編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，該序列決定在所得植物內(nèi)所表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的序列。欲在植物內(nèi)表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼序列必需置于植物可表達(dá)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，并后接一段植物轉(zhuǎn)錄終止序列，又稱聚腺苷酸序列。植物可表達(dá)啟動(dòng)子即如下啟動(dòng)子在植物內(nèi)有效，來自植物或來自植物病原例如病毒(例如煙草花葉病毒)或細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌啟動(dòng)子，如胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)子)。來自病原的啟動(dòng)子多為組成型啟動(dòng)子，即它們能始終在植株的所有組織內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。其他植物啟動(dòng)子則被認(rèn)為是組織特異性的(例如果實(shí)或花朵特異性)或發(fā)育特異性(例如對(duì)植物生命周期的某一階段具有特異性，例如出芽期特異性或衰老特異性)，另一些則是誘導(dǎo)型的(例如熱休克或金屬離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)。這些類型的啟動(dòng)子都可根據(jù)預(yù)期對(duì)所得轉(zhuǎn)基因植物的預(yù)期作用用于本發(fā)明。
并非所有基因構(gòu)建物都是用來在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)多肽或蛋白質(zhì)。如果操作的目的是降低植物內(nèi)靶蛋白的活性水平，則可能希望基因構(gòu)建物在植物內(nèi)降低內(nèi)源性蛋白質(zhì)水平而不是生產(chǎn)蛋白質(zhì)。為此目的的一種著名方法是反義技術(shù)，即形成一基因構(gòu)建物，在植物細(xì)胞內(nèi)合成一段mRNA，它與靶基因表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的mRNA的某些部分互補(bǔ)。反義RNA干擾靶mRNA的翻譯，由此降低該植物內(nèi)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
已證明有數(shù)種方法可將基因插入植物形成轉(zhuǎn)基因植物。使用最廣，說明最全面的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或加速粒子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。各種農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化技術(shù)利用了植物病原農(nóng)桿菌將細(xì)菌質(zhì)粒DAN轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞基因組內(nèi)的能力。粒子介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化技術(shù)使用一加速裝置(通常為基因搶)加速包有DNA的粒子，使之進(jìn)入植物細(xì)胞。對(duì)于以上兩種方法還需要輔以其他技術(shù)，從而可由轉(zhuǎn)化細(xì)胞得到完全成熟的、形態(tài)正常的植株。因此，這些技術(shù)通常都包括鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇或篩選方法，以及從單個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成完整植株的方法。如上所述，這些技術(shù)已被證明適用于多種植物，并適用于多種幾乎所有具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種。也可用其他技術(shù)，例如電穿孔來形成轉(zhuǎn)基因植物。但就本發(fā)明而言，具體的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)并不重要。植物只要經(jīng)基因工程改造成為轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)化原植物的方法就變得無關(guān)緊要。然后，已插入植物基因組的轉(zhuǎn)基因就可以通過經(jīng)典植物育種法的一般規(guī)則被第一代基因工程植株的后代完全繼承?！稗D(zhuǎn)基因”在此指靶植物細(xì)胞所攜帶的插入基因構(gòu)建物。因此，“轉(zhuǎn)基因植物”在此指帶有這種轉(zhuǎn)基因的植物。
本發(fā)明揭示了有關(guān)一組植物基因，即FLC基因的信息。雖然這些基因此前已經(jīng)以其天然或改變狀態(tài)存在于植物內(nèi)，但本發(fā)明首次將它們分離了出來。“分離形式”表示這些基因從其宿主植株內(nèi)被分離出來。由此，可以獲得有關(guān)這些基因的信息并用于對(duì)基因極其元件的體外操作，從而創(chuàng)建多種用途的基因構(gòu)建物。用途之一就是形成轉(zhuǎn)基因植物。另一種用途是對(duì)轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因植物的診斷和分析，分析并確定它們的FLC基因活性方式，用來協(xié)助育種或形成開花時(shí)間特征符合需要的植物。
例如，如后文所述，因FLC內(nèi)突變而缺乏FLC活性的植物開花比含有活性FLC等位基因的植株早得多。具有野生型FLC活性的植株的葉數(shù)是FLC活性降低的植株的約6倍。而且，F(xiàn)LC表達(dá)水平高于正常的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出明顯的開花延遲。雖然以下實(shí)施例是用擬南芥進(jìn)行的(因在該植物內(nèi)的基因操作較簡(jiǎn)單)，但同樣的技術(shù)也適用于其他植物品種。實(shí)際上，F(xiàn)LC基因之間的高度相同性表明，作為一種普遍規(guī)律，一種植物FLC基因家族的成員在其他植物品種中也是有功能的。
開花時(shí)間調(diào)節(jié)FLC基因是植物開花引發(fā)的抑制者。據(jù)信，F(xiàn)LC的開花引發(fā)聚核苷酸片段在開花引發(fā)的調(diào)控中起者核心作用，因?yàn)?，其他基因是通過改變?cè)摶虻幕钚詠碚{(diào)節(jié)開花的。然而，該基因并非決定植物開花時(shí)間的唯一因素。例如，已證明，F(xiàn)RIGIDA(FRI)基因座是開花的協(xié)同抑制者，可與FLC發(fā)生協(xié)同作用(參見，Lee等，植物雜志，6，903-909，1994)。相反，LUMINIDEPENDENS基因促進(jìn)開花，它通過降低FLC水平發(fā)揮作用。在缺乏LUMINIDEPENDENS活性因而開花延遲的突變株中，F(xiàn)LC水平顯著提高。因此，改變開花引發(fā)調(diào)節(jié)基因是控制開花時(shí)間的有效手段。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RI的作用是提高FLC水平。事實(shí)上，F(xiàn)LC和FRI兩基因是兩個(gè)顯性等位基因，可相互作用從而延遲開花。按照傳統(tǒng)命名，小寫(例如fri，flc)表示隱性或非活性等位基因，大寫(例如FRI，F(xiàn)LC)表示活性的顯性等位基因。要延遲開花，一般需要兩個(gè)等位基因都承顯性。這樣，早開花的植物具有以下基因組合fri/fri和flc/1flc1；fri/fri和FLC1/fri；fri/fri和FLC1/FLC1；FRI/fri和flc1/flc1；FRI/FRI和flc1/flc1。晚開花的基因組合為FRI/fri和FLC1/flc1；FRI/FRI和FLC1/flc1；FRI/fri和FLC1/FLC1；FRI/FRI和FLC1/FLC1。因此，在非轉(zhuǎn)基因品系中檢測(cè)FLC1突變型時(shí)，可將含有未知活性的FLC1等位基因的植株與含有FRI等位基因(以純合體為佳)雜交，看是否含有活性FLC1等位基因。
植物的生命周期可分成至少兩個(gè)階段營(yíng)養(yǎng)期和繁殖期。在大多數(shù)經(jīng)濟(jì)作物植物中，在營(yíng)養(yǎng)期，植物不斷生長(zhǎng)，包括植物葉的增大和增多。繁殖期從開花引發(fā)開始。此時(shí)，許多植物的繼續(xù)生長(zhǎng)是花朵、果實(shí)和種子的生長(zhǎng)(或發(fā)育)。經(jīng)濟(jì)作物植物已就所需的特性經(jīng)歷了選育，所述特征包括植物同時(shí)進(jìn)入收獲期。結(jié)果，種植于相同條件下的植物群中的每一植株的葉數(shù)高度一致。由于這種葉數(shù)的相同性，開花時(shí)間的改變常可根據(jù)作物植株上葉數(shù)來確定。例如，如果植物開花提早，則該植株的葉數(shù)將少于種植于相同條件下開花未提前的植株。而且，還可以認(rèn)為，開花提前的植株其營(yíng)養(yǎng)期短于種植于相同條件下開花未提前的植株。同理，如果開花被抑制而延遲，則植物的葉數(shù)將多于種植于相同條件下開花未延遲的植株。而且，開花受抑制的植株其營(yíng)養(yǎng)期也將比種植于相同條件下開花未受抑制的植株延長(zhǎng)。開花時(shí)間的改變也可根據(jù)時(shí)間來測(cè)定。
引入FLC基因拷貝的植物可能也含有抑制開花的野生型(即內(nèi)源性)開花時(shí)間調(diào)控編碼區(qū)。在引入基因組后，F(xiàn)LC基因可放大該內(nèi)源性開花時(shí)間調(diào)控編碼區(qū)的活性，從而延遲開花。例如，可在植物內(nèi)引入第二份開花時(shí)間調(diào)控編碼區(qū)，從而增加植物內(nèi)開花時(shí)間調(diào)節(jié)FLC蛋白質(zhì)的量。開花時(shí)間調(diào)控編碼區(qū)部分所編碼的部分FLC蛋白的表達(dá)也能激發(fā)植物開花。激發(fā)植物開花的部分多肽稱之為顯性陰性突變，后文有詳細(xì)描述。
本發(fā)明還提供了一種基因修飾植物，其特征在于開花時(shí)間被改變的表型。即，本發(fā)明修飾后的植物，不論是通過在植物內(nèi)引入表達(dá)新的或更多FLC蛋白質(zhì)的FLC基因加以修飾，還是通過抑制植物內(nèi)內(nèi)源性FLC基因活性加以修飾，表現(xiàn)為開花引發(fā)時(shí)間比沒有插入轉(zhuǎn)基因的相同植物遲。較好的是，轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間(平均)比沒有轉(zhuǎn)基因的相同植物晚至少3天，至少7天更好，至少12天最好?；蛘?，轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間(平均)比沒有轉(zhuǎn)基因的相同植物早至少3天，至少7天更好，至少12天最好。較好的是，將轉(zhuǎn)基因植物與沒有轉(zhuǎn)基因的相同植物種植在相同條件下。后文擬南芥的數(shù)據(jù)顯示，甚至可能得到開花時(shí)間更大的改變，如3周到3個(gè)月。
轉(zhuǎn)基因植物與無轉(zhuǎn)基因相同植物之間開花期開花引發(fā)時(shí)間的早晚差異也可根據(jù)開始開花時(shí)兩者的葉數(shù)差異來測(cè)定。較好的是，開始開花時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的葉數(shù)比無轉(zhuǎn)基因的相同植物多至少10％，至少50％更好，至少80％最好?；蛘撸D(zhuǎn)基因植物的葉數(shù)比無轉(zhuǎn)基因的相同植物少至少10％，至少50％更好，至少80％最好。較好的是，將轉(zhuǎn)基因植物與沒有轉(zhuǎn)基因的相同植物種植在相同條件下。
本發(fā)明實(shí)施例之一中，提供了一種核酸分子，包括一段核苷酸序列，代表擬南芥FLC基因編碼區(qū)或其部分，F(xiàn)LC基因序列的等位變異體，以及來自其他品種的FLC基因編碼區(qū)的同源序列。同源性即相關(guān)性，可用核酸雜交技術(shù)、數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算機(jī)檢索，計(jì)算機(jī)或人工比較氨基酸和核酸序列，和用FLC特異性抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)檢測(cè)等技術(shù)來測(cè)定。兩段序列如果排列后有一定百分比的對(duì)應(yīng)殘基相同，則是“相似的”。較好的是，兩段核苷酸序列的相同性高于31％，高于約50％更好，高于70％更好，高于80％最好。
所以，本發(fā)明包括這樣的基因和蛋白質(zhì)，它們是植物基因FLC家族的成員，且一級(jí)結(jié)構(gòu)與后文所述的FLC1具有明顯的相同性。將兩段氨基酸序列(即，同源序列的氨基酸序列和FLC1的序列)排列對(duì)齊，使得MADS區(qū)，即氨基酸1-60對(duì)齊，然后對(duì)兩段氨基酸序列的全長(zhǎng)進(jìn)行排列對(duì)齊，使得其中相同的氨基酸數(shù)量達(dá)到最大。排列中，序列之一或兩者中允許留空，為使MADS區(qū)的殘基對(duì)齊，并使氨基酸相同數(shù)量最大，但各序列內(nèi)的氨基酸必需保持在其正確的序位。氨基酸相同性百分比是以下兩值中的高值(a)排列中兩序列相同的氨基酸數(shù)量除以FLC1的氨基酸數(shù)再乘以100；或(b)排列中兩序列相同的氨基酸數(shù)量除以后續(xù)多肽的氨基酸數(shù)再乘以100。較好的是，開花時(shí)間調(diào)控多肽在FLC1蛋白質(zhì)全長(zhǎng)上的相同性高于40％，高于50％更好，高于70％最好。
核苷酸水平的序列同源性或相同性不那么重要。正如本領(lǐng)域所熟知的，遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性使得許多不同DNA蛋白編碼序列可編碼同樣的氨基酸序列。甚至可以，而且經(jīng)常，在制作植物表達(dá)盒時(shí)，出于方便克隆或密碼子使用偏性上的原因而改變天然蛋白質(zhì)編碼序列，但不改變產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明的分離核酸分子可用多種方法獲得。例如，可用本領(lǐng)域熟知的方法來分離核酸分子。這些技術(shù)包括但不限于1)可測(cè)性標(biāo)記代表任一FLC基因全部或部分的探針，用其與基因組或cDNA庫(kù)雜交，檢測(cè)相似的核酸序列；2)抗體篩選表達(dá)文庫(kù)，檢測(cè)相似的結(jié)構(gòu)特征；3)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成；和4)核酸分子化學(xué)合成。特定的基因編碼區(qū)還可以在GenBank，國(guó)家衛(wèi)生研究院計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。然后，可分離出編碼區(qū)，將其連接入后文所述的載體中。
為了用可測(cè)性標(biāo)記的探針鑒定分離所得核酸分子，或?yàn)殍b定互補(bǔ)鏈與FLC1雜交的聚核苷酸片段，標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件是采用Church等(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，81，1991-1984)所述的方法并加以改進(jìn)在含0.5M磷酸鹽緩沖液，Ph7.2，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10mM EDTA的溶液中45℃培養(yǎng)12小時(shí)，在含2×SSC(1×SSC150mM NaCl/15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％SDS的溶液中45℃洗滌3次，每次20分鐘。較好的是，聚核苷酸(例如探針)可在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與SEQ ID NO1中的核苷酸序列雜交。通常，聚核苷酸(例如探針)不必與聚核苷酸片段的所有核苷酸互補(bǔ)，只要能在上述條件下雜交即可?；蛘?，可采用更高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件，例如，提高雜交和洗滌步驟的溫度至65℃、60℃、55℃或50℃。而且，雜交所需的時(shí)間可不用上述的12小時(shí)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)度越低的雜交條件允許相關(guān)而不一定相同F(xiàn)LC基因的雜交，因而可鑒定出其他品種中的FLC基因。較好的是雜交和洗滌溫度為，按照優(yōu)先順序，68℃雜交65℃洗滌，60℃雜交和洗滌，55℃雜交和洗滌，50℃雜交和洗滌，最好的是45℃洗滌和洗滌。
本發(fā)明所述的植物包括各種可用轉(zhuǎn)化技術(shù)改造的開花植物，包括單子葉和雙子葉植物。單子葉植物例如但不限于苷藍(lán)、洋蔥和大蒜等蔬菜；例如玉米、大麥、小麥、水稻、高粱、珍珠粟、裸麥和燕麥等谷類；和草料或草皮等草類。雙子葉植物的例如但不限于諸如西紅柿、豆子、大豆、胡椒、萵苣、豌豆、紫花苜蓿、三葉草、蕓苔(卷心菜、椰菜、花椰菜、芽苷藍(lán)、油菜籽和蘿卜)，胡蘿卜，甜菜，茄子，菠菜，黃瓜，南瓜，西瓜，哈密瓜，向日葵；棉花等纖維作物；和花卉及灌木等觀賞植物。
雖然后文實(shí)施例證明增強(qiáng)FLC的表達(dá)可延遲或抑制開花，F(xiàn)LC功能喪失則將促進(jìn)開花，仍可用其他方法修飾FLC從而改變開花時(shí)間。例如，可在植物基因組內(nèi)引入編碼某開花時(shí)間調(diào)節(jié)多肽顯性陰性轉(zhuǎn)基因。顯性陰性突變體即可活躍干擾正常的內(nèi)源性蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)。于是可以阻抑某基因的作用但不致使結(jié)構(gòu)基因本身或其RNA失活。該方法曾被成功地用于和FLC同屬于MADS區(qū)家族的轉(zhuǎn)錄因子。(Gauthier-Rouviere等，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，209，208-215，1993；Mizukami等，植物細(xì)胞，8，831-845，1996)。在用MADS盒基因制造顯性陰性突變的實(shí)驗(yàn)中，最有效的構(gòu)建物是沒有該多肽C末端區(qū)的那些。因?yàn)?，F(xiàn)LC和大多數(shù)MADS盒基因一樣具有相同的基本結(jié)構(gòu)，所以類似的C末端截?cái)鄬?duì)FLC同樣有效。這一截?cái)辔锇L(zhǎng)FLC1蛋白質(zhì)的氨基酸1-150，對(duì)應(yīng)于FLC基因的核苷酸1-450。
以上大致描述了本發(fā)明。更全面的理解可通過以下具體實(shí)施例獲得。實(shí)施例在此僅用于說明，并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例對(duì)4種誘導(dǎo)后flc1等位基因中的損傷進(jìn)行了測(cè)定。有關(guān)3種快速中子flc1等位基因早開花表型的數(shù)據(jù)見表1和2。4種flc1等位基因都含有可能造成功能完全喪失的突變?？傊?，F(xiàn)LC1基因功能的喪失在長(zhǎng)日照和短日照條件下都完全抑制了FRI的晚開花作用。在早開花-無FRI的背景中，F(xiàn)LC1功能喪失只在短日照條件下影響開花時(shí)間。因此，野生型或活性FLC1顯然是開花的抑制者。
表1flc1功能喪失突變?cè)谕黹_花、含F(xiàn)RI背景中的影響品系 開花時(shí)的蓮座葉數(shù)量長(zhǎng)日照--含F(xiàn)RI的野生型74(12)*長(zhǎng)日照--flc1-2 11.8(.75)*長(zhǎng)日照--flc1-3 12.0(0.6)長(zhǎng)日照--flc1-4 11.8(0.4)*短日照--含F(xiàn)RI的野生型＞100短日照--flc1-3 44(2.7)*括弧內(nèi)的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。測(cè)定開花前形成的葉數(shù)作為開花時(shí)間。據(jù)此，在含F(xiàn)RI背景中，flc1突變植物其開花前的時(shí)間均為含F(xiàn)LC1野生型植物的1/6。
表2flc1失能突變?cè)谠玳_花無FRI背景中的影響品系開花時(shí)的蓮座葉數(shù)量長(zhǎng)日照--Col野生型 13.7(0.8)*長(zhǎng)日照--flc1-313.2(0.7)短日照--Col野生型 55.4(4.7)短日照--flc1-342.4(3.5)*括弧內(nèi)的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。測(cè)定開花前形成的葉數(shù)作為開花時(shí)間。
本發(fā)明的品系來自擬南芥生物學(xué)來源中心，Columbus，OH。除非另作說明，培養(yǎng)條件和本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍所知和所用的相同。由于春化對(duì)開花引發(fā)的作用，培養(yǎng)條件不使植物長(zhǎng)期經(jīng)受低溫(例如0-8℃)。對(duì)擬南芥進(jìn)行基因分析的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的(參見，例如Koornneef等，基因分析，“擬南芥方法”，分子生物學(xué)方法，第8卷，Martinez-Zapater等(eds.)，Humana Press，Totowa，NewJersey，pp.105-227，1998)。
4種酵母人造染色體(YAC)克隆中包含Nga249和nga151之間的區(qū)域。為了制作其他標(biāo)記，我們測(cè)定YAC末端克隆的DNA序列，并設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Ler和Col中對(duì)應(yīng)序列的引物。測(cè)定這些Ler和Col的DNA序列，確定單核苷酸改變，然后用來產(chǎn)生衍生切割擴(kuò)增多態(tài)序列(dCAPS)標(biāo)記(Michaels和Amasino，1998；Neff等，1998)。用來自YAC CIC1B8左端和右端的標(biāo)記檢測(cè)到，F(xiàn)LC1兩側(cè)都發(fā)生重組，證明FLC1位于CIC1B8所覆蓋的620kb區(qū)間內(nèi)。
在覆蓋CIC1B8的Kazusa擬南芥基因組課題中曾鑒定到13BAC，TAC和P1克隆。這些克隆中插入片段長(zhǎng)70-100kb，用它們作為DNA印跡試驗(yàn)的探針，所述試驗(yàn)用含快速中子誘導(dǎo)的flc1突變植株的EcoRV-消化DNA進(jìn)行。兩個(gè)重疊克隆，K6M1和MYB9，鑒定到數(shù)條flc-2中有缺失的條帶。用Sau3A1部分消化產(chǎn)生K6M1和MYB9的10-20kb隨機(jī)片段，用它們?cè)诙d體pPZP211(Hajdukiewicz等，1994)中建立一個(gè)文庫(kù)，用該文庫(kù)的各克隆轉(zhuǎn)化Ler品系中的FRI。該文庫(kù)由Col背景的DNA構(gòu)成，該背景含有晚開花的FLC1等位基因。因此，用含F(xiàn)LC1-Col等位基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的Ler-FRI植物將晚開花。該文庫(kù)中的一個(gè)克隆，211-31，產(chǎn)生了開花很晚的T1植株。1/3以上的植株在培養(yǎng)8個(gè)月后，沒有開花就開始衰老。
在211-31中測(cè)序發(fā)現(xiàn)了3個(gè)推定基因。為了確定哪一個(gè)是FLC1，對(duì)以下3個(gè)候選基因進(jìn)行了檢測(cè)，它們來自另兩種快速中子flc1等位基因，flc1-3和flc1-4，和一個(gè)EMS產(chǎn)生的等位基因flc1-1。兩種快速中子等位基因都表現(xiàn)出MADS盒轉(zhuǎn)錄因子所產(chǎn)生條帶的多態(tài)性。測(cè)定flc1-1，flc1-3和flc1-4的序列發(fā)現(xiàn)，它們的MADS轉(zhuǎn)錄因子的第一個(gè)外顯子中都存在損傷。flc1-3有一段104bp的缺失，因此失去了啟動(dòng)密碼子，flc1-4有一段7bp的缺失，因此在前20個(gè)氨基酸后發(fā)生讀碼框改變。flc1-1在第一外顯子/內(nèi)含子的連接處有一處單堿基轉(zhuǎn)換，因而將保守的GT供體位點(diǎn)變成了AT，并可能因而干擾剪接。通過RT-PCR從Col背景中分離出FLC1 cDNA，序列表中給出了其序列。實(shí)施例3晚開花轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)生為了確定FLC1是否可用于改變開花時(shí)間，培養(yǎng)了含兩種不同F(xiàn)LC1構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因擬南芥。第一種構(gòu)建物，211-31，由含F(xiàn)LC1的基因組DNA與其天然啟動(dòng)子構(gòu)成。另一種，pSM7，含有位于煙草花葉病毒組成型35S啟動(dòng)子調(diào)控下的FLC1基因組編碼區(qū)(Odell等，自然，313，810-2，1985)。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將211-31轉(zhuǎn)化入Ler型FRI(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194，1993)。非轉(zhuǎn)化的Ler-FRI約在長(zhǎng)出14片原生蓮座葉開花(Lee等，植物雜志，6，903-909，1994)。以211-31轉(zhuǎn)化的Ler-FRI植物因FRI與FLC1的協(xié)同作用，開花顯著延遲(表3)。90％以上的轉(zhuǎn)化子在50多片以上時(shí)才開花，約38％始終未開花，即使培養(yǎng)在能夠強(qiáng)烈促進(jìn)擬南芥開花的富遠(yuǎn)紅外線條件下亦是如此。因此，F(xiàn)LC1過表達(dá)可使植物在整個(gè)生命周期內(nèi)不開花。由于211-31轉(zhuǎn)化的植物其發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)期延長(zhǎng)，生物量增加了10倍。這說明，一個(gè)FLC基因的過表達(dá)能夠使得早開花的植物變成晚開花植物。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將pSM7轉(zhuǎn)化入野生型Ler(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194，1993)，用于測(cè)定FLC1在正常早開花品系內(nèi)組成型表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)果見表5。30％轉(zhuǎn)基因植株開花未明顯晚于其Ler親本，35％中度延遲，35％明顯延遲。轉(zhuǎn)基因植物開花時(shí)間的不一致可能是因?yàn)樗鼈冊(cè)诨蚪M內(nèi)的插入位置不同引起表達(dá)水平不同。這說明，即使沒有FRI活性，F(xiàn)LC1表達(dá)也足以實(shí)質(zhì)性地延遲開花。而且，組成型FLC1表達(dá)引起的晚開花對(duì)春化不敏感(春化可有效促進(jìn)含F(xiàn)RI和FLC1的天然晚開花品系早開花)。因此，通過以一組成型啟動(dòng)子取代原天然FLC啟動(dòng)子，就可以形成晚開花而此特征對(duì)環(huán)境因素不敏感的晚開花植物。同樣，晚開花伴有生物量增加。
表3以FLC1轉(zhuǎn)化的含F(xiàn)RI植物的開花時(shí)間*開花時(shí)的蓮座葉數(shù)占轉(zhuǎn)化植物百分比12-20 8％20-40 0％40-80 54％＞80 38％*非轉(zhuǎn)化的Ler-FRI，沒有FLC1功能，在形成12-14片蓮座葉后開花，引入了1份或多份FLC1拷貝的轉(zhuǎn)基因植物中92％在形成了3倍于以上葉數(shù)后才開花。測(cè)定開花前的葉數(shù)作為開花時(shí)間指標(biāo)。因此，在該品系內(nèi)引入FLC1基因統(tǒng)一地改變了植物性狀，使其開花延遲了6倍。數(shù)個(gè)品系始終不開花。
表4以FLC1轉(zhuǎn)化的含F(xiàn)RI植物的生物量增加*品系 鮮重Ler-FRI 1.5g(.14)211-31轉(zhuǎn)化的Ler-FRI 15.5g(2.1)*以FLC1轉(zhuǎn)化后，植物的鮮重增加了10倍。括弧內(nèi)的數(shù)字是標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表5以組成型FLC1轉(zhuǎn)化的Ler植物的開花時(shí)間*開花時(shí)的蓮座葉數(shù) 占轉(zhuǎn)化植物百分比7-10 30％10-20 35％＞20 35％*野生型Ler在形成7-8片葉時(shí)開花，70％第一代轉(zhuǎn)化子開花延遲，其中35％開花前的葉數(shù)是非轉(zhuǎn)化子的2倍。測(cè)定開花前的葉數(shù)作為開花時(shí)間指標(biāo)。因此，組成型表達(dá)FLC1的該品系的開花時(shí)間統(tǒng)一延遲了3倍以上。
表6FLC1與蕪菁FLC1同源基因之間的氨基酸相同性MADS區(qū)內(nèi)的相同性MADS區(qū)外的相同性總相同性BrFLC1A 88％ 81％ 83％BrFLC1B 93％ 81％ 85％*在以上比較中，氨基酸1-60被認(rèn)定為MADS區(qū)。因?yàn)榧易宄蓡T間在MADS區(qū)內(nèi)高度保守，所以給出了MADS區(qū)內(nèi)和區(qū)外的相同性。
表7FLC1與FLC2和FLC3之間的氨基酸相同性MADS區(qū)內(nèi)的相同性MADS區(qū)外的相同性總相同性FLC283％ 50％60％FLC383％ 50％60％*在以上比較中，氨基酸1-60被認(rèn)定為MADS區(qū)。因?yàn)榧易宄蓡T間在MADS區(qū)內(nèi)高度保守，所以給出了MADS區(qū)內(nèi)和區(qū)外的相同性。
表8flc2失能突變對(duì)開花時(shí)間的影響品系 開花時(shí)的蓮座葉數(shù)范圍長(zhǎng)日照--野生型 8-9長(zhǎng)日照--flc2-1 6-7長(zhǎng)日照--flc2-2 6-7短日照--野生型 25-30短日照--flc2-1 7-9短日照--flc2-2 9-11實(shí)施例7FLC2過表達(dá)延遲擬南芥開花為了評(píng)價(jià)FLC2過表達(dá)對(duì)開花時(shí)間的作用，將FLC2基因組編碼區(qū)置于組成型35S啟動(dòng)子調(diào)控下，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，316，1194，1993)將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中。結(jié)果見表9。和FLC1一樣，F(xiàn)LC2過表達(dá)足以延遲開花。許多轉(zhuǎn)化植株開花期的葉數(shù)是對(duì)照的2-3倍。
表9FLC2過表達(dá)對(duì)開花時(shí)間的作用*開花時(shí)的蓮座葉數(shù)占轉(zhuǎn)化植物百分比12-16 55％17-33 45％*非轉(zhuǎn)化的野生株在8-9葉時(shí)開花。
綜合該試驗(yàn)的數(shù)據(jù)可確認(rèn)FLC家族基因在植物內(nèi)起延遲開花的作用。以上數(shù)據(jù)表明在許多(即使不是大多數(shù))植物中有一個(gè)以上天然FLC基因。雖然FLC基因與其他開花時(shí)間基因諸如FRI基因相互作用，但僅FLC基因就能夠改變植物開花的時(shí)間。FLC基因編碼的蛋白質(zhì)具有高度的種內(nèi)和種間序列相同性，而且，一個(gè)品種的FLC在其他品種中也有效。本發(fā)明由此提供了一種有用的工具，可操縱或協(xié)助控制多種植物的開花時(shí)間。
本發(fā)明分別引用并參考了在此引用的各篇專利、專利申請(qǐng)、出版物，以及核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)目錄，包括BenBank的登錄號(hào)和EMBL的登錄號(hào)。需要理解的是，由于現(xiàn)有技術(shù)的限制，給出的數(shù)據(jù)中可能存在偶然的序列誤差或缺失，但并不影響數(shù)據(jù)的使用價(jià)值。本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，因此，不應(yīng)將本發(fā)明理解為僅限于說明性的實(shí)施例。
序列表<110>Amasino，RichardSchomburg，F(xiàn)ritzMichaels，ScottSung，Si-Bum<120>改變植物開花時(shí)間的方法<130>960296.96871<140>09/513，775<141>2000-02-25<150>60/121，572<151>1999-02-25<150>60/123，455<151>1999-03-05<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>797<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(588)<400> 1atg gga aga aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac aaa agt agc 48Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1 5 10 15cga caa gtc acc ttc tcc aaa cgt cgc aac ggt ctc atc gag aaa gct 96Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30cgt cag ctt tct gtt ctc tgt gac gca tcc gtc gct ctt ctc gtc gtc 144Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35 40 45tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat aac ctg gtc 192Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Asn Leu Val50 55 60aag atc ctt gat cga tat ggg aaa cag cat gct gat gat ctt aaa gcc 240Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65 70 75 80ttg gat cat cag 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Lys Lys Gly Met Ser His Arg165 170<210>5<211>768<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(534)<400>5atg ggt aga aaa aaa gtc gag atc aag cga atc gag aac aaa agt agt 48Met Gly Arg Lys Lys Val Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1 5 10 15cga caa gtc act ttc tcc aaa cga cgc aat ggt ctc atc gag aaa gct96Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30cga caa ctt tca att ctc tgt gaa tct tcc atc gct gtt ctc gtc gtc 144Arg Gln Leu Ser Ile Leu Cys Glu Ser Ser Ile Ala Val Leu Val Val35 40 45tcc ggc tcc gga aaa ctc tac aag tct gcc tcc ggt gac aac atg tca 192Ser Gly Ser Gly Lys Leu Tyr Lys Ser Ala Ser Gly Asp Asn Met Ser50 55 60aag atc att gat cgt tac gaa ata cat cat gct gat gaa ctt gaa gcc 240Lys Ile Ile Asp Arg Tyr Glu Ile His His Ala Asp Glu Leu Glu Ala65 70 75 80tta gat ctt gca gaa aaa act cgg aat tat ctg cca ctc aaa gag tta 288Leu Asp Leu Ala Glu Lys Thr Arg Asn Tyr Leu Pro Leu Lys Glu Leu85 90 95cta gaa ata gtc caa agc aag ctt gaa gaa tca aat gtc gat aat gca 336Leu 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1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其基因組中含有編碼FLC基因家族成員的轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間相對(duì)非轉(zhuǎn)基因同種植物發(fā)生了改變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物的開花早于非轉(zhuǎn)基因同種植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物的開花遲于非轉(zhuǎn)基因同種植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中的FLC基因家族成員選自擬南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和蕪菁的BrFLC1A和BrFLC1B。
5.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因植物的種子。
6.轉(zhuǎn)基因植物的種子，其基因組中含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)植物可表達(dá)啟動(dòng)子和植物FLC蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，該植物FLC蛋白(i)具有MADS盒區(qū)，(ii)其MADS盒區(qū)之外氨基酸序列與擬南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的相同性至少40％，而且(iii)當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達(dá)時(shí)，能夠有效延遲轉(zhuǎn)基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株。
7.由權(quán)利要求6所述種子長(zhǎng)成的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的種子，其中FLC蛋白質(zhì)MADS盒區(qū)之外的氨基酸序列與FLC1的相同性至少50％。
9.一種轉(zhuǎn)基因植物的種子，其基因組中含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)植物可表達(dá)啟動(dòng)子和植物FLC蛋白質(zhì)家族成員的編碼區(qū)，所述的FLC蛋白質(zhì)家族成員在系統(tǒng)發(fā)育上與擬南芥FLC1或FLC2蛋白質(zhì)的相關(guān)性比擬南芥的任何其他MADS盒區(qū)更密切。
10.由權(quán)利要求9所述的種子培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)基因植物。
11.一種轉(zhuǎn)基因植物的種子，其基因組中含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)植物可表達(dá)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與植物FLC蛋白質(zhì)編碼序列足夠部分的互補(bǔ)序列操作性連接，以降低由該種子長(zhǎng)成的植株內(nèi)內(nèi)源性FLC蛋白質(zhì)活性水平，所述的植物FLC蛋白質(zhì)(i)具有MADS盒區(qū)，(ii)其MADS盒區(qū)之外氨基酸序列與擬南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的相同性至少40％，而且(iii)當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠有效延遲轉(zhuǎn)基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株。
12.一段分離的核苷酸序列，包含擬南芥FLC1基因即SEQ ID NO1的編碼序列。
13.一段分離的DNA序列，包含編碼擬南芥FLC1蛋白質(zhì)即SEQ ID NO2的DNA序列。
14.一種基因構(gòu)建物，包含一個(gè)植物可表達(dá)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與FLC基因家族蛋白質(zhì)的編碼序列操作性連接，所述的植物FLC蛋白質(zhì)(i)具有MADS盒區(qū)，(ii)其MADS盒區(qū)之外氨基酸序列與擬南芥FLC1(SEQ ID NO2)或FLC2(SEQ IDNO4)的相同性至少40％，而且(iii)當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠有效延遲轉(zhuǎn)基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株。
15.一種植物，其基因組中含有權(quán)利要求14所述的基團(tuán)構(gòu)建物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的基因構(gòu)建物，其中的FLC蛋白質(zhì)選自擬南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和蕪菁的BrFLC1A和BrFLC1B。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的基因構(gòu)建物，其中植物FLC基因其氨基酸序列與擬南芥FLC1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)的相同性至少50％。
18.一種基因構(gòu)建物，包含一個(gè)植物可表達(dá)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與植物FLC蛋白質(zhì)編碼序列足夠部分的互補(bǔ)序列操作性連接，以降低由該種子長(zhǎng)成的植株內(nèi)內(nèi)源性FLC蛋白質(zhì)活性水平，所述的植物FLC蛋白質(zhì)(i)具有MADS盒區(qū)，(ii)其氨基酸序列與擬南芥FLC1即SEQ ID NO1的相同性至少40％，而且(iii)當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠有效延遲轉(zhuǎn)基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株。
19.一種轉(zhuǎn)基因植物，含有FLC基因家族成員的轉(zhuǎn)基因，培養(yǎng)于相同的條件下時(shí)，該基因修飾植物的開花比相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株早或遲至少7天。
20.一種生產(chǎn)改變了開花時(shí)間的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將植物細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因接觸，該轉(zhuǎn)基因包含植物可表達(dá)啟動(dòng)子和植物FLC基因；鑒定插入有該轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞；由該植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉數(shù)比相同基因背景的非轉(zhuǎn)基因植株少或多10％，所述的葉數(shù)是轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)于相同條件下測(cè)定的。
全文摘要
本發(fā)明提供開花基因座(FLC)基因家族的基因鑒定,并利用有關(guān)信息來調(diào)節(jié)植物開花的時(shí)間。這一信息可用來生成轉(zhuǎn)基因植物,其開花時(shí)間被選擇性地改變。由于這些基因原本的作用是延遲開花,所以,增強(qiáng)FLC蛋白質(zhì)的活性將延遲開花時(shí)間,抑制FLC活性則將開花時(shí)間提前。本發(fā)明描述了該基因家族一定數(shù)量的樣品,具有一定代表性。本發(fā)明證明,該基因家族的成員在其他品種的植物中同樣有效。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1346408SQ00804291
公開日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月25日
發(fā)明者R·M·阿馬西諾, F·M·尚伯格, S·D·邁克爾斯, S·B·宋, K·斯科特科 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)