專利名稱：蛋白質(zhì)及葡萄糖脫氫酶的精制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用液體層析法精制蛋白質(zhì)的方法。該精制方法是在精制例如電子傳遞蛋白質(zhì)所結(jié)合的葡萄糖脫氫酶時(shí)使用的方法。
背景技術(shù)：
使用對(duì)于特定底物有特異反應(yīng)的酶的生物傳感器的開(kāi)發(fā)，不分產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域地正在盛行起來(lái)。作為生物傳感器的代表，可以舉出主要在醫(yī)療領(lǐng)域使用的葡萄糖傳感器。
葡萄糖傳感器是用于構(gòu)筑含有酶和電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系的器件，在利用該葡萄糖傳感器的情況下，例如采用電流分析的方法對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量測(cè)定。作為酶來(lái)說(shuō)，使用葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脫氫酶(GDH)。
GOD，因?yàn)獒槍?duì)葡萄糖的底物特異性高、熱穩(wěn)定性優(yōu)異、能夠?qū)崿F(xiàn)酶的批量化生產(chǎn)，所以，與其它酶相比，有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。其反面，使用GOD的體系，因?yàn)槿菀资艿綔y(cè)定樣品中的溶解氧的影響，所以有溶解氧對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響的問(wèn)題。
另一方面，使用GDH的體系不易受到測(cè)定樣品中的溶解氧的影響。因此，使用GDH的體系，即使在氧分壓低的環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定，對(duì)要求氧量多的高濃度樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，也可以精度高地測(cè)定葡萄糖濃度。其反面是GDH有熱穩(wěn)定性差、底物特異性比GOD差的問(wèn)題。
從這樣的情況出發(fā)，摸索著彌補(bǔ)GOD和GDH雙方的缺點(diǎn)。如國(guó)際公開(kāi)WO02/36779號(hào)公報(bào)所公開(kāi)的那樣，早出等人從溫泉附近的土壤中分離出新型菌株(Burkhorderia cepacia KS1株)，由該菌株取得了新的GDH。該GDH是由α、β、γ亞單位構(gòu)成的(以下稱“CyGDH”)，與電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)速度高，在耐熱性方面也沒(méi)有問(wèn)題，作為葡萄糖傳感器使用是合適的。
在葡萄糖傳感器中使用CyGDH的情況下，從含有CyGDH的酶溶液出發(fā)，需要精制CyGDH。在酶的精制中，通常利用液體層析法。因此，本發(fā)明人等人根據(jù)通常方法，同時(shí)使用疏水層析法及陰離子交換層析法進(jìn)行了精制酶溶液的試驗(yàn)。但是，用SDS-PAGE對(duì)精制酶液進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果是，除了α、β、γ亞單位以外，還含有許多蛋白質(zhì)，不能高純度地精制CyGDH。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)的新型精制方法。
由本發(fā)明的第一方面提供的蛋白質(zhì)的精制方法，是從目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解的蛋白質(zhì)溶液出發(fā)、利用液體層析法精制上述目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其中，上述液體層析法包括向填充有填充劑的填充槽中導(dǎo)入上述蛋白質(zhì)溶液、在上述填充劑中保持上述目標(biāo)蛋白質(zhì)的第一步驟；和，使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液、從上述填充劑中洗脫上述目標(biāo)蛋白質(zhì)的第二步驟。
另外，在本說(shuō)明書(shū)中，在稱為“液體層析法”時(shí)，沒(méi)有特別的限定，除了使用柱以流動(dòng)方式(連續(xù)式)進(jìn)行精制的情況以外，還包括以間歇式精制蛋白質(zhì)的情況。作為間歇式的精制方法來(lái)說(shuō)，可以舉出例如在容器內(nèi)使填充劑和蛋白質(zhì)溶液共存、使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合于填充劑后、分離填充劑、使該填充劑和洗脫液接觸、然后從填充劑中分離和回收目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。
作為精制對(duì)象的目標(biāo)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以舉出例如含有電子傳遞蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。典型的是，作為目標(biāo)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以舉出包含電子傳遞蛋白質(zhì)和具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)的葡萄糖脫氫酶。
作為填充劑來(lái)說(shuō)，使用例如離子交換樹(shù)脂，由離子交換層析法精制蛋白質(zhì)。此時(shí)，作為離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，使用例如具有季銨基作為離子交換基的離子交換樹(shù)脂。
這里，所謂“羥基膽烷酸”，指的是膽烷酸三水合物的膽酸及廣義的衍生物，作為羥基膽烷酸鹽來(lái)說(shuō)，可以舉出膽酸鹽、甘氨熊脫氧膽酸鹽、?；歉拾毙苊撗跄懰猁}、?；切苊撗跄懰猁}、熊脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}、甘氨鵝脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、鵝脫氧膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、甘氨石膽酸鹽、?；鞘懰猁}、石膽酸鹽等。其中，優(yōu)選使用膽酸鹽、例如膽酸鈉。
目標(biāo)蛋白質(zhì)從填充劑中的洗脫，優(yōu)選使洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度為一定來(lái)進(jìn)行。此時(shí)，洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度，優(yōu)選在0.5～2.5重量％的范圍、更優(yōu)選在0.8～1.2重量％的范圍來(lái)選擇。這樣的方法，不限于用間歇式進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫的場(chǎng)合，也適用于用連續(xù)式進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫的場(chǎng)合。另外，也可以使洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度與時(shí)間同時(shí)變化而進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫。此時(shí)，洗脫液的濃度的上限，優(yōu)選例如為3重量％以下、更優(yōu)選為1.5重量％、最優(yōu)選1重量％。即，洗脫液的濃度變化，在例如0～3重量％的范圍、更優(yōu)選為0～1.5重量％的范圍、最優(yōu)選為0～1.0重量％的范圍進(jìn)行。
電子傳遞蛋白質(zhì)，例如在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量是約43kDa。另一方面，具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)，在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量是約60kDa。這樣的電子傳遞蛋白質(zhì)及含有亞單位的葡萄糖脫氫酶，可以從例如具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物或從轉(zhuǎn)化體取得。
本發(fā)明中所采用的屬于Burkhorderia屬的微生物，如果是具有該酶生產(chǎn)能力的屬于Burkhorderia屬的微生物，就沒(méi)有特別的限制，但優(yōu)選Burkhorderia cepacia、特別優(yōu)選Burkhorderia cepacia KS1株(以下，簡(jiǎn)稱為“KS1”株)。該KS1株在平成12年9月25日(2000年9月25日)在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國(guó)茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)以微生物保藏號(hào)第FERM BP-7306號(hào)保藏。
轉(zhuǎn)化體，可以通過(guò)在宿主微生物中導(dǎo)入從屬于例如Burkhorderia屬的微生物中取得的含有編碼電子傳遞蛋白質(zhì)及具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)的序列的DNA而形成。作為宿主微生物來(lái)說(shuō)，優(yōu)選使用屬于假單胞菌屬的微生物(特別是惡臭假單胞菌或大腸桿菌)。
如國(guó)際公開(kāi)WO02/36779號(hào)公報(bào)等公開(kāi)的那樣，產(chǎn)生源自KS1株的葡萄糖脫氫酶，除了亞單位(α亞單位)和電子傳遞蛋白質(zhì)(β亞單位)以外，還具有在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量約為14kDa的γ亞單位。
早出等人確認(rèn)，與只表達(dá)α亞單位的情況相比，若與α亞單位一起表達(dá)γ亞單位，就可以得到高的酶活性。因此，從酶活性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選表達(dá)γ亞單位，在上述DNA中，優(yōu)選在α亞單位的上游區(qū)域含有γ亞單位的結(jié)構(gòu)基因。如果這樣就可以認(rèn)為，在轉(zhuǎn)化體中，在產(chǎn)生α亞單位時(shí)，由于首先表達(dá)γ亞單位作為蛋白質(zhì)來(lái)存在，所以可以在微生物體內(nèi)高效率地產(chǎn)生α亞單位。
本發(fā)明的第二方面提供一種葡萄糖脫氫酶的精制方法，它是組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制葡萄糖脫氫酶的方法，其特征在于上述疏水層析法包括在固定相中保持上述葡萄糖脫氫酶的步驟、溶出不要的蛋白質(zhì)的步驟、使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液溶出上述葡萄糖脫氫酶的步驟；上述陰離子交換層析法包括在固定相中保持上述葡萄糖脫氫酶的步驟、使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液溶出上述葡萄糖脫氫酶的步驟。
在疏水層析法中，例如葡萄糖脫氫酶的溶出，是使洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度隨時(shí)間變化來(lái)進(jìn)行。另一方面，在陰離子交換層析法中，例如葡萄糖脫氫酶的溶出，是使洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度固定而進(jìn)行的。另外，也可以使洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度隨時(shí)間變化而進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫。此時(shí)，洗脫液濃度的上限，設(shè)定為例如3重量％以下、更優(yōu)選為1.5重量％、最優(yōu)選為1重量％。即，洗脫液的濃度變化，在例如0～3重量％的范圍、更優(yōu)選為0～1.5重量％的范圍、最優(yōu)選為0～1.0重量％的范圍進(jìn)行。
在本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶的精制方法中，優(yōu)選在進(jìn)行了疏水層析法以后、進(jìn)行上述陰離子交換層析法。
葡萄糖脫氫酶是例如具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物所產(chǎn)生的。屬于Burkhorderia屬的微生物，例如是KS1株。
葡萄糖脫氫酶也可以是轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的。轉(zhuǎn)化體，可以通過(guò)將從具有葡萄糖脫氫酶產(chǎn)生能力的屬于Burkhorderia屬的微生物取得的編碼上述葡萄糖脫氫酶的DNA導(dǎo)入宿主微生物中而形成。作為宿主微生物來(lái)說(shuō)，可以使用例如惡臭假單胞菌或大腸桿菌。
在本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶的精制方法中，優(yōu)選使用將季銨基作為離子交換基的離子交換樹(shù)脂進(jìn)行陰離子交換層析法，作為羥基膽烷酸鹽，優(yōu)選使用膽酸鹽。


圖1表示使用膽酸鈉作為洗脫液對(duì)從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液進(jìn)行精制而得到的酶的SDS-PAGE的結(jié)果。
圖2表示使用NaCl或KCl作為洗脫液對(duì)從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液進(jìn)行精制而得到的酶的SDS-PAGE的結(jié)果。
圖3表示使用膽酸鈉作為洗脫液對(duì)從大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液進(jìn)行精制而得到的酶的SDS-PAGE的結(jié)果、同時(shí)也表示對(duì)從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體及KS1株得到的粗酶溶液進(jìn)行精制而得到的酶。
具體實(shí)施例方式
以下，對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的精制方法，以精制葡萄糖脫氫酶(以下稱“GDH”)的情況為例，具體地加以說(shuō)明。
在葡萄糖脫氫酶的精制時(shí)，首先，準(zhǔn)備酶溶液。就酶溶液來(lái)說(shuō)，可以從產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶的微生物或其培養(yǎng)液采取，也可以從導(dǎo)入了由該微生物取得的DNA的轉(zhuǎn)化體或其培養(yǎng)液采取。
就酶溶液來(lái)說(shuō)，在GDH存在于菌體時(shí)，通過(guò)過(guò)濾或離心分離等手段從培養(yǎng)液中采集了菌體后，以機(jī)械方法或溶菌酶等的酶方法破壞該菌體，根據(jù)需要添加EDTA等螯合劑和表面活性劑，將GDH可溶化，從而得到酶溶液。另一方面，GDH存在于菌體外(培養(yǎng)液中)時(shí)，酶溶液可以通過(guò)過(guò)濾或離心分離等手段從培養(yǎng)液中分離菌體而得到。
作為產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶的微生物來(lái)說(shuō)，優(yōu)選使用例如屬于Burkhorderia屬的微生物、特別是Burkhorderia cepacia。從該Burkhorderia cepacia，作為例如可溶化膜部分，可以采取酶溶液?？扇芑げ糠郑鐚㈦x心分離培養(yǎng)液而得到的菌體粉碎，采取細(xì)胞提取液，將該細(xì)胞提取液進(jìn)行離心分離，將所得到的上清液進(jìn)行超離心，由此可以得到沉淀物。菌體的粉碎，按照通常的方法，可以由機(jī)械方法或酶方法來(lái)進(jìn)行。
就轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)以下方法來(lái)形成，即，例如取得含有將α亞單位(具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì))和β亞單位(電子傳遞蛋白質(zhì))的表達(dá)進(jìn)行編碼的序列的DNA后，將含有該DNA的重組媒介物導(dǎo)入宿主微生物中而形成。
在取得DNA時(shí)，首先構(gòu)筑重組媒介物。該重組媒介物，從產(chǎn)生具有葡萄糖脫氫活性的酶的微生物，分離及精制染色體DNA后，可以使通過(guò)切斷該染色體DNA的染色體DNA斷片或由PCR放大的DNA斷片與線型的表達(dá)媒介物進(jìn)行結(jié)合閉鏈來(lái)構(gòu)筑。
作為宿主微生物來(lái)說(shuō)，可以舉出以大腸桿菌為代表的腸內(nèi)細(xì)菌群、假單胞菌屬和葡萄糖菌屬等的革蘭氏陰性菌、以枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)等芽孢桿菌屬細(xì)菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌、Saccharomycescerevisiae等酵母、Aspergillus niger等線狀菌。其中，特別優(yōu)選使用大腸桿菌和屬于假單胞菌屬的微生物(例如惡臭假單胞菌)。微生物的轉(zhuǎn)化，可以根據(jù)例如在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中利用鈣處理的感受態(tài)細(xì)胞法、桿菌屬細(xì)菌的原生質(zhì)體法、酵母的KU法或KUR法、線狀菌的顯微操作法等方法進(jìn)行。作為轉(zhuǎn)化的方法來(lái)說(shuō)，也可以使用電蝕孔法。
酶溶液的精制，利用液體層析法進(jìn)行。在由液體層析法進(jìn)行的精制中，為了得到所要達(dá)到的精制程度，就要選擇液體層析法的種類、次數(shù)和組合。作為液體層析法來(lái)說(shuō)，可以舉出凝膠過(guò)濾、吸附層析法、離子交換層析法以及親和層析法。
液體層析法，可以在形成于柱內(nèi)的固定相中保持目標(biāo)蛋白質(zhì)后，連續(xù)地供給洗脫液，洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)并進(jìn)行回收，也可以以間歇式進(jìn)行。在間歇式中，例如在容器內(nèi)供給填充劑和含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的試樣，使目標(biāo)蛋白質(zhì)保持于填充劑中以后，除去雜質(zhì)，供給洗脫液，從填充劑中洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)，回收目標(biāo)蛋白質(zhì)。
作為洗脫液來(lái)說(shuō)，使用含有作為洗脫劑的羥基膽烷酸鹽的溶液。在由多次液體層析法精制目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，在至少一次的液體層析法中，使用羥基膽烷酸鹽作為洗脫液。此時(shí)，在最后進(jìn)行的液體層析法中，優(yōu)選使用羥基膽烷酸鹽作為洗脫液。
作為羥基膽烷酸鹽來(lái)說(shuō)，可以舉出膽酸鹽、甘氨熊脫氧膽酸鹽、?；歉拾毙苊撗跄懰猁}、?；切苊撗跄懰猁}、熊脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}、甘氨鵝脫氧膽酸鹽、牛磺鵝脫氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、鵝脫氧膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、甘氨石膽酸鹽、?；鞘懰猁}、石膽酸鹽等。其中，優(yōu)選使用膽酸鹽、例如膽酸鈉。
洗脫液，可以使該液體中的羥基膽烷酸鹽濃度固定地與填充劑接觸，也可以使羥基膽烷酸鹽的濃度與時(shí)間同時(shí)呈直線變化地供給。
液體層析法，可以從酶溶液直接進(jìn)行，也可以濃縮酶溶液中的目標(biāo)蛋白質(zhì)之后進(jìn)行。就濃縮來(lái)說(shuō)，可以由例如減壓濃縮、膜濃縮、鹽析處理、或利用親水性有機(jī)溶劑(例如甲醇、乙醇、丙酮)的分別沉淀法、加熱處理、等電點(diǎn)處理進(jìn)行。
這樣得到的精制酶，可以由例如冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥進(jìn)行粉末化，使之在市場(chǎng)流通。
實(shí)施例以下，對(duì)上述制造方法的具體例子加以說(shuō)明，同時(shí)，實(shí)際證明在使用膽酸鈉作為洗脫劑時(shí)，與使用NaCl和KCl相比，可以高效率地精制GDH。
<酶溶液的取得方法>
(1)源自Burkhorderia cepacia KS1株的酶溶液的取得Burkhorderia cepacia KS1株的培養(yǎng)，在有氧的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。更具體地說(shuō)，KS1株的培養(yǎng)如下這樣來(lái)進(jìn)行，即，使用20L培養(yǎng)基在34℃下進(jìn)行8小時(shí)的培養(yǎng)，該培養(yǎng)基是將每1升培養(yǎng)液的組成調(diào)整為表1所示的那樣。
表1培養(yǎng)基組成

接著，在4℃下，用10分鐘、以9000×g對(duì)本培養(yǎng)液20L進(jìn)行離心分離，得到了約250g的菌體。回收菌體，冷凍后懸濁在10mM磷酸緩沖液(pH6)中，使用高壓均質(zhì)器(Rannie社、丹麥)、以500bar的壓力、數(shù)次通過(guò)液體，粉碎了菌體膜。通過(guò)粉碎菌體膜所得到的細(xì)胞提取液，GDH活性是60kU。以8000×g、60分鐘離心分離該細(xì)胞提取液，除去細(xì)胞固形物。再將該上清液在10℃溫度下進(jìn)行17萬(wàn)×g、1小時(shí)的超離心分離，回收作為沉淀物的膜部分。
就膜部分來(lái)說(shuō)，為了使最終濃度達(dá)到膽酸鈉為1.5％、KCl為0.1M，以10mM磷酸緩沖液(pH6)進(jìn)行再分散，在4℃溫度下攪拌一夜。其結(jié)果是，得到了含有30kU的GDH的膜部分懸濁液。將該膜部分懸濁液在10℃溫度下進(jìn)行17萬(wàn)×g、90分鐘的超離心分離，除去沉淀，得到含有GDH的可溶化膜部分(GDH活性是26kU)。以10mM磷酸緩沖液(pH6)對(duì)該可溶化膜部分進(jìn)行3液透析，將所生成的不溶物在10℃溫度下進(jìn)行17萬(wàn)×g、90分鐘的超離心分離，除去沉淀。所得到的上清液(可溶化GDH部分)中的GDH，活性是28kU，比活性是6.8U/mg。
(2)來(lái)自轉(zhuǎn)化體的粗酶溶液的取得進(jìn)行以下的實(shí)施例和比較例中的精制時(shí)，可分別從宿主不同的2種轉(zhuǎn)化體得到粗酶溶液。
在形成轉(zhuǎn)化體時(shí)，首先，將含有編碼α、β、γ亞單位的序列的DNA根據(jù)通常的方法從KS1株中取得。
接著，將所得到的DNA插入媒介質(zhì)粒，形成GDH表達(dá)用質(zhì)粒，將其導(dǎo)入宿主微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
作為宿主來(lái)說(shuō)，使用惡臭假單胞菌KT2440株(ATCC47054)和大腸桿菌BL21株。
在使用惡臭假單胞菌KT2440株作為宿主的情況下，使用RSF1010作為插入基因GDH的媒介質(zhì)粒，在使用大腸桿菌BL21株的情況下，使用pTrc99A作為媒介質(zhì)粒。另外，在使用大腸桿菌作為宿主的情況下，始終表達(dá)細(xì)胞色素C成熟化(Cytochrome C maturationccm)的基因組。首先，根據(jù)通常方法從JM109株中取得含有編碼大腸桿菌ccm基因組的序列的DNA，將其插入媒介質(zhì)粒，形成ccm表達(dá)用質(zhì)粒。在此時(shí)，使用pBBR122作為媒介質(zhì)粒。其次，在導(dǎo)入完成GDH表達(dá)用質(zhì)粒的宿主大腸桿菌中，導(dǎo)入ccm表達(dá)用質(zhì)粒，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
對(duì)于各自的轉(zhuǎn)化體，分別進(jìn)行培養(yǎng)。
惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體的情況，如通常那樣在有氧氣條件下在20L的培養(yǎng)液中進(jìn)行。培養(yǎng)液的組成設(shè)定為3.2％聚蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、2％甘油、0.05mL/Lアデカノ一ルLG-126(旭電化東京)、50μg/mL鏈霉素(pH7.0)。對(duì)于培養(yǎng)液來(lái)說(shuō)，將200mL的前培養(yǎng)液進(jìn)行植菌，在34℃下開(kāi)始培養(yǎng)。從開(kāi)始培養(yǎng)4小時(shí)后，添加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，成為0.2mM，再培養(yǎng)20小時(shí)，得到本培養(yǎng)液。以夏普勒斯型離心分離機(jī)離心分離本培養(yǎng)液，對(duì)于惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)，得到約800g的菌體。
在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體的情況下，就培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，如通常那樣在有氧條件下在2L培養(yǎng)液中進(jìn)行。培養(yǎng)液的組成設(shè)定為3.2％聚蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、2％甘油、0.05mL/L アデカノ一ルLG-126(旭電化東京)、50μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素(pH7.0)。對(duì)于培養(yǎng)液來(lái)說(shuō)，將50mL的前培養(yǎng)液進(jìn)行植菌，在30℃下培養(yǎng)29小時(shí)。由離心分離從培養(yǎng)液得到約85g大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體。
接著，所得到的菌體(轉(zhuǎn)化體)懸濁在10mM磷酸緩沖液(pH8)中，使用高壓均質(zhì)器(500bar)粉碎以后，分別添加マイド一ル12(花王、東京)和KCl，使它們分別為1％和0.1M，攪拌30分鐘。接著，通過(guò)離心分離(8000×g、60分鐘、10℃)，作為沉淀除去細(xì)胞固形物，得到上清液為粗酶溶液。
粗酶液，對(duì)于惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)，GDH活性是2930kU、比活性是22U/mg，對(duì)于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)，GDH活性是259kU、比活性是10.3U/mg。
<葡萄糖脫氫活性的測(cè)定方法>
葡萄糖脫氫活性，基于葡萄糖的脫氫化，通過(guò)跟蹤電子接收體的還原反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。作為電子接收體，使用2，6-二氯苯酚靛酚(DCIP)和菲雙甲氧硫酸鹽(PMS)。
具體地說(shuō)，首先在分光光度計(jì)的比色皿中添加900μL的含有20mM葡萄糖、2mM PMS和0.1mM DCIP的47mM磷酸緩沖液(pH6.0)，在37℃預(yù)培育3分鐘。接著，添加0.5～10μL的酶溶液、直接顛倒混合使反應(yīng)開(kāi)始，在37℃、經(jīng)時(shí)地測(cè)定波長(zhǎng)為600nm時(shí)的吸光度下降。DCIP的吸收波長(zhǎng)是600nm，吸光度降低，基于葡萄糖的脫氫化，是由于電子接收體的還原反應(yīng)引起的。
這里，在吸光度運(yùn)算時(shí)，DCIP的摩爾吸光系數(shù)設(shè)為4.76mM/cm。1單位酶(U)，定義為在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下，每1分鐘氧化1μM的葡萄糖的量。蛋白質(zhì)濃度，使用UV法測(cè)定，280nm處的吸收為1時(shí)的蛋白質(zhì)濃度定義為1g/L。
在本實(shí)施例中，根據(jù)上述方法，組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制從KS1株得到的酶溶液(可溶化GDH部分)。
疏水層析法，使用由60mM磷酸緩沖液(pH6)預(yù)先平衡化的Octylsepharose(辛基瓊脂糖凝膠)4Fast Flow柱(44mmID×20cmAmershambiosciences)進(jìn)行。對(duì)于柱來(lái)說(shuō)，為了使最終濃度成為60mM，供給了添加1M磷酸緩沖液(pH6)而配制的可溶化GDH部分(酶溶液)。接著，將600mL的60mM磷酸緩沖液(pH6)、900mL的20mM磷酸緩沖液(pH8)通過(guò)柱后，由通過(guò)洗脫液將牢固吸附的GDH洗脫。作為洗脫液來(lái)說(shuō)，使用膽酸鈉溶解于20mM磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液。以15mL/min的流速供給洗脫液，使得膽酸鈉的濃度在0～1重量％的范圍內(nèi)直線地變化。
其結(jié)果是，GDH在膽酸鈉的濃度約0.8重量％時(shí)被溶出，可以回收340mL的具有GDH活性的部分。測(cè)定該回收部分(Octyl回收部分)的活性，比活性為108U/mg，總活性是16kU。
陰離子交換層析法，使用由20mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(32mmID×12cm Amershambiosciences)進(jìn)行。對(duì)該柱來(lái)說(shuō)，供給Octyl回收部分后，供給洗脫液。作為洗脫液來(lái)說(shuō)，使用含有1重量％膽酸鈉的20mM磷酸緩沖液(pH8)。以流速8mL/min供給600mL洗脫液。
其結(jié)果是，洗脫液通過(guò)300mL左右時(shí)，GDH被特異地溶出，可以回收340mL具有GDH活性的部分。測(cè)定該回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是770U/mg，總活性是14kU。
在下述表2示出各操作中的液量、總活性、比活性和收率。
表2
在本實(shí)施例中，組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液。
在疏水層析法中，首先對(duì)于由含有0.1M的KCl的10mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的Phenyl cellulofine柱(300mmID×10cmチツソ、東京)，供給粗酶溶液、使GDH保持在填充劑中。接著，將7L含有0.1M KCl的10mM磷酸緩沖液(pH8)、21L的10mM磷酸緩沖液(pH8)通過(guò)柱后，由通過(guò)1洗脫液將牢固吸附的GDH溶出。作為洗脫液來(lái)說(shuō)，使用膽酸鈉溶解于20mM磷酸緩沖液(pH8)形成的溶液。以7L/hr的流速供給洗脫液，使得膽酸鈉的濃度在0～1重量％的范圍內(nèi)直線地變化。
其結(jié)果是，GDH在膽酸鈉的濃度約為0.9重量％時(shí)被溶出，可以回收7300mL的活性部分。測(cè)定該回收部分(Phenyl回收部分)的活性，比活性是204U/mg，總活性是596kU。
陰離子交換層析法，使用由10mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(44mmID×20cm Amershambiosciences)進(jìn)行。對(duì)該柱來(lái)說(shuō)，供給Phenyl回收部分。Phenyl回收部分，使用部分分子量為50000的實(shí)驗(yàn)?zāi)K(ラボモジユ一ル)(旭化成東京)，在10mM磷酸緩沖液(pH8)中緩沖置換后供給至柱中。接著，對(duì)于柱供給600mL的10mM磷酸緩沖液(pH8)后，供給洗脫液。使用含有1重量％膽酸鈉的10mM磷酸緩沖液(pH8)作為洗脫液。洗脫液以流速10mL/min供給。
其結(jié)果是，洗脫液通過(guò)1400mL左右時(shí)，GDH被特異地溶出，回收315mL的活性部分。測(cè)定該回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是1283U/mg、總活性是390kU。
在下述表3表示各操作中的液量、總活性、比活性和收率。
表3

本實(shí)施例中，還以SDS-PAGE進(jìn)行了Phenyl回收部分和Q回收部分的電泳。SDS-PAGE，使用Tris-Tricine緩沖液、在8～25％聚丙烯酰胺的梯度凝膠中實(shí)施。對(duì)在凝膠中泳動(dòng)的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，進(jìn)行CBB染色。圖1表示了SDS-PAGE電泳的結(jié)果。在該圖中，路線2表示Phenyl回收部分的CBB染色，路線3表示Q回收部分的CBB染色。
在本實(shí)施例中，組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液。
疏水層析法與實(shí)施例2同樣地進(jìn)行，超濃縮回收溶液，得到比活性為300U/mg、總活性為21kU的Phenyl回收部分。
陰離子交換層析法，使用由10mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的QAE-トヨパ一ル550柱(44mmID×10cm東ソ一、東京)進(jìn)行。對(duì)于該柱來(lái)說(shuō)，供給Phenyl回收部分后，供給洗脫液。使用含有1重量％膽酸鈉的10mM磷酸緩沖液(pH8)作為洗脫液。洗脫液以流速5mL/min供給2000mL。
其結(jié)果是，洗脫液通過(guò)1600mL左右時(shí)，GDH被特異地溶出，回收300mL的活性部分。測(cè)定該回收部分(QAE回收部分)的活性，比活性是1500U/mg、總活性是7.8kU。
在下述表4示出各操作中的液量、總活性、比活性、收率。
表4

本實(shí)施例中，以與實(shí)施例2同樣的方法，以SDS-PAGE進(jìn)行了QAE回收部分的電泳后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行CBB染色。圖1表示了SDS-PAGE電泳的結(jié)果。在該圖中，路線4表示QAE回收部分。
本比較例中，組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制從惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液。
疏水層析法與實(shí)施例2同樣地進(jìn)行，得到7200mL的比活性314U/mg、總活性256kU的Phenyl回收部分。但是，在本比較例中，對(duì)于相當(dāng)于Phenyl回收部分中的總活性39kU的1100mL(Q apply)，接著進(jìn)行陰離子交換層析法的說(shuō)明。
陰離子交換層析法，使用由10mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(44mmID×13cm Amershambiosciences)進(jìn)行。對(duì)于該柱來(lái)說(shuō)，供給Q apply。此后，對(duì)于柱供給800mL的10mM磷酸緩沖液(pH8)，洗脫非吸附蛋白質(zhì)。接著，對(duì)于柱供給洗脫液。使用在10mM磷酸緩沖液(pH8)中溶解有NaCl的溶液作為洗脫液。以7.5mL/min的流速供給洗脫液，使得NaCl的濃度在0～0.6M的范圍內(nèi)直線地變化。
其結(jié)果是，GDH在NaCl濃度為約0.25M和約0.4M的兩處溶出，回收140mL和360mL的回收部分。測(cè)定這些回收部分(Q回收部分(1)和Q回收部分(2))的活性，Q回收部分(1)比活性是600U/mg、總活性是4.5kU，Q回收部分(2)比活性是432U/mg、總活性是12kU。
在下述表5表示各操作中的液量、總活性、比活性和收率。
表5

本比較例中，以與實(shí)施例2同樣的方法，以SDS-PAGE進(jìn)行了Phenyl回收部分和Q回收部分(2)的電泳后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行CBB染色。圖2表示了SDS-PAGE電泳的結(jié)果。在該圖中，路線2表示Phenyl回收部分、路線3表示Q回收部分(1)。
本比較例中，在比較例1得到的Phenyl回收部分之中相當(dāng)于總活性74kU的2100mL(QAE apply)，使用陰離子交換層析法精制GDH。
陰離子交換層析法，使用由10mM磷酸緩沖液(pH8)預(yù)先平衡化的QAE-トヨパ一ル550柱(44mmID×10cm東ソ一、東京)進(jìn)行。對(duì)于該柱來(lái)說(shuō)，首先供給QAE回收部分(總活性74kU)。此后，對(duì)柱供給800mL的10mM磷酸緩沖液(pH8)，洗脫非吸附蛋白質(zhì)。接著，對(duì)柱供給洗脫液。使用在10mM磷酸緩沖液(pH8)中溶解有KCl的溶液作為洗脫液。以5mL/min的流速供給洗脫液，使得NaCl濃度在0～1M的范圍直線變化。
其結(jié)果是，GDH在KCl濃度為約0.23M和約0.43M的兩處溶出，回收200mL和400mL的回收部分。分別測(cè)定這些回收部分(QAE回收部分(1)和QAE回收部分(2))的活性，QAE回收部分(1)比活性是399U/mg、總活性是7.4kU，QAE回收部分(2)比活性是217U/mg、總活性是6.4kU。
在下述表6示出各操作中的液量、總活性、比活性和收率。
表6

本比較例中，以與實(shí)施例2同樣的方法，以SDS-PAGE進(jìn)行了QAE回收部分(2)的電泳后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行CBB染色。圖2表示了SDS-PAGE電泳的結(jié)果。在該圖中，路線4表示QAE回收部分(2)。
本實(shí)施例中，組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制從大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體得到的粗酶溶液。
疏水層析法，使用Octyl sepharose 4Fast Flow柱、在與實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行。
其結(jié)果是，GDH在膽酸鈉的濃度約為0.8重量％時(shí)被溶出，可以回收220mL具有GDH活性的部分。測(cè)定該回收部分(Octyl回收部分)的活性，比活性是503U/mg、總活性是149kU。
陰離子交換層析法，使用Q sepharose Fast Flow柱、在與實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行。
其結(jié)果是，洗脫液通過(guò)500mL左右時(shí)，GDH被特異地溶出，回收175mL具有GDH活性的部分。測(cè)定該回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是1147U/mg、總活性是50kU。
在下述表7示出各操作中的液量、總活性、比活性和收率。
表7

本實(shí)施例中，以與實(shí)施例2同樣的方法，以SDS-PAGE進(jìn)行了Q回收部分的電泳后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行CBB染色。圖3表示了SDS-PAGE電泳的結(jié)果。在該圖中，路線3表示本實(shí)施例的Q回收部分。在圖3中，對(duì)實(shí)施例1中的Q回收部分(路線2)和實(shí)施例2中的Q回收部分(路線4)也同時(shí)進(jìn)行電泳。
<結(jié)果的討論>
從表2～表7可以看出，使用膽酸鈉作為洗脫劑使GDH溶出時(shí)(實(shí)施例1至4)，與使用NaCl或KCl作為洗脫劑將GDH進(jìn)行梯度溶出時(shí)(比較例1和2)相比，能夠最終的比活性高并高效率地精制GDH。關(guān)于這一點(diǎn)，在圖1和圖2中也明確地顯示出。即，源自KS1株的GDH，由α、β、γ亞單位組成，這些亞單位在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量，分別是約60kDa、約43kDa和約14kDa。如果站在這一點(diǎn)上看圖1和圖2，實(shí)施例2和3得到的回收部分，與比較例1和2得到的回收部分相比，相當(dāng)于α、β、γ亞單位的帶大、其它分子量的蛋白質(zhì)變少。因此，可以說(shuō)組合疏水層析法和陰離子交換層析法來(lái)精制GDH時(shí)，在使用膽酸鈉洗脫GDH時(shí)，可以高效率地精制GDH。
另外，從圖3可以看出，在使用來(lái)自以宿主為大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體的粗酶時(shí)，雖然相當(dāng)于γ亞單位的帶小，但與使用相當(dāng)于α、β亞單位的帶等其它的粗酶溶液時(shí)相比，是很大的。另外，大腸桿菌廉價(jià)而且容易得到，同時(shí)自己增殖性優(yōu)異。因此，在考慮到工業(yè)性應(yīng)用的情況下，從以大腸桿菌作為宿主的轉(zhuǎn)化體得到粗酶溶液、精制該粗酶溶液得到GDH的方法可以說(shuō)是有用的。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)的精制方法，它是從目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解的蛋白質(zhì)溶液、利用液體層析法、精制所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述液體層析法包括在填充有填充劑的填充槽中導(dǎo)入所述蛋白質(zhì)溶液、使所述目標(biāo)蛋白質(zhì)保持在所述填充劑中的第一步驟；和使用含有羥基膽烷酸的洗脫液、從所述填充劑中洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的第二步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白質(zhì)包含電子傳遞蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是含有具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)的葡萄糖脫氫酶。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述填充劑是離子交換樹(shù)脂。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述離子交換樹(shù)脂具有季銨基作為交換基。
6.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述電子傳遞蛋白質(zhì)在還原條件下在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量是約43kDa，具有所述葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)在還原條件下在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測(cè)定的分子量是約60kDa。
7.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述羥基膽烷酸鹽是膽酸鹽。
8.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述目標(biāo)蛋白質(zhì)從所述填充劑中的洗脫，使所述洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度固定地來(lái)進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度從0.5～2.5重量％的范圍內(nèi)來(lái)選擇。
10.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶是具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物產(chǎn)生的。
11.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述屬于Burkhorderia屬的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERM BP-7306)。
12.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶是轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的，該轉(zhuǎn)化體是在宿主微生物導(dǎo)入從具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物取得的所述電子傳遞蛋白質(zhì)及編碼具有所述葡萄糖活性的蛋白質(zhì)的DNA所形成的。
13.如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是惡臭假單胞菌。
14.如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是大腸桿菌。
15.一種葡萄糖脫氫酶的精制方法，它是組合疏水層析法和陰離子交換層析法精制葡萄糖脫氫酶的方法，其特征在于所述疏水層析法包括使所述葡萄糖脫氫酶保持于固定相的步驟；使不需要的蛋白質(zhì)洗脫的步驟；使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液洗脫所述葡萄糖脫氫酶的步驟，所述陰離子交換層析法包括使所述葡萄糖脫氫酶保持于固定相的步驟；使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液洗脫所述葡萄糖脫氫酶的步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于在所述疏水層析法中，所述葡萄糖脫氫酶的洗脫，使所述洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度隨著時(shí)間變化來(lái)進(jìn)行，在所述陰離子交換層析法中，所述葡萄糖脫氫酶的洗脫，使所述洗脫液中的羥基膽烷酸鹽的濃度固定地來(lái)進(jìn)行。
17.如權(quán)利要求16所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于在進(jìn)行所述疏水層析法之后，進(jìn)行所述陰離子交換層析法。
18.如權(quán)利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶是具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物產(chǎn)生的。
19.如權(quán)利要求18所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于屬于所述Burkhorderia屬的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERM BP-7306)。
20.如權(quán)利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶是轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的，該轉(zhuǎn)化體是在宿主微生物中導(dǎo)入從具有產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶能力的屬于Burkhorderia屬的微生物取得的編碼所述葡萄糖脫氫酶的DNA所形成的。
21.如權(quán)利要求20所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是惡臭假單胞菌。
22.如權(quán)利要求20所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是大腸桿菌。
23.如權(quán)利要求15所述的葡萄糖脫氫酶的精制方法，其特征在于所述陰離子交換層析法使用具有季銨基作為離子交換基的離子交換樹(shù)脂來(lái)進(jìn)行，作為所述羥基膽烷酸鹽，使用膽酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及從含有電子傳遞蛋白質(zhì)的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解的蛋白質(zhì)溶液、利用液體層析法、精制所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。液體層析法通過(guò)如下這樣來(lái)進(jìn)行，即，在填充有填充劑的填充槽中導(dǎo)入所述蛋白質(zhì)溶液，使所述填充劑和所述目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合后，除去雜質(zhì)，使用含有羥基膽烷酸鹽的洗脫液，從所述填充劑中洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白質(zhì)，例如是含有具有葡萄糖脫氫活性的蛋白質(zhì)的葡萄糖脫氫酶。液體層析法，組合疏水層析法和陰離子交換層析法來(lái)進(jìn)行。
文檔編號(hào)C07K1/20GK1751119SQ0382473
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者山岡秀亮, 黑坂啓介, 川瀬至道 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社