專利名稱：葡萄糖脫氫酶融合蛋白及其在表達(dá)系統(tǒng)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括一種具有葡萄糖脫氫酶(GlcDH)的生物活性的蛋白序列作為一種成分的新重組蛋白，并且涉及其用于簡(jiǎn)單的和有效的檢測(cè)任何優(yōu)選地作為融合伙伴的蛋白/多肽的應(yīng)用，以及快速優(yōu)化能夠表達(dá)所說(shuō)的蛋白/多肽的表達(dá)系統(tǒng)的用途。
在這方面，GlcDH或具有GlcDH的生物活性的序列承擔(dān)標(biāo)記物或檢測(cè)器蛋白的作用。此酶的一個(gè)特別的特征是對(duì)諸如SDS的變性劑的異常的穩(wěn)定性。GlcDH作為標(biāo)記物或檢測(cè)蛋白，甚至在還原和變性條件的SDS-PAGE之后表現(xiàn)不減少的酶活性。因此，使用一種基于這一令人驚訝之行為的敏感性酶反應(yīng)，可以檢測(cè)包括GlcDH的融合蛋白。因此，以GlcDH作為標(biāo)記物，快速地、低成本地和有效地檢測(cè)所要求的表達(dá)蛋白是可能的。
在許多情況下，GlcDH-蛋白/多肽融合蛋白以比沒有GlcDH更高的產(chǎn)量和穩(wěn)定性表達(dá)，也是可能的，特別是在E.coli中。因此，相應(yīng)的蛋白本身可被用于獲取和制備蛋白/多肽。
重組蛋白的體內(nèi)表達(dá)在生物技術(shù)中發(fā)揮的作用正在不斷增加。從諸如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原核和真核表達(dá)系統(tǒng)獲取、純化和檢測(cè)所克隆的基因的產(chǎn)物的能力，也經(jīng)常被用于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究，蛋白-蛋白和蛋白-DNA相互作用的研究，以及抗體生產(chǎn)和突變。借助于DNA重組技術(shù)特異性地修飾天然蛋白從而改善或改變其功能是可能的。重組蛋白在被連續(xù)地深入發(fā)展的，并且在此系統(tǒng)中許多不同地方可以被優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)中合成。
重組蛋白合成的總過(guò)程可被分成兩部分。在第一步中有該基因的分子生物學(xué)分離和該靶蛋白的表達(dá)，在第二步中有從重組細(xì)胞或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基檢測(cè)和純化。在分子水平上，將蛋白的基因克隆到為此目的所提供的表達(dá)載體中，然后插入宿主細(xì)胞(原核或真核細(xì)胞)并在其中表達(dá)。細(xì)菌細(xì)胞在此線路中被證明是提供高產(chǎn)量的簡(jiǎn)單的和有成本效益的表達(dá)系統(tǒng)。最常使用的宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌E.coli。
外源基因在E.coli中表達(dá)的目標(biāo)是獲得最大可能量的生物活性重組蛋白，這被稱為超量表達(dá)。已知真核外源蛋白在此期間可能通過(guò)聚集，作為包函體，通過(guò)不正確的折疊或蛋白水解性降解，失去其生物活性。避免這些經(jīng)常出現(xiàn)的困難的一種可能，是所表達(dá)的蛋白作為分泌蛋白從細(xì)胞排出，或者使用所謂的融合蛋白，通過(guò)它不溶性重組蛋白可以可溶性形式存在于細(xì)胞中。
為了研究蛋白的功能和其對(duì)此功能重要的相互作用伙伴的功能，通常在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白。對(duì)此功能重要的翻譯后修飾，和正確的區(qū)室作用可以在其中進(jìn)行。此外，存在對(duì)正確折疊和加工重要的其它蛋白。
真核表達(dá)系統(tǒng)也適合于表達(dá)相對(duì)大的蛋白和正確折疊要求諸如S-S橋形成、糖基化和磷酸化等轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白。因?yàn)檫@些系統(tǒng)通常是復(fù)雜而昂貴的，并且表達(dá)速率低于E.coli的表達(dá)速率，所以擁有一個(gè)快速、可靠、敏感和價(jià)格合理的檢測(cè)系統(tǒng)特別重要。
存在眾多檢測(cè)已經(jīng)通過(guò)重組形成的，并且其生物功能未知的外源蛋白的基因融合系統(tǒng)。在這些中，所表達(dá)的融合蛋白經(jīng)由功能已知的融合蛋白部分來(lái)檢測(cè)。
為了確定正確的表達(dá)、所表達(dá)的量、分子量和所形成的融合蛋白的功能活性，一種敏感的檢測(cè)系統(tǒng)是必要的。功能未知的蛋白的數(shù)量正在快速地增加，為其開發(fā)快速和有成本效益的檢測(cè)系統(tǒng)正變得越來(lái)越重要。對(duì)于多數(shù)基因融合系統(tǒng)，使用了諸如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或Western印跡的免疫學(xué)方法，其中通過(guò)重組形成的融合蛋白借助于特異性抗體檢測(cè)。
然而，相應(yīng)的融合蛋白不僅有所述的優(yōu)點(diǎn)，即外源蛋白可容易地間接檢測(cè)和分析；相反地，在許多情況下，他們?cè)试S所要求的蛋白以比沒有其融合伙伴之情形更高的產(chǎn)量表達(dá)。每一種融合伙伴都有優(yōu)點(diǎn)，在一個(gè)特別的表達(dá)系統(tǒng)中，不是不常見能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)移給另一種融合伙伴。因此，例如，一些蛋白對(duì)蛋白水解性[sic]降解的敏感性，當(dāng)它是融合蛋白之形式[sic]時(shí)，可被降低。與單個(gè)成分比較，融合蛋白還常常具有比單個(gè)成分更良好的溶解性和分泌特性。
因此，有許多在異源宿主中進(jìn)行基因融合表達(dá)重組蛋白的原因。這些原因有提高外源蛋白的溶解性，提高可溶性外源蛋白的穩(wěn)定性，將外源蛋白定位在細(xì)胞的特定部分，利用已簡(jiǎn)化的純化策略快速分離外源蛋白，融合蛋白被特異性切除的可能性，快速檢測(cè)來(lái)自未純化的細(xì)胞提取物的外源蛋白。
當(dāng)前，有許多借助于基因融合系統(tǒng)測(cè)試重組蛋白表達(dá)的功能測(cè)試。這些包括通常使得從未純化的細(xì)胞提取物的直接檢測(cè)成為可能的簡(jiǎn)單測(cè)試。然而，測(cè)試系統(tǒng)在花費(fèi)的時(shí)間、處理量和敏感性上有相當(dāng)?shù)牟町悺?br> 就上述目的而言，區(qū)別兩種類型的融合蛋白是可能的。在一方面，融合蛋白由所要求的蛋白和一個(gè)通常短的寡肽所組成。這種寡肽(“標(biāo)記”)起所要求的蛋白的標(biāo)記物或識(shí)別序列的作用。另外，標(biāo)記可簡(jiǎn)化純化。
標(biāo)記的主要用途首先在于表達(dá)的測(cè)試，其次在于蛋白純化。其中一個(gè)實(shí)例是由有6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基并被直接連接到重組蛋白上的一條肽所組成的所謂的組氨酸標(biāo)記(His tag)。借助于所結(jié)合的組氨酸殘基，在金屬親和柱(Smith等，1988)上純化融合蛋白是容易地可能的。這種組氨酸標(biāo)記簡(jiǎn)單地借助于高度特異性單克隆抗體His-1(Pogge v.Strandmann等，1995)檢測(cè)。另一種在融合蛋白中使用的標(biāo)記物是GFP，一種從水母Aequorea victoria衍生而來(lái)，并在各種生物技術(shù)應(yīng)用中用做生物發(fā)光蛋白(Kendall和Badminton，1998；Chalfie等，1994；Inouye等，1994)的綠色熒光蛋白(GFP)。它可利用其在活細(xì)胞、凝膠、甚至活動(dòng)物中的自身熒光容易地檢測(cè)。
標(biāo)記的進(jìn)一步的實(shí)例，是鏈親合素-標(biāo)記(Strep-tag)系統(tǒng)(Uhlen等，1990)或myc表位標(biāo)記(Pitzurra等，1990)，這些將不會(huì)被進(jìn)一步解釋。
由重組蛋白和功能性活性蛋白所組成的融合蛋白的主要用途，除了以上所述的檢測(cè)之外，在于所表達(dá)的蛋白的簡(jiǎn)化的純化。在這些當(dāng)中，各種系統(tǒng)是公知的，其中一些在下文中將會(huì)被簡(jiǎn)要地論及。
在GST系統(tǒng)中，融合載體使得表達(dá)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合的完整基因或基因片段成為可能。GST融合蛋白可以通過(guò)在谷胱甘肽-Sepharose上進(jìn)行親和層析容易地從細(xì)胞裂解物中純化(Smith，Johnson，1988)。生化或免疫學(xué)檢測(cè)是可以利用的。MBP系統(tǒng)中的麥芽糖結(jié)合蛋白是一種來(lái)自E.coli、涉及運(yùn)輸麥芽糖和麥芽糖糊精通過(guò)細(xì)菌膜的周質(zhì)蛋白(Kellermann等，1982)。它已被特別用于表達(dá)和在交聯(lián)的直鏈淀粉柱上純化堿性磷酸酶。內(nèi)蛋白子(intein)系統(tǒng)特別適合靶蛋白的快速純化。內(nèi)蛋白子基因具有內(nèi)蛋白子幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(intein chitin binding domain)(CBD)的序列，通過(guò)它可以使融合蛋白直接從細(xì)胞提取物結(jié)合到幾丁質(zhì)柱上，并因此被純化(Chong等，1997)。
葡萄糖脫氫酶(GlcDH)在Bacillus megaterium中孢子形成的早期是一種關(guān)鍵酶(Jany等，1984)。它以NAD+或NADP+作為輔酶，特異性催化β-D-葡萄糖到D-葡糖酸內(nèi)酯的氧化。除了細(xì)菌孢子之外，此酶還存在于哺乳動(dòng)物的肝。在B.megaterium M1286中存在兩種相互獨(dú)立的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)(Heimann等，1988)。GdhA和gdhB在核苷酸序列上有相當(dāng)?shù)牟町?，但是GlcDH-A和GlcDH-B盡管在蛋白序列上有差異，卻有大致相同的底物特異性。也會(huì)被發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的信息和相應(yīng)的DNA和氨基酸序列，例如，在EP-B0290768中。
以上所描述的檢測(cè)通過(guò)重組形成的并且其生物功能未知或不充分公知的外源蛋白的系統(tǒng)，通常是復(fù)雜和費(fèi)時(shí)的。這意味著表達(dá)條件的改善和優(yōu)化經(jīng)常不能足夠快地或者簡(jiǎn)單地完成。
因此，已經(jīng)開發(fā)了一種使得融合蛋白的更快檢測(cè)成為可能的，并且沒有在現(xiàn)有技術(shù)的狀況中所描述的可以比較的系統(tǒng)的缺點(diǎn)的融合蛋白伙伴，這是一項(xiàng)巨大的進(jìn)步。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包括GlcDH或[lancuna]GlcDH的生物活性的序列的融合蛋白，突出地適合于檢測(cè)任何所要求的“外源或靶蛋白”，比使用所述的現(xiàn)有技術(shù)的方法更加快速、簡(jiǎn)單，并因此更加有效。這個(gè)特性基于一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)—在其它酶失活的條件下GlcDH保留其酶活性(例如，進(jìn)行SDS-PAGE)。
在固定化的染料上，例如Cibachron Blue 3G或者其它由于其結(jié)構(gòu)因而與NAD+輔酶相似的并且同樣能結(jié)合所有的脫氫酶的類似NAD的化合物，例如氨己基-AMP，純化脫氫酶的可能性是公知的。
因此，作為融合蛋白的部分，葡萄糖由于其對(duì)，例如，固定在凝膠上，并且可商品化獲得的染料的親和性，促進(jìn)了融合蛋白在一步中純化。通過(guò)將酶反應(yīng)與一個(gè)敏感的顏色反應(yīng)偶聯(lián)，檢測(cè)作為融合蛋白的成分的GlcDH也是可能的，優(yōu)選地用碘代苯基-硝基苯基-苯四唑鹽(INT)或氮藍(lán)四唑(NBT)(在規(guī)定的條件下)，這些進(jìn)一步簡(jiǎn)化了外源蛋白的間接檢測(cè)。另外染色作為標(biāo)記酶的GlcDH的方法，具有不妨礙在相同凝膠上使用諸如考馬斯染料或銀染色的習(xí)慣性蛋白染色的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除GlcDH和外源蛋白之外，融合蛋白也含有一種可用于結(jié)合此標(biāo)記肽的蛋白的額外鑒定的標(biāo)記肽。例如，通過(guò)聚組氨酸標(biāo)記進(jìn)行鑒定，此聚組氨酸標(biāo)記作為抗原被特異性抗體識(shí)別。此后檢測(cè)所產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物，例如，使用一種過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗體經(jīng)由本身公知的方法進(jìn)行。結(jié)合的過(guò)氧化物酶在加入一種合適的底物(例如ECL系統(tǒng)，Western曝光化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，獲自Amersham)之后，產(chǎn)生一種使用適合于該目的之膜可以被檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物。然而，免疫檢測(cè)也能夠利用一種本身公知的技術(shù)，通過(guò)一種特異性抗體標(biāo)記進(jìn)行，例如myc標(biāo)記。聚組氨酸標(biāo)記，單獨(dú)或與myc標(biāo)記聯(lián)合，另外具有融合蛋白可以通過(guò)結(jié)合金屬螯合柱被純化的優(yōu)點(diǎn)。
然而，GlcDH融合蛋白也能夠直接利用親和層析，在一種已經(jīng)，例如，被固定于諸如瓊脂糖的層析凝膠上的特異性抗-GlcDH抗體上，被純化和分離。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是GlcDH能夠以可溶性形式高產(chǎn)量地表達(dá)，優(yōu)選地在E.coli中利用公知的表達(dá)系統(tǒng)(見上文)。因此，已經(jīng)成功地在E.coli中表達(dá)了來(lái)自Bacillus megaterium M1286的具有高的酶活性的重組葡萄脫氫酶(Heilmann 1988)。其它真核基因在E.coli中表達(dá)，經(jīng)常被多肽鏈在細(xì)菌宿主中的不穩(wěn)定性限制。不正確的折疊可導(dǎo)致聚集(“包函體”)，降低或缺乏生物活性，以及蛋白水解性降解。一種相應(yīng)的融合基因，其中GlcDH基因或具有GlcDH之生物活性的片段已經(jīng)連接到所要求的蛋白的基因上，現(xiàn)在可以根據(jù)本發(fā)明，以與沒有融合伙伴的GlcDH基因相比較實(shí)際上沒有改變的表達(dá)速率和產(chǎn)量轉(zhuǎn)變成融合蛋白。當(dāng)外源蛋白的單獨(dú)表達(dá)在本身上不可能，或者可能僅在以降低的產(chǎn)量或僅在以不正確的折疊狀態(tài)或僅在通過(guò)使用另外的技術(shù)才可能的時(shí)候，這也可進(jìn)行。因此，利用隨后的標(biāo)記蛋白GlcDH的消除或者靶蛋白的消除，例如使用內(nèi)切蛋白酶，獲得所要求的外源蛋白是可能的。
根據(jù)本發(fā)明的，能夠作為融合蛋白與GlcDH一起在E.coli中成功表達(dá)的一個(gè)實(shí)例是tridegin。Tridegin是血液凝集因子VIIIa的極其有效的肽抑制劑，由水蛭Haementeria ghilianii衍生而來(lái)(66AA，7.6kD；Finnery等，1997)。
然而，根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于所使用的外源蛋白的特性和屬性，沒有限制要被提及。
本發(fā)明不是僅僅限定于根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白在E.coli中表達(dá)。相反地，這樣的蛋白也能夠使用本身公知的方法和合適的穩(wěn)定載體構(gòu)建體(例如借助于人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母或昆蟲細(xì)胞以良好的表達(dá)速率有利地合成。
從上文的描述在下列的和在權(quán)利要求書中所說(shuō)明的總結(jié)中，說(shuō)明本發(fā)明的特征是可能的因此，本發(fā)明涉及一種由至少第一和第二氨基酸序列所組成的重組融合蛋白，第一序列具有葡萄糖脫氫酶的生物活性。本發(fā)明特別涉及一種相應(yīng)的在其中所說(shuō)的第二序列是任何重組蛋白/多肽X或代表其部分的重組融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白可以另外包括識(shí)別序列，特別是標(biāo)記序列。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種相應(yīng)的可以另外具有至少一種適合于檢測(cè)的其它標(biāo)記序列或識(shí)別序列的融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白具有廣泛的可能用途。在此方面，具有其屬性的葡萄糖脫氫酶發(fā)揮至關(guān)緊要的作用。因此，本發(fā)明涉及葡萄糖脫氫酶作為在一種所說(shuō)的融合蛋白中的任何重組蛋白/多肽X的檢測(cè)器蛋白的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及葡萄糖脫氫酶在作為一種相應(yīng)的重組融合蛋白之成分的重組蛋白/多肽X表達(dá)的檢測(cè)系統(tǒng)中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及GlcDH檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的用途，在這里一種伙伴(partner)對(duì)應(yīng)于如上文和下文所定義的重組蛋白/多肽X。最后，根據(jù)本發(fā)明GlcDH可作為任何不是此融合蛋白的成分但是能夠結(jié)合所說(shuō)的融合蛋白中的蛋白/多肽X的第二序列的第三蛋白/多肽的檢測(cè)器蛋白。GlcDH可進(jìn)一步在ELISA系統(tǒng)，Western印跡和相關(guān)系統(tǒng)中用做伙伴的標(biāo)記蛋白。
因?yàn)楸景l(fā)明使用重組技術(shù)，它當(dāng)然也包括相應(yīng)的載體，宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明不僅涉及如此這些載體和宿主細(xì)胞本身，還涉及在一種重組的制備方法中相應(yīng)的表達(dá)載體在優(yōu)化重組蛋白/多肽X的表達(dá)中的用途，以及在這樣一種制備方法中相應(yīng)的宿主細(xì)胞在優(yōu)化重組蛋白/多肽X表達(dá)中的用途。
本發(fā)明還涉及一種利用凝膠電泳，特別是SDS-PAGE凝膠電泳，快速檢測(cè)任何重組蛋白/多肽X的方法，在這里相應(yīng)的融合蛋白利用凝膠電泳制備和分級(jí)分離，并且通過(guò)葡萄糖脫氫酶的酶活性在凝膠中顯示所要檢測(cè)的重組蛋白/多肽。
根據(jù)本發(fā)明在此方面中被用來(lái)檢測(cè)葡萄糖脫氫酶的酶活性的是一種以四唑鹽為基礎(chǔ)的顏色反應(yīng)，特別是碘代苯基硝基苯-苯四唑鹽(INT)，或氮藍(lán)四唑鹽(NBT)，隨后若需要根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的一種普通的蛋白染色在所說(shuō)的顏色反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生之前或之后合適的地方進(jìn)行[sic]是可能的。
附圖簡(jiǎn)要解釋如下


圖1.載體pAW2的構(gòu)建流程圖。此載體含有GlcDH的序列。完整序列在序列1中描述。
圖2.載體pAW3的構(gòu)建流程圖。
圖3.載體pAW4的構(gòu)建流程圖。此載體含有GlcDH和tridegin的序列。完整序列在序列3中描述。
圖4.GlcDH在SDS-PAA凝膠上染色。染色方法在實(shí)施例中詳細(xì)地描述。1Rainbow標(biāo)準(zhǔn)參考物；20.1μg GlcDH；30.05μg GlcDH；40.001μg GlcDH；5HC11細(xì)胞的裂解物；6預(yù)先染色的SDS標(biāo)準(zhǔn)參考物。
圖5.表達(dá)的GlcDH酶的檢測(cè)(15％SDS-PAA凝膠，INT染色)；1Rainbow標(biāo)準(zhǔn)參考物；20.2μg天然GlcDH；310μl細(xì)胞提取物/1ml克隆2懸液；410μl細(xì)胞提取物/1ml克隆1懸液；5預(yù)先染色的SDS標(biāo)準(zhǔn)參考物；細(xì)胞提取物體積100μl。
圖6.pAW2表達(dá)的系列稀釋(15％SDS-PAA凝膠，INT染色)；1Rainbow標(biāo)準(zhǔn)參考物；210μl細(xì)胞提取物/100μl懸液；310μl細(xì)胞提取物/1∶5稀釋；410μl細(xì)胞提取物/1∶10稀釋；510μl細(xì)胞提取物/1∶20稀釋；60.5μg GlcDH；7廣范圍SDS標(biāo)準(zhǔn)參考物；8預(yù)先染色的SDS-標(biāo)準(zhǔn)參考物；細(xì)胞提取物體積100μl。
圖7.表達(dá)的tridegin/GlcDH融合蛋白檢測(cè)(10％SDS-PAA凝膠，INT/CBB)；1廣范圍SDS標(biāo)準(zhǔn)參考物；21μg GlcDH；30.5μg GlcDH；40.1μg GlcDH；5500μl細(xì)胞提取物；6200μl細(xì)胞提取物；7100μl細(xì)胞提取物；8500μl細(xì)胞提取物(pAW2表達(dá))；細(xì)胞提取物體積100μl。
圖8.tridegin/His和tridegin/His/GlcDH融合蛋白的免疫檢測(cè)(來(lái)自10％SDS-PAA凝膠，ECL檢測(cè))并與tridegin/His/GlcDH(10％SDS-PAA凝膠，INT-CBB染色)比較；1廣范圍標(biāo)準(zhǔn)參考物；21ml細(xì)胞裂解物(pAW2表達(dá))；3100μl細(xì)胞提取物(pST106表達(dá))；4200μl細(xì)胞提取物(pST106表達(dá))；5300μl細(xì)胞提取物(pAW4表達(dá))；62.5μg calin-His陽(yáng)性對(duì)照；7廣范圍標(biāo)準(zhǔn)參考物；8100μl[lacuna](pAW4表達(dá))；細(xì)胞提取物體積100μl。
圖9.解釋GlcDH檢測(cè)的敏感性的SDS-凝膠。1，5，10，25和50ngGlcDH和分子量標(biāo)準(zhǔn)參考物(左欄)作圖。在上文和下文使用的縮寫解釋如下A 腺嘌呤Ax在x nm處的吸收Ab 抗體Amp 氨芐青霉素AP 堿性磷酸酶APS 過(guò)硫酸銨AA 氨基酸bla β-內(nèi)酰胺酶基因BIS N，N′-亞甲雙丙烯酰胺bp 堿基對(duì)BSA 牛血清白蛋白C胞嘧啶cDNA 拷貝(互補(bǔ))DNACBB 考馬斯亮藍(lán)CIP 牛小腸磷酸酶dNTP 2′-脫氧(核糖)核苷[sic]5′-三磷酸ddNTP2′，3′-脫氧(核糖)核苷[sic]5′-三磷酸DMF 二甲基甲酰胺DMSO 二甲亞砜DNA 脫氧核糖核酸dsDNA雙鏈DNADTT 二硫蘇糖醇ECL ExposureTM化學(xué)發(fā)光EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸，2鈉鹽ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定EtBr 溴化乙錠EtOH 乙醇f.c. 最終濃縮FACS 熒光激活細(xì)胞分類術(shù)G鳥嘌呤GFP 綠色熒光蛋白GlcDH葡萄糖脫氫酶(蛋白)gdh 葡萄糖脫氫酶(基因)GST 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶His 組氨酸殘基HRP 辣根過(guò)氧化物酶IB 包函體(inclusion body)IgG 免疫球蛋白GINT 碘代硝基四唑紫kb 千堿基對(duì)kD 千道爾頓mA 毫安m-RNA 信使RNAMBP 麥芽糖結(jié)合蛋白MCS 多克隆位點(diǎn)Mr 相對(duì)分子量NAD(P) 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)，游離酸Odx 在x nm處的光密度OmpA外膜蛋白Aori 復(fù)制起點(diǎn)PAA 聚丙烯酰胺PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)POD 過(guò)氧化物酶PVDF聚偏[二]氟乙烯RNA 核糖核酸RNAse 核糖核酸酶rpm 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rRNA 核糖體RNART 室溫SDS 十二烷基硫酸鈉ssDNA單鏈DNAStrep鏈親合素T胸腺嘧啶Tm 解鏈溫度(DNA雙鏈)t-RNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNATaq Thermophilus[sic]aquaticusTCA 三氯乙酸TEMEDN，N，N′，N′-四甲基乙二胺Tet 四環(huán)素Tris 三(羥甲基)氨基甲烷U酶活性的單位U尿嘧啶UV 紫外線ON 過(guò)夜V伏特VIS 可見的w/v 體積/重量參考文獻(xiàn)Aoki等(1996)，歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Letters)384，193-197Banauch等(1975)，Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.13卷，101-107Bertram，& Gassen(1991)Gentechnische Methoden，EineSammlung von Arbeitsanleitungen fur das molekularbiologischeLabor.Gustav Fischer Verlag，斯圖加特(Stuttgart)，耶拿(Jena)，紐約(New Nork)Brewer & Sassenfeld(1985)，生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends inBiotechnology)3，第5期，119-122Brown，T.A.(1993)Gentenchnologie fur EinsteingerGrundlagen，Methoden，Anwendungen.Spektrum AkademischerVerlag，海德爾堡(Heidelberg)；柏林(Berlin)；牛津(Oxford)Casadaban等(1990)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)100，293Chalfie等(1994)，科學(xué)(Science)263，802-805Chong，S.等(1997)，基因(Gene)192，271-281Collins-Racie等(1995)，生物技術(shù)(Biotechnology)13，982-987Di Guan等(1998)，基因(Gene)67，21-30Ettinger等(1996)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，13102-13107Finney等(1997)，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)324，797-805Gazitt等(1992)，免疫學(xué)方法雜志(Journal of ImmunologicalMethods)148，159-169Ghosh等(1995)，分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)255，376-378Goddel等(1979)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76，106-110Hafner & Hoff(1984)，Genetik.Neubearbeitung，Schrodel-Verlag，漢諾威(Hanover)Harlow & Lane(1988)，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港(Cold Spring Harbor)Harris & Angal(1990)，蛋白質(zhì)純化應(yīng)用實(shí)用方法(ProteinPurification applicationsa practical approach。牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)，牛津(Oxford)，紐約(New York)，東京(Tokyo)
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本發(fā)明在下文中被進(jìn)一步描述。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在實(shí)施例中解釋。
巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)GlcDH結(jié)構(gòu)基因用質(zhì)粒pJH115作為模板通過(guò)PCR進(jìn)行修飾(EP0290768)。被擴(kuò)增的片段(0.8kb)，在一個(gè)末端有一個(gè)Pst I識(shí)別序列，并且在另一末端有一個(gè)Eco47III識(shí)別序列，此片段被這些酶消化并克隆到細(xì)胞質(zhì)(pRG45)或細(xì)胞周質(zhì)(pST84)E.coli表達(dá)載體(
圖1和2)中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒，pAW2和pAW3，現(xiàn)在具有編碼一個(gè)大約30kD(261AA)的蛋白并且定位于強(qiáng)Tet啟動(dòng)子下游的GlcDH基因。細(xì)胞質(zhì)pAW2表達(dá)載體具有一個(gè)大約4kb的大小。細(xì)胞周質(zhì)pAW3分泌載體稍微更大，并且與pAW2的區(qū)別僅僅在于具有一條在多克隆位點(diǎn)(MCS)上游并且使得重組蛋白被分泌到細(xì)胞周質(zhì)成為可能的omp A信號(hào)肽序列。兩個(gè)載體都另外具有一個(gè)具有12個(gè)不同的限制性切割位點(diǎn)的MCS，這些限制性切割位點(diǎn)使得具有以下之組氨酸標(biāo)記的符合閱讀框的克隆成為可能。聚組氨酸(6His)標(biāo)記使得重組蛋白在一種金屬親合柱上被純化成為可能。載體pAW4最終包括利用MCS連接到一起的tridegn基因和GlcDH基因，和被連接到GlcDH基因下游的聚組氨酸(6His)標(biāo)記。各構(gòu)建體在
圖1，2和3中描述。然而，所選擇的質(zhì)粒構(gòu)建體僅僅作為實(shí)例，并不限制本發(fā)明。他們可以被其它合適的含有所提到的DNA序列的構(gòu)建體替換。載體與克隆的制備以及此蛋白的表達(dá)在實(shí)施例中被進(jìn)一步說(shuō)明。
在還原性SDS凝膠上進(jìn)行了[sic]天然GlcDH的活性染色的敏感性。就此目的而言，用天然GlcDH(c＝1mg/ml；A＝200U/ml)制備了系列濃度，并且制備了一種陰性對(duì)照。SDS-PAGE以及使用INT進(jìn)行活性染色產(chǎn)生了圖3中所描述的SDS凝膠。使用該測(cè)試檢測(cè)小到50ng濃度的GlcDH是可能的。陰性對(duì)照，不含有GlcDH，正如所預(yù)期的一樣沒有顯示條帶。
使用標(biāo)準(zhǔn)參照蛋白并且借助于校準(zhǔn)曲線，可以確定天然GlcDH的確切分子量。為此，測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白的相對(duì)遷移距離，并且對(duì)于他們各自的對(duì)數(shù)分子量作圖。
所實(shí)施的表達(dá)過(guò)程如流程圖中所描述(表1)表1
質(zhì)粒pAW2/克隆9(pAW2/K9)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli表達(dá)菌株W3110，并使用兩個(gè)來(lái)自于所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化平板的克隆接種5ml預(yù)培養(yǎng)。在主培養(yǎng)接種后2小時(shí)，用無(wú)水四環(huán)素進(jìn)行誘導(dǎo)。表達(dá)總體上持續(xù)了5h，并且克隆1在1.65的OD處而克隆2在1.63處使表達(dá)終止。在SDS-PAGE和GlcDH活性染色后，來(lái)自1ml細(xì)胞懸液之各個(gè)克隆都可以檢測(cè)到一條強(qiáng)的GlcDH條帶(大約35kD)。
當(dāng)SDS-PAGE在還原性條件和非還原性條件下進(jìn)行時(shí)，在所產(chǎn)生的GlcDH條帶之間沒有差異變得明顯。就此目的而言，在各種情況下通過(guò)使用INT進(jìn)行GlcDH活性染色，在SDS凝膠上研究了500到100μl的細(xì)胞懸液。
為了說(shuō)明與考馬斯染色比較的GlcDH活性染色的敏感性，制備了100μl細(xì)胞懸液，和1/5，1/10以及1/20稀釋的細(xì)胞懸液的樣品。各稀釋的最終體積同樣是100μl。在GlcDH活性染色之后，所產(chǎn)生的SDS凝膠被用于考馬斯染色從而進(jìn)一步顯示的蛋白條帶。由此產(chǎn)生的SDS凝膠在圖4中描述。使用GlcDH活性染色，在1/20稀釋處一條不同的條帶仍然是明顯的，而現(xiàn)在考馬斯染色的條帶幾乎不可檢測(cè)。
使用質(zhì)粒pST106作為模板，利用PCR修飾了具有偶聯(lián)的組氨酸標(biāo)記的Haementeria ghilianii tridegin結(jié)構(gòu)基因。擴(kuò)增的片段(0.25kb)，在其側(cè)翼是一個(gè)Cla I識(shí)別序列和一個(gè)Pst I識(shí)別序列，用這些酶消化該片段，并將其克隆到細(xì)胞質(zhì)E.coliGlcDH融合載體pAW2。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pAW4現(xiàn)在有了編碼一個(gè)大約44kD的蛋白并定位于強(qiáng)Tet啟動(dòng)子下游的tredegin-His-GlcDH融合蛋白基因。利用SDS-PAGE和GlcDH活性染色分析了來(lái)自于包括細(xì)胞質(zhì)pAW4質(zhì)粒的E.coli菌株W3110的細(xì)胞提取物。隨之，檢測(cè)在35，37，40和43kD紅-紫染色的數(shù)個(gè)條帶是可能的。43kD條帶包括所要求的tridegin-His-GlcDH融合蛋白，盡管它的分子量略微低于44kD的理論值。剩余的可以檢測(cè)的條帶可能是融合蛋白在E.coli中蛋白水解性降解所產(chǎn)生的，因?yàn)?5kD的最小染色條帶大約對(duì)應(yīng)于GlcDH的大小。在大小比較的基礎(chǔ)上，鑒定作為His-GlcDH降解產(chǎn)物所形成的35kD條帶是可能的。
進(jìn)行[sic]表達(dá)動(dòng)力學(xué)揭示，所形成的融合蛋白的蛋白水解性降解在用無(wú)水四環(huán)素誘導(dǎo)Tet啟動(dòng)子之后2小時(shí)開始，那就是說(shuō)，在此時(shí)間之后，另外的條帶利用活性染色在SDS凝膠上可被檢測(cè)。所形成的融合蛋白對(duì)E.coli蛋白酶不穩(wěn)定，這由相對(duì)快的蛋白降解說(shuō)明。通過(guò)使用構(gòu)建的細(xì)胞周質(zhì)GlcDH融合載體pAW3從而避免融合蛋白在細(xì)胞中蛋白水解性降解是可能的，因?yàn)樵谶@種情形下所表達(dá)的融合蛋白將會(huì)被分泌到在E.coli細(xì)胞之間的周質(zhì)間隙。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E.coli細(xì)胞蛋白酶主要在細(xì)胞質(zhì)。
GlcDH融合蛋白檢測(cè)的敏感性和特異性使得快速和簡(jiǎn)單地篩選重組蛋白成為可能。使用天然的GlcDH，測(cè)定了GlcDH檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性。在SDS-PAA凝膠上，天然的GlcDH活性的檢測(cè)在大約30-35kD產(chǎn)生了一條被染成紅-紫色的條帶。
利用pAW2在E.coli菌株W3110中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的重組GlcDH顯示了相同的分子量。通過(guò)比較條帶強(qiáng)度，天然GlcDH和重組GlcDH之間的敏感性比較是可能的。
開發(fā)的測(cè)試系統(tǒng)(見實(shí)施例)另外使得進(jìn)行SDS凝膠的雙染色成為可能。在第一次染色中有GlcDH條帶的特異性檢測(cè)。在背景染色之后可以進(jìn)行常規(guī)的蛋白染色，例如剩余蛋白的考馬斯染色。根據(jù)本發(fā)明，在還原性條件下存在SDS時(shí)，GlcDH令人驚訝地保留其完整的活性，這使得在SDS凝膠上快速檢測(cè)成為可能。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用氮藍(lán)四唑鹽(NBT)作為GlcDH的底物，提高GlcDH活性檢測(cè)的敏感性是進(jìn)一步可能的。然而，使用INT，GlcDH檢測(cè)的反應(yīng)速率，可通過(guò)使用Triton X-100(1％最終溶液)或加入NaCl(1M最終溶液)進(jìn)一步提高。
重組融合蛋白tridegin/His和tridegin/His/GlcDH，可通過(guò)pST106和pAW4質(zhì)粒的表達(dá)而獲得(
圖1和2)。細(xì)胞在相關(guān)的表達(dá)混合物中破碎之后，利用SDS-PAGE使樣品分級(jí)分離，并轉(zhuǎn)移到一張膜上。在Western印跡中，通過(guò)使用一種抗RGS.-組氨酸抗體，經(jīng)由存在于其中的組氨酸標(biāo)記，tridegin-His-GlcDH融合蛋白可以被免疫檢測(cè)。所使用的對(duì)照是純化的具有末端組氨酸標(biāo)記的重組calin(水蛭蛋白)，和表達(dá)的無(wú)組氨酸標(biāo)記的重組GlcDH的細(xì)胞提取物。此抗-RGS.組氨酸抗體能夠檢測(cè)一個(gè)在大約37kD的條帶和另一個(gè)在大約43kD的重組tridegin/His/GlcDH融合蛋白的條帶(圖6)。所獲得的條帶與在SDS-凝膠上活性染色之后所獲得條帶的大小比較證明43kD條帶代表tridegin-His-GlcDH融合蛋白而37kD條帶代表完整融合蛋白的His-GlcDH降解產(chǎn)物。calin/組氨酸標(biāo)記蛋白在大約26kD產(chǎn)生了一個(gè)條帶。略微更小的重組tridegin/組氨酸標(biāo)記蛋白在大約23kD產(chǎn)生了一個(gè)條帶，加上證明組氨酸抗體結(jié)合到其它被表達(dá)的蛋白的進(jìn)一步的條帶。因此，用抗-RGS.組氨酸抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)證明，在43kD檢測(cè)到的蛋白與在37kD檢測(cè)到的蛋白含有一個(gè)組氨酸標(biāo)記。此外，后一蛋白的大小大約對(duì)應(yīng)于偶聯(lián)了組氨酸標(biāo)記的GlcDH蛋白的理論大小(36.5kD)。
除了檢測(cè)重組tridegin的表達(dá)之外，在使用pAW4的特定情形之下，研究了tridegin作為tridegin-GlcDH融合蛋白之成分的生物活性。本測(cè)試基于天然水蛭腺體勻漿和純化的tridegin對(duì)因子VIIIaa的抑制(Finnery等，1997)。改進(jìn)的測(cè)試在實(shí)施例中描述。作為對(duì)照，用pST106表達(dá)了融合蛋白并用pAW2表達(dá)了GlcDH蛋白。此酶活性與不是作為GlcDH-tridegin融合蛋白就是作為tridegin-組氨酸標(biāo)記在E.coli表達(dá)中表達(dá)的重組tridegin比較，揭示了可以忽略的差異。另外，來(lái)自兩個(gè)不同表達(dá)的重組tridegin蛋白顯示了可與天然的水蛭腺體勻漿比較的生物活性。由此可以得出結(jié)論與GlcDH融合對(duì)于共表達(dá)的外源基因的生物活性毫無(wú)妨礙效應(yīng)。
Tridegin自身(也就是說(shuō)不是作為融合蛋白)在E.coli中表達(dá)之后沒有活性，并且以包函體形式形成。GlcDH在E.coli中表達(dá)產(chǎn)生了一種具有高比活和穩(wěn)定性的可溶形式的酶。在表達(dá)實(shí)驗(yàn)中已證明了，在E.coli中表達(dá)具有高溶解能力的蛋白，當(dāng)他們與外源蛋白融合時(shí)，提高了外源蛋白表達(dá)的溶解能力(LaVallie，1995)。在此情形中，tridegin與GlcDH的融合也提高了tridegin的溶解性，因?yàn)榭赡芾靡环Ntridegin抑制因子VIIIa的生物檢測(cè)，來(lái)檢測(cè)tridegin作為tridegin-His-GlcDH融合蛋白E.coli表達(dá)之后的活性。GlcDH融合蛋白以高產(chǎn)量在E.coli中表達(dá)。
所克隆的基因作為含有一種大小和生物功能已知的蛋白的融合蛋白表達(dá)的可能性，顯著地簡(jiǎn)化該基因產(chǎn)物的檢測(cè)。因?yàn)檫@個(gè)原因，正如在介紹中所提到的一樣，已經(jīng)用各種檢測(cè)策略開發(fā)了眾多融合表達(dá)系統(tǒng)。
公知的系統(tǒng)與根據(jù)本發(fā)明的E.coli中的GlcDH融合系統(tǒng)的比較見表2。在一些系統(tǒng)中，N-末端融合蛋白可從C-末端靶或外源蛋白切除(Collins-Racie等，1995)。
表2
根據(jù)本發(fā)明的GlcDH檢測(cè)系統(tǒng)的一個(gè)非常巨大的優(yōu)點(diǎn)是它不要求，例如對(duì)于Western印跡檢測(cè)，任何抗體或其它材料，例如膜，印跡裝置，顯影機(jī)器和膠卷，微量滴定板和滴定板讀出器等。這意味著使用GlcDH系統(tǒng)，進(jìn)行重組融合蛋白的檢測(cè)順利和快速地多。借助于GlcDH檢測(cè)，確定不僅關(guān)于所表達(dá)的蛋白的量的信息，而且關(guān)于直接在SDS-PAA凝膠上沒有轉(zhuǎn)移到膜上的融合蛋白的相應(yīng)的大小是可能的。如果GlcDH活性在融合蛋白中可以檢測(cè)，那么融合伙伴通常也應(yīng)該是功能上有活性的。GlcDH不妨礙融合伙伴的折疊。根據(jù)本發(fā)明的GlcDH融合蛋白系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)從文獻(xiàn)中選擇一種有效的分離和檢測(cè)在E.coli中獲得的融合蛋白的方法，顯示于下文中的一項(xiàng)比較(下文的表3)。
根據(jù)本發(fā)明的GlcDH融合蛋白系統(tǒng)又特別適合于提高作為包函體形成的，特別是在E.coli中，并因此使得此后的蛋白純化變得困難和費(fèi)代價(jià)的蛋白的溶解性。通常必須通過(guò)麻煩的方法，將作為包函體形成的蛋白轉(zhuǎn)變成它們的天然狀態(tài)。在根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的使用上，這是沒有必要的。
總之，根據(jù)本發(fā)明作為GlcDH檢測(cè)系統(tǒng)付諸使用的融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)如下·在SDS和還原性(變性)條件下穩(wěn)定·敏感的GlcDH特異性酶顏色測(cè)試·達(dá)到至少50ng的敏感性·直接在SDS凝膠上快速的檢測(cè)，確定融合伙伴的分子量
·另外的蛋白染色的可能性·廉價(jià)的材料和少的設(shè)備花費(fèi)·在E.coli中良好的表達(dá)，包括保留生物活性的靶蛋白的良好表達(dá)·避免外源/靶蛋白的包函體或其它由不正確的折疊所產(chǎn)生的聚集體的可能性·通過(guò)親合層析，例如在染料上(Cibacron Blue 3G)純化融合蛋白的可能性表3
以下實(shí)施例不限制本發(fā)明地進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1
根據(jù)本發(fā)明使用了以上核苷酸(表4)。下面的表5總結(jié)了所使用的微生物。所有這些微生物來(lái)衍生自E.coilK12，并屬于危險(xiǎn)組1。
供體微生物21.10.96的M7037表達(dá)菌株(E.coli N 4830/pJH115)(由Merck提供)pJH 115pUC衍生物，5.9kb，OLPL啟動(dòng)子，gdh，to(終止子)，galk(半乳糖苷酶基因)，bla(β-內(nèi)酰胺酶基因)，ori(復(fù)制起點(diǎn))，2個(gè)HindIII，2個(gè)BamH I和各一個(gè)EcoR I和Cla I切割位點(diǎn)。
實(shí)施例2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli細(xì)胞SOC培養(yǎng)基20g細(xì)菌用胰蛋白胨，5g細(xì)菌用酵母提取物，0.5gNaCl，0.2g KCl和11dd H2O，高壓滅菌。使用前，加0.5ml 1MMgCl2/1M MgSO4(過(guò)濾除菌)，1ml 1M葡萄糖(過(guò)濾除菌)LB(Amp)瓊脂平板11 LB培養(yǎng)基(沒有氨芐青霉素)和15g瓊脂-瓊脂混合在一起，高壓滅菌，冷卻至大約60℃，和1ml氨芐青霉素溶液(100mg/ml)。步驟混合物1-5μl連接產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA(5-50μg/μl)50μl 感受態(tài)細(xì)胞450μlSOC培養(yǎng)基·在冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞10分鐘·向感受態(tài)細(xì)胞中加入DNA·在冰上溫育30分鐘·熱擊在42℃(水浴)30秒·將細(xì)胞置于冰上2分鐘·加450μl預(yù)先加溫的SOC培養(yǎng)基·在37℃以220rpm溫育1小時(shí)·將100μl的小部分混合物劃線到預(yù)先加溫的平板上·平板在37℃過(guò)夜溫育實(shí)施例3TOPO-TA-Cloning和連接
TOPO-TA-Cloning是用Taq聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的5分鐘克隆方法。
由Invitrogen提供的TOPO-TA-Cloning試劑盒(版本C(VersionC))是為PCR產(chǎn)物的直接克隆而開發(fā)的。此系統(tǒng)利用在PCR(3′突出端)中，在所有雙鏈分子的3′末端加上單個(gè)脫氧腺嘌呤核苷的耐熱聚合酶的性質(zhì)。借助于這些3′A-突出端將PCR產(chǎn)物直接連接到具有3′-T突出端的載體上是可能的。該試劑盒提供就此目的特異性開發(fā)的PCR2.1-TOPO載體。此載體大小是3.9kb，并具有一個(gè)用于藍(lán)/白篩選的lacZ基因，和氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因?？寺∥稽c(diǎn)通過(guò)單個(gè)EcoR I切割位點(diǎn)在兩邊的側(cè)翼。
連接混合物2μl 新鮮的PCR產(chǎn)物1μl PCR-TOPO載體2μl 無(wú)菌水5μl 總體積·仔細(xì)混合此混合物并在室溫溫育5分鐘·簡(jiǎn)單地離心并將管子置于冰上·立即在OneShotTM轉(zhuǎn)化中使用連接產(chǎn)物5μl沒有PCR產(chǎn)物并且僅含有載體和水的混合物被用做對(duì)照。利用如下的方法進(jìn)行One-ShotTM轉(zhuǎn)化加2μl 0.5Mβ-巰基乙醇到50μl在冰上融化的One-ShotTMTOP10感受態(tài)細(xì)胞；每管感受態(tài)細(xì)胞加2μl TOPO-TA-Cloning連接；在冰上溫育30分鐘；熱擊在42℃30秒；在冰上冷卻2分鐘；加250μl的SOC培養(yǎng)基(室溫)；在37℃和220rpm溫育各管30分鐘；將100μl各轉(zhuǎn)化混合物劃線到預(yù)先加溫到37℃的平板上；在37℃過(guò)夜溫育平板；用合適的酶在分析性限制性消化中分析小量制備(3.2.2.1)后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例4基因在E.coli中表達(dá)步驟概述如下·從成功測(cè)序的克隆分離此質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株W3110·從轉(zhuǎn)化平板挑選一個(gè)克隆并用來(lái)制備一個(gè)5ml ON預(yù)培養(yǎng)·將預(yù)培養(yǎng)劃線到LB(Amp)平板上，并將來(lái)自于該平板的克隆用來(lái)接種以后要進(jìn)行的表達(dá)?！ご撕笥?ml預(yù)培養(yǎng)接種50ml主培養(yǎng)(比例1∶50)，并測(cè)定OD600(參考測(cè)量用未接種的LB(Amp)培養(yǎng)基)·主培養(yǎng)(在一個(gè)200ml Erlenmeyer瓶中)在37℃以220rpm溫育·每30分鐘測(cè)定OD600·一旦OD達(dá)到0.5，就用每50ml細(xì)胞懸液10μl無(wú)水四環(huán)素(1mg/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞(f.c，每毫升細(xì)胞懸液0.2μg無(wú)水四環(huán)素)，并且再次測(cè)定OD(0值)?！っ啃r(shí)測(cè)定OD，并且在誘導(dǎo)時(shí)刻之后3小時(shí)終止生長(zhǎng)·將1ml徹底混合的細(xì)菌懸液被置于一個(gè)試管中，并以600rpm離心5分鐘(如果必要，也可使用更少的懸液)·吸去上清，并在100μl 1 x red.樣品緩沖液中將沉淀勻漿?！驖{煮沸5分鐘，在冰上冷卻并簡(jiǎn)單離心；·將10μl樣品加樣到SDS凝膠的各孔并進(jìn)行電泳(3.2.16)；·此凝膠利用考馬斯藍(lán)染色和/或利用實(shí)施例5的方法染色細(xì)胞破碎來(lái)自50ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)胞以3500rpm在4℃離心15分鐘。所產(chǎn)生的上清被傾棄，并將細(xì)胞重新懸浮在40ml 100mM Tris/HCl(pH8.5)中。被懸浮的細(xì)胞使用弗氏壓碎器在1英寸的圓筒中在18,000psi下被破碎。這必需細(xì)胞被強(qiáng)迫通過(guò)一個(gè)狹窄的孔(＜1mm)并遭受一個(gè)突然的壓力下降。一旦通過(guò)此孔，細(xì)胞因?yàn)閴毫Σ町惗扑椤Ｔ诖似陂g，細(xì)胞蛋白的結(jié)構(gòu)被保持。為了避免所要求的蛋白的蛋白水解性降解的在細(xì)胞破碎后應(yīng)該立即加入一種蛋白酶抑制劑。就此目的而言，1片無(wú)EDTA的CompleteTM蛋白酶-抑制劑Cocktail(Roche)被加入各40ml的蛋白溶液并在室溫溶解。此后以6000rpm離心20分鐘除去細(xì)胞碎片和大部分的DNA和RNA。此后將樣品在-20℃冰凍。實(shí)施例5GlcDH條帶在SDS凝膠上活性染色使用氯化碘代苯基硝基苯基-苯四唑(INT)，能夠在SDS凝膠上特異性地檢測(cè)葡萄糖脫氫酶條帶，這是僅僅因?yàn)镾DS處理不破壞G1cDH活性因而是可能的。
GlcDH利用一種顏色反應(yīng)檢測(cè)。這引起在反應(yīng)中形成的氫被轉(zhuǎn)移給四唑鹽INT，產(chǎn)生一種紫甲(violet formazan)。吩嗪硫酸甲酯作為電子轉(zhuǎn)移試劑。預(yù)溫育緩沖液(0.1M Tris/HCl，pH7.5)15.76g Tris/HCl加11dd H2O，用NaOH調(diào)節(jié)到pH7.5反應(yīng)緩沖液(0.08％INT，0.005％吩嗪硫酸甲酯，0.065％NAD，5％Glc的1M Tris/HCl溶液，pH7.5)0.8g 氯化碘代苯基硝基苯基四唑(INT)0.05g methylphenazinium methosulfate(吩嗪硫酸甲酯(phenanz ine methosulfate))0.65g NAD50g D-(+)一水葡萄糖加110.1M Tris/HCl(pH7.5)GlcDH貯存緩沖液26.5 EDTA15g Na2HPO4加11，pH7.0(NaOH)樣品制備·在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)參考物(marker)·在水浴中煮沸3分鐘并在冰上冷卻，離心SDS凝膠電泳按照標(biāo)準(zhǔn)方法。
活性染色·在37℃，預(yù)溫育緩沖液中溫育具有已分級(jí)的蛋白條帶的SDS凝膠，同時(shí)輕柔地?fù)u動(dòng)5分鐘·傾棄緩沖液并用足夠量的反應(yīng)緩沖液(RT)覆蓋，在37℃溫育同時(shí)輕柔地?fù)u動(dòng)(換緩沖液至少1x)·溫育大約30分鐘后，有GlcDH的條帶被染成紅-紫色。
·在預(yù)溫育緩沖液中洗滌凝膠，照相并干燥·如果要求的話，進(jìn)行隨后的考馬斯染色并在此后干燥凝膠實(shí)施例6使用ECL系統(tǒng)進(jìn)行免疫檢測(cè)(Western ExposureTM化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng))偶聯(lián)組氨酸標(biāo)記的蛋白使用兩種抗體間接地檢測(cè)。使用的第一抗體是檢測(cè)標(biāo)記了6xHis的蛋白的抗-RGS.組氨酸抗體(QIAGEN)。此后使用過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的AffiniPure羊抗小鼠IgG(H+L)抗體檢測(cè)所產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物。在加入ECL底物混合物后，結(jié)合的過(guò)氧化物酶產(chǎn)生一種能夠使用高性能的化學(xué)發(fā)光膠卷檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光底物。
麗春紅S溶液(0.5％麗春紅，7.5％TCA)1.25g 麗春紅S18.75g TCA用雙蒸水補(bǔ)到250ml10×PBS緩沖液pH7.414.98g 磷酸氫二鈉×2H2O2.13g 磷酸二氫鉀87.66g 氯化鈉補(bǔ)足到11，檢查pH是7.4使用1x緩沖液濃度。Biometra印跡緩沖液25mMTris150mM 甘氨酸10％甲醇封閉緩沖液5％ 脫脂奶粉在1xPBS緩沖液中溶解洗滌緩沖液0.1％NonidetTMP-40(Sigma)在1xPBS緩沖液中溶解檢測(cè)如下進(jìn)行·剪一塊PVDF膜(Imobilon P，Millipore)和凝膠大小的6x印跡濾紙·在甲醇并然后在Biometra印跡緩沖液中平衡此PVDF膜15秒鐘，并對(duì)SDS凝膠和濾紙應(yīng)用相同的步驟·印跡構(gòu)建在印跡槽中安裝3層濾紙，膜，凝膠，3層濾紙(在各層之間的氣泡必須被趕出來(lái)，否則在這些地方?jīng)]有轉(zhuǎn)移發(fā)生)·印跡凝膠1-1.5mA/cm21小時(shí)·檢查蛋白轉(zhuǎn)移·在印跡之后，通過(guò)使用麗春紅S染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的蛋白在平皿中用0.5％的麗春紅S溶液溫育此膜同時(shí)搖動(dòng)至少2分鐘。傾棄染色(可重復(fù)使用)并在流動(dòng)的去離子水下對(duì)使此膜脫色。在這種情形下，僅僅強(qiáng)的蛋白條帶被染色。分子量標(biāo)準(zhǔn)參考物用一支圓珠筆做標(biāo)記。
·印跡的顯影所有的溫育應(yīng)該在平皿中在Celloshaker上，并在roller cabinet中在50ml Falcon管中進(jìn)行，因?yàn)樵谝韵虏襟E期間此膜永遠(yuǎn)不能干。
(1)飽和在37℃，在一個(gè)roller cabinet中30分鐘，使用PBS/5％脫脂奶粉(2)第1抗體用PBS/5％脫脂奶粉(體積大約7ml/膜)1∶2000稀釋，在37℃溫育1小時(shí)(3)洗滌大量使用洗滌溶液PBS/0.1％NP40洗滌膜，洗滌3×5分鐘(4)POD-標(biāo)記的抗體用PBS/0.5％脫脂奶粉1∶1000稀釋，在37℃溫育1小時(shí)(5)洗滌大量使用洗滌溶液PBA/0.1％NP-40洗滌，洗滌3×5分鐘(6)顯影充分旋轉(zhuǎn)此膜(不允許干)并置于塑料片上，用ECL顯影液(Amersham)完全覆蓋1分鐘，旋轉(zhuǎn)此膜并置于成雙的片中，將偏振片Hyperfilm置于上層并顯影實(shí)施例7利用因子XIIIa的抑制的tridegin檢測(cè)(Finney等的方法，根據(jù)本發(fā)明做了修改)代替因子XIIIa的天然底物，即氨基酸的含有氨基的側(cè)鏈，合成胺也被摻入到合適的蛋白底物中。這些合成胺有使檢測(cè)成為可能的分子內(nèi)標(biāo)記。胺摻入測(cè)試是固相測(cè)試。滴定板用酪蛋白包被。底物生物素酰氨基戊胺被因子XIIIa摻入到此酪蛋白中。酪蛋白-生物素酰氨基戊胺可被鏈親合素-堿性磷酸酶融合蛋白(strep/AP)檢測(cè)。這個(gè)三明治反應(yīng)通過(guò)使用對(duì)-硝基苯磷酸檢測(cè)磷酸酶活性來(lái)進(jìn)行[sic]。這涉及以下反應(yīng) 4-硝基苯酚鹽[sic]的形成通過(guò)在405nm的光度測(cè)定來(lái)確定，并直接與AP活性成比例。生物素和鏈親合素之間的高親合性相互作用意味著磷酸酶活性同樣與因子XIIIa活性成比例，也就是說(shuō)，更強(qiáng)的吸收(呈黃色)意味著更高的因子XIIIa活性(Janowski，1997)。EDTA是因子XIIIa的非常不特異性的抑制劑，其輔因子Ca2+在一種螯合復(fù)合物中被EDTA結(jié)合。因?yàn)檫@個(gè)原因，使用的蛋白樣品不應(yīng)含有任何EDTA，并用無(wú)EDTA的蛋白酶抑制劑混合物預(yù)處理(Boehringer)。洗滌緩沖液100mM Tris/HCl，pH8.5溶液A 在洗滌緩沖液中溶解0.5％脫脂奶粉溶液B 在洗滌緩沖液中溶解0.5mM生物素酰氨基戊胺，10mM DTT，5mM CaCl2溶液C 在洗滌緩沖液中溶解200mM EDTA溶液D在溶液A中溶解1.7μg/ml鏈親合素-堿性磷酸酶溶液E在洗滌緩沖液中溶解0.01％(w/v)TritonX-100溶液F在洗滌緩沖液中溶解1mg/ml對(duì)-硝基苯磷酸，5mM MgCl2包被·根據(jù)樣品的數(shù)目，在一塊滴定板上各孔中分發(fā)200μl溶液A，在37℃搖動(dòng)30分鐘(Thermoshaker)洗滌·每孔用300μl洗滌緩沖液洗滌兩次摻入反應(yīng)·每孔分發(fā)10-150μl樣品，并加入5μl因子XIIIa/孔和200μl溶液B/孔在37℃下振搖30分鐘終止·用300μl溶液C(因子XIIIa抑制)/孔洗兩次·用300μl洗滌緩沖液/孔洗兩次Strep/Ap結(jié)合(特異性的)·每孔加入250μl溶液D·在室溫溫育60分鐘洗滌·每孔用300μl溶液E洗滌(使沒有共價(jià)結(jié)合的蛋白脫落)·每孔使用300μl洗滌緩沖液洗滌4次底物·每孔加50μl溶液F+每孔200μl洗滌緩沖液·在室溫溫育30分鐘用計(jì)算機(jī)輔助的評(píng)價(jià)，在微量滴定板讀數(shù)器上在405nm測(cè)量實(shí)施例8GlcDH檢測(cè)的敏感性將規(guī)定量的已純化的GlcDH置于SDS凝膠上。在電泳跑完之后，此SDS凝膠在預(yù)溫育緩沖液中37℃溫育5分鐘。棄去此緩沖液，并在37℃反應(yīng)緩沖液中搖動(dòng)此凝膠。在進(jìn)一步的步驟中用考馬斯藍(lán)染色此凝膠。
1升反應(yīng)緩沖液0.1M Tris/HCl，pH7.50.5M NaCl0.2％Triton X-1000.8g碘代苯基硝基苯基四唑氯化物0.05g methylphenazinium methosulfate0.65g NAD50g D-(+)-一水葡萄糖預(yù)溫育緩沖液0.1M Tris/HCl，pH7.50.5M NaCl
權(quán)利要求
1.由至少一種第一和第二氨基酸序列所組成的重組融合蛋白，特征在于第一序列具有葡萄糖脫氫酶的生物活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組融合蛋白，特征在于第二序列是任何重組蛋白/多肽X或代表其部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組融合蛋白，特征在于它可以另外地具有至少一個(gè)適合于檢測(cè)的其它識(shí)別序列(“標(biāo)記物序列”)。
4.DNA，特征在于它編碼根據(jù)權(quán)利要求1-3的一種融合蛋白。
5.表達(dá)載體，特征在于它包括根據(jù)權(quán)利要求4的一種DNA。
6.表達(dá)重組蛋白/多肽的宿主細(xì)胞，特征在于它包括根據(jù)權(quán)利要求5的一種表達(dá)載體。
7.葡萄糖脫氫酶在根據(jù)權(quán)利要求1到3的一種融合蛋白中作為任何重組蛋白/多肽X的檢測(cè)器蛋白的用途。
8.葡萄糖脫氫酶在作為根據(jù)權(quán)利要求1到3的一種融合蛋白的成分的一種重組蛋白/多肽X的表達(dá)的檢測(cè)系統(tǒng)中的用途。
9.葡萄糖脫氫酶用于檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的用途，其中一個(gè)伙伴對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1到3的重組蛋白/多肽X。
10.葡萄糖脫氫酶在根據(jù)權(quán)利要求1-3的一種融合蛋白中作為不是根據(jù)權(quán)利要求1-3的融合蛋白的一種成分，并且能夠結(jié)合到所說(shuō)的融合蛋白中的蛋白/多肽X的第二序列的任何第三蛋白/多肽的檢測(cè)器蛋白的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的一種表達(dá)載體在一種重組制備方法中在最優(yōu)化一種重組蛋白/多肽X的表達(dá)中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的一種宿主細(xì)胞在一種重組的制備方法中在最優(yōu)化一種重組蛋白/多肽X的表達(dá)中的用途。
13.通過(guò)凝膠電泳(gellectrophoresis)快速檢測(cè)任何重組蛋白/多肽X的方法，特征在于制備根據(jù)權(quán)利要求1到4的一種融合蛋白和利用凝膠電泳分級(jí)分離，并且通過(guò)葡萄糖脫氫酶的酶活性使要在凝膠中被檢測(cè)的重組蛋白/多肽可見。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，特征在于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)被用做凝膠電泳方法。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，特征在于基于四氮唑鹽的一種顏色反應(yīng)被用來(lái)檢測(cè)葡萄糖脫氫酶的酶活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于碘代苯基硝基苯基-苯四唑鹽(INT)或氮藍(lán)四唑鹽(NBT)被用做四氮唑鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或16的方法，特征在于葡萄糖脫氫酶的特異性染色之后進(jìn)行一個(gè)普通的蛋白染色。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有一種具有葡萄糖脫氫酶的生物活性的蛋白序列作為其組分之一的新的重組融合蛋白,并涉及其簡(jiǎn)單的和有效的在SDS－PAGE凝膠中檢測(cè)任何類型的蛋白/多肽以及快速優(yōu)化能夠表達(dá)上述蛋白/多肽的表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1340104SQ00803879
公開日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2000年2月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月19日
發(fā)明者W·林克斯維勒, C·布格爾, O·普施克, U·哈夫曼, A·沃爾弗 申請(qǐng)人:默克專利股份有限公司