專利名稱：調控十字花科植物開花時間的物質和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于調控十字花科植物開花時間領域，具體涉及調控十字花科植物開花時間的物質和方法。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa. pekinensis)是ー種重要的蔬菜作物,其營養(yǎng)生長階段分為四個發(fā)育時期幼苗期、蓮座期、包心期和結球期。這種二年生草本植物需要經歷ー個冬天才能開花，植物經過低溫處理后，到第二年春天開花，這個過程叫春化。在大白菜營養(yǎng)生長的任ー時期，只要有20-50天的低溫環(huán)境(10°C以下)，植株就能通過春化作用進入生殖生長階段。在生產上，“未熟抽薹”是造成大白菜產量和品質損失的一大難題，其原因是植株在結球期和結球期之前就通過春化作用而抽薹，導致植株無法結球和形成散球。為了保證產品器官-葉球的充分發(fā)育和產量形成，育種家往往將晚抽薹作為ー個重要育種目標，而栽培者則通過播種期的安排避免大白菜生殖生長階段的到來。在擬南芥中，FLOWER LO⑶S C(FLC)作為ー種重要的開花抑制蛋白負調控春化作用，參與植株從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉化過程。擬南芥生態(tài)型Col自身FLC表達較弱，所以不經過春化也可以開花。但在ー些突變體中發(fā)現FLC表達會上調。通過對突變體的鑒定發(fā)現對FLC表達起促進作用的FRI，和對FLC表達抑制的FCA，FLD, LD, FVE。其中FRI (FRIGIDA)可協調mRNA 的 5’帽子結構與Paf (PolII-associated factor complex)的相互作用而起到修飾染色質的作用；FCA是個有RNA結合結構域的蛋白，它對mRNA的poly (A)尾巴形成起作用；FLD (FLOWERING LOCUS D, a homo log of the humanlysine-specif icdeme thy I as e I (LSD I))是催化組蛋白H3K4位點上去甲基化的酶。除了這些調控FLC表達的蛋白外，對FLC表達起明顯調控效果的環(huán)境因素是低溫處理，即春化。春化中FLC表達受抑制主要通過誘導表達FLC基因區(qū)域的非編碼RNA的表達，然后由非編碼RNA介導組蛋白甲基化，從而在表觀遺傳上抑制FLC的表達。FLC在春化中受到表觀遺傳學上的抑制，主要是激活型組蛋白修飾(こ?；?，H3K4me3)的消失，和抑制型組蛋白修飾(H3K9me3，H3K27me3)的増加。VIN3只在擬南芥春化過程中表達，它結合FLC的啟動子和第一個內含子區(qū)域，導致在春化中，該區(qū)域的組蛋白去こ?；?Wood et al.，2006)。組蛋白的H3K4me3去甲基化由FLD(FLOWERING LOCUS D, a homologof the human lysine-specific demethylase I(LSDI))催化的(Liu et al. , 2007) VRN2 (Gendall et al.，2001)和 LHPl (Sung et al. ,2006)分別通過調節(jié)H3K27me3和H3K9me3甲基化來維持FLC的抑制狀態(tài)。非編碼的RNA同樣會參與到FLC在春化中的表觀遺傳學抑制，其中就包括FLC的反向轉錄本和反向轉錄本啟動子區(qū)域的短RNA。研究發(fā)現，擬南芥植株體內存在ー種非編碼的FLC反義轉錄本(Naturalantisence transcripts, NATS),它與FLC正義轉錄本的表達水平有關。擬南芥的天然反向轉錄本最早在2003年通過Tilling發(fā)現的。2007年通過Northern blot在FLC3’端雜交得到兩條小RNA，大小分別為24nt和30nt，方向相反。2009年Nature報道了擬南芥FLC兩個反向轉錄本的序列，該小RNA的產生位置不在反向轉錄本的第一個外顯子內，位于反向轉錄本的啟動子區(qū)域，同樣小RNA位于FLC正向轉錄本Poly⑷尾巴后面,所以可以排除是Nat-siRNA(Swiezewskiet al. ,2007)。由于它位于反向轉錄本啟動子附近,它有可能屬于動物中報道的啟動子區(qū)域的短RNA(PASRs)，FLC3’端的短RNA是否會介導組蛋白甲基化，有待于進一步的研究。大白菜和擬南芥同屬于十字花科植物,親緣關 系較近。大白菜(Brassicarapa)是嚴格需要春化才能開花的，和擬南芥相比，大白菜中FLC的表達量要高。2007年(Kim etal.，2007)報道大白菜基因組中共有3個FLC，即fcpFLCI、BrpFLC2、BrpFLC3。其中fcpFLC2位于2號染色體上，BrpFLCl位于10號染色體上，BrpFLC3位于3號染色體上。它們在春化中都會受到表觀遺傳上的抑制，從而起始開花基因的表達。2007年NCBI上公布了大白菜FLC，BrpFLC2的反向轉錄本的EST序列(EX096192)。但cDNA文庫的材料來源不是春化中的大白菜，而是軟腐菌侵染24小時內的大白菜葉片。

發(fā)明內容
為了深入了解大白菜春化作用的分子機制，我們啟動了大白菜FLC正向和反向轉錄本的分離和功能研究。從大白菜早抽薹(早薹zaotai)和晚抽薹(晚薹wantai)基因型中，我們分別克隆了 4個FLC同源基因和ー個天然反向轉錄本。FLC同源基因分別被命名為 BrpFLCl (Genbank 登陸號 AYl 15678)、BrpFLC2 (Genbank 登陸號 AY205317)、BrpFLC3 (Genbank 登陸號 AYl 15677)和 BrpFLC5 (Genbank 登陸號 AYl 15675)，而ー個反向轉錄本被命名為BrpFLC2as (Genbank登陸號EX096192)。有趣的是，早抽薹基因型和晚抽薹基因型所有FLC同源基因和反向轉錄本的基因組序列完全一致，表明大白菜早抽薹和晚抽薹的性狀不是由于兩個基因型FLC基因的序列差別造成的。對早抽薹基因型zaotai和晚抽薹基因型wantai的幼苗分別進行低溫春化處理。Northern blotting的檢測結果表明，在BrpFLC基因3’端下游有150nt的短片段RNA,它在春化末期的葉片，及花和果莢中表達較高。由于它產生的位置位于反向轉錄本的啟動子區(qū)域，所以推測其可能是類似動物中報道的promoter-associated short RNA作用于BrpFLC2as的啟動子區(qū)域。這樣，BrpFLC基因的3’端的短非編碼RNA參與了春化中BrpFLC的表觀遺傳抑制。Northern雜交顯示，在早抽薹和晚抽薹基因型的3’ UTR下游存在150nt短片段RNA與BrpFLC基因方向轉錄本有重疊區(qū)域。在花和果莢中表達較高，在未春化的葉中表達較低。隨著春化的進行，表達量逐漸升高。預測該短片段RNA會像動物中promoter-associated short RNAs那樣結合SUZ12,從而介導組蛋白H3K27me3的甲基化。免疫共沉淀的結果證明，低溫誘導BrpFLC2的基因中間部分H3K27me3的甲基化。根據大白菜早抽薹和晚抽薹基因型春化作用的特點、BrpFLC基因3’端下游非編碼的短片段RNA的表達方式及其在擬南芥轉基因植株中的功能，我們提出了 BrpFLC2的3’端非編碼RNA通過介導大白菜春化作用來調節(jié)大白菜開花時間。我們的研究結果對于遺傳上改良大白菜開花時間和產品器官的形成提供可靠地理論依據。因此，本發(fā)明第一方面提供一種分離的多核苷酸序列，選自(a)含SEQ ID NO 13所示序列的多核苷酸序列；(b)對(a)所述的序列進行ー個或幾個堿基的取代、缺失、插入修飾所獲得的多核苷酸序列，該多核苷酸序列能夠調節(jié)十字花科植物春化作用； (c)與(a)或(b)所述多核苷酸序列互補的序列；和(d)在嚴格條件下與(a)、(b)或(C)所述序列雜交的核苷酸序列。在一具體實施方式
中，所述多核苷酸序列如SEQ ID N0:13所不。本發(fā)明第二方面提供一種多核苷酸構建物，所述多核苷酸構建物含有本發(fā)明所述的多核苷酸序列。本發(fā)明第三方面提供一種轉化體，所述轉化體轉化了本發(fā)明所述的多核苷酸構建物。在一具體實施方式
中，所述轉化體選自十字花科植物的細胞、組織和器官。本發(fā)明第四方面提供一種調控十字花科植物開花時間的方法，所述方法包括調控所述十字花科植物中SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的表達，從而調控該十字花科植物的開花時間。在一具體實施方式
中，所述方法包括抑制所述十字花科植物中SEQ IDN0:13所示的序列或其同源序列的表達，從而推遲該十字花科植物的開花時間。在一具體實施方式
中，所述方法包括提高所述十字花科植物中SEQ IDN0:13所示的序列或其同源序列的表達，從而促進該十字花科植物的開花時間。在一具體實施方式
中，所述十字花科植物選自自大白菜、青菜、甘藍、油菜和蘿卜。本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明所述的多核苷酸序列或多核苷酸構建物在調控大白菜FLC2基因或其同源基因的基因中間部分H3K27me3的甲基化中的應用。本發(fā)明第六方面提供ー種制備轉基因十字花科植物的方法，所述方法包括(I)構建能過表達SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的多核苷酸構建物，或能敲除或突變SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的多核苷酸構建物；(2)將步驟(I)所獲得的多核苷酸構建物轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列過表達、弱表達或不表達的植物細胞、組織、器官或種子；和(3)將步驟(2)獲得的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物?！叭醣磉_”指與野生型的表達相比，SEQ ID NO 13或其同源序列的表達弱。


圖I顯示Northern Blot雜交結果。結果顯示，FLC基因3’ -UTR下游存在與BrpFLCas同源的短片段RNA。圖2顯示probe a對應區(qū)域的5’和3’各設計探針做Northern Blot。圖3顯示Northern雜交結果，結果顯示BrpFLC2基因3’UTRecht下游短片段RNA的表達模式，探針為probe a。圖4顯示Chip結果，結果顯示在白菜植株春化13天吋，BrpFLC基因內部存在H3K27me3甲基化。圖5顯示BrpFLC基因可能存在甲基化的區(qū)域，分別對應PCR的引物為，I和2 ;3和 4 ;5 和 6。其中，I bfgd5 ；2 BrpFLC-22a ；3 BrpFLC-1993s ；4 BrpFLC3 ；5 probes ；6 bfgd3 ;其中I和2引物擴啟動子區(qū)域的352bp，3和4引物擴基因內部的192bp，5和6引物擴基因3，端的147bp。圖6顯示十字花科中大蒜芥屬的水蒜芥(Sisymbrium irio, Si)和蕓薹屬的甘藍(Brassica oleracea, Bo)中的同源序列與大白菜(Br)的序列對比結果。
具體實施例方式本發(fā)明中，術語“調控”指采用生物學手段人為地控制十字花科植物春化作用或開花時間。本發(fā)明中，調控的方法可包括采用基因工程技術過表達SEQ ID N0:13所示的序列或其同源序列，或通過轉入能敲除或突變SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的多核苷酸構建物，從而抑制其表達，控制開花時間。過表達和轉入各種多核苷酸構建物以敲除或突變基因的方法是本領域周知的。本發(fā)明中，十字花科植物包括但不限于大白菜、青菜、甘藍、蘿卜等。本發(fā)明包括在其它十字花科植物中發(fā)現的SEQ ID N0:13的同源序列。同源序列在本文中指表明兩個或多個蛋白質或核苷酸序列可能具有相同的祖先，且有相似的功能。蛋白質和DNA的同源性常常通過它們序列的相似性來判定。例如，如果兩個基因有著幾乎一祥的DNA序列，那么它們很可能同源。可以序列同一性來定義本文的同源序列。換言之,本發(fā)明包括表現出SEQ IDNO 13具有相當大百分比序列同一性的多核苷酸分子。尤其感興趣的是這樣的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在十字花科植物中發(fā)揮功能以介導十字花科植物的春化作用，并且與SEQ ID NO :13具有至少約70%序列同一』丨生、至少約80%序列同一』丨生、至少約90%序列同一性或甚至更高(例如94%、95%、96%、97%、98%、99% )的序列同一性?！鞍俜直刃蛄型恍浴敝府攦蓚€序列得到最佳比對時(具有適當的核苷酸插入、缺失或在比較窗口中總計低于參照序列20%的缺ロ)，與測試多核苷酸分子(或其互補鏈)相比，參照多核苷酸分子(或其互補鏈)的線性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分數。最佳序列比對為本領域技術人員所熟知，并且可以通過工具(例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比對算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法)實施，并優(yōu)選通過計算機化執(zhí)行這類算法(例如作為GCG Wisconsin Package (AccelrysInc. ,SanDiego, CA)的部分提供的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)而實施。測試序列和參照序列比對片段的“同一性分數”是兩個比對序列共有的相同組分的數目除以參照序列片段(即整個參照序列或參照序列中詳細說明的較小部分)中的組分總數目。將百分比序列同一‘丨生表不為同一‘丨生分數乘以100。ー個或多個多核苷酸序列可以與全長多核苷酸序列或其部分、或與更長的多核苷酸序列比較。當多核苷酸分子在特定條件下特異性地雜交以形成雙鏈體分子吋，它們是同源的。在這些條件下(稱為嚴格條件)，ー個多核苷酸分子可以用作鑒定共有同源性的另ー個多核苷酸分子的探針或引物。短語“嚴格條件”是關于核酸探針與靶核酸(即與特定的目的核酸序列)通過特定雜交程序雜交而功能性定義的，所述雜交程序在Sambrook等人(2000)中進行討論。因此，本發(fā)明的核苷酸序列可以因其與多核苷酸分子片段的一段互補序列選擇性地形成雙鏈體分子的能力而得到利用。
根據設想的應用，人們需要采用不同的雜交條件以獲得探針對靶序列的不同程度的選擇性。對于要求高選擇性的應用，人們一般需要采用相対的高嚴格條件以形成雜交體，例如，人們將選擇相對低鹽和/或高溫條件，例如在約50°C至約70°C溫度、約0. 02M至約0. 15M NaCl所提供的條件。例如，高嚴格條件是以高嚴格性洗滌緩沖液(0.2X SSC, 0. 1%SDS，65°C)將雜交過濾器(filter)洗滌至少兩次。促進DNA雜交的合適的中等嚴格性條件為本領域技術人員所公知，例如約45°C、6. Ox 氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨后為50°C的2. OxSSC洗滌。另外，可以從50°C、約2. OxSSC的低嚴格性至50で、約0. 2xSSC的高嚴格性選擇洗滌步驟中的鹽濃度。另外，可以從室溫(約22°C)的低嚴格性條件至約65°C的高嚴格性條件増加洗滌步驟中的溫度。溫度和鹽均可以變化，或者可以保持溫度或鹽濃度恒定而改變另ー個變量。這樣的選擇性條件允許探針和模板或靶鏈之間的很少的錯配。通過雜交檢測多核苷酸分子為本領域技術人員所熟知，且美國專利4，965，188和5，176，995的教導是雜交分析方法的示例。也可以通過計算機程序確定同源性，所述計算機程序比對多核苷酸序列并評價多核苷酸分子在確定的嚴格性條件下形成雙鏈體分子的能力。將共有高同源性程度的不同來源的多核苷酸分子稱為“同源的”。在另ー個實施方案中，可以修飾或改變如SEQ ID NO :13所示的多核苷酸序列。改變多核苷酸序列的一個優(yōu)選方法是使用PCR以修飾序列中所選核苷酸或區(qū)域。這些方法為本領域技術人員所熟知?？梢栽诨赑CR的DNA修飾方法中通過例如模板序列的插入、缺失或置換而修飾序列。在本發(fā)明的上下文中，“變體”是含有變化的多核苷酸序列，在所述多核苷酸序列中，優(yōu)選在基本保持該多核苷酸序列功能的同時缺失、添加和/或替代原始啟動子的一個或幾個核苷酸。例如，可以從啟動子5’或3’末端缺失ー個或幾個堿基以產生“截短的”啟動子。可以在啟動子內部插入、缺失或替代ー個或幾個堿基。本文所用的“構建物”指來自任何來源的任何重組多核苷酸分子，例如質粒、粘粒、病毒、自主復制多核苷酸分子、噬菌體、或線性或環(huán)形單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其能夠進行基因組整合或自主復制，包含其中ー個或多個多核苷酸分子以功能上可操作的方式連接的多核苷酸分子。在某些具體實施例中，本發(fā)明的構建物是ー種載體，優(yōu)選為表達載體。本文所用的“可操作地連接”指第一個多核苷酸分子(例如啟動子)與第二個可轉錄的多核苷酸分子(例如目的基因)連接，其中多核苷酸分子如此排列，從而第一個多核苷酸分子影響第二個多核苷酸分子的功能。優(yōu)選地，兩個多核苷酸分子是單個連續(xù)多核苷酸分子的部分，且更優(yōu)選是臨近的。例如，如果啟動子在細胞內調節(jié)或介導目的基因的轉錄，則該啟動子與目的基因可操作地連接。本文所用的“可轉錄的多核苷酸分子”指能夠被轉錄為RNA分子的任何多核苷酸分子。已知以使可轉錄的多核苷酸分子被轉錄為功能mRNA分子的方式將構建體引入細胞的方法，所述功能mRNA分子得到翻譯并從而表達為蛋白質產物。為了抑制特定的目的RNA分子的翻譯，也可以構建能夠表達反義RNA分子的構建體。為了實施本發(fā)明，制備和使用構建體和宿主細胞的常規(guī)組合物和方法為本領域技術人員所熟知，見例如Sambrook等人。本發(fā)明的構建物一般可以含有與可轉錄的多核苷酸分子可操作地連接的啟動子，該可轉錄的多核苷酸分子與3’轉錄終止多核苷酸分子可操作地連接。另外，構建物可以包括但不限于來自植物基因3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)的額外的調節(jié)多核苷酸分子(例如，増加mRNA的mRNA穩(wěn)定性的3’UTR)。構建體可以包含但不限于mRNA多核苷酸分子的5’非翻譯區(qū)(5，UTR)，所述5’非翻譯區(qū)在翻譯起始中具有重要作用，并且也可以是植物表達構建體中的基因組分。術語“轉化的”指已引入了外來多核苷酸分子例如構建物的細胞、組織、器官或生物。優(yōu)選將引入的多核苷酸分子整合到受體細胞、組織、器官或生物的基因組DNA中，從而使引入的多核苷酸分子由后代遺傳。因此，本文中，“轉化體”包括引入或轉化了本發(fā)明的啟動子序列或構建物的各種細胞、組織和器官。所述細胞、組織和器官可無法獨自繁育成単個植株?！稗D基因的”或“轉化的”細胞或生物也包括細胞或生物的后代，以及在雜交中采用這樣的轉基因植物作為親本、并表現出由于存在外來多核苷酸分子而產生的改變的表型的育種程序產生的后代?？梢酝ㄟ^任何植物轉化方法將含有本發(fā)明啟動子的植物轉化構建體引入植物。在本發(fā)明的實踐中通過將植物表達構建體引入植物基因組而轉化植物的方法和材料可以包含任何公知的和經過證明的方法，包括美國專利5384253中說明的電穿孔；美國專利 5015580、5550318、5538880、6160208、6399861 和 6403865 中說明的微粒轟擊；美國專利5635055、5824877、5591616和5981840說明的土壤桿菌介導的轉化；以及美國專利 5508184中說明的原生質體轉化，所有這些專利都在此引用作為參考。因此，本發(fā)明包括采用基因工程方法調控十字花科植物春化作用，例如，采用上文所述的轉化方法轉入所需的多核苷酸構建物至植物的任何一部分中，包括細胞、組織、器官或生物的基因組DNA中，使其所述多核苷酸構建物在該部分中表達所需的基因，如本文所述的SEQ ID NO :13或其同源序列，由此控制春化作用，促進早抽薹或晚抽薹。轉化的時間可由本領域技術人員根據本領域常規(guī)技術進行選擇。I.材料與方法I. I 材料大白菜早薹zaotai和晚苔wantai兩個大白菜品種(種子來自上海孫橋農業(yè)科技有限公司)抽薹特性不同。早薹zaotai在低溫下處理15-20天即可通過春化作用而抽薹，晚苔wantai則需要75天以上的持續(xù)低溫處理才能通過春化作用而抽薹。用于轉基因和性狀觀察的擬南芥生態(tài)型為Columbia和C24。I. 2植株培養(yǎng)將大白菜早薹zaotai和晚苔wantai自交系的幼苗置于3_5C°C的低溫下春化30天，晚苔wantai自交系在同樣的低溫下處理75天，其間分別取葉片組織檢測BrpFLC2基因和反向轉錄本BrpFLas-I在春化過程中的表達。在低溫處理前、處理12天時、處理29天、處理50天和90天分別測定植株生長狀況和提取RNA樣品。1.3RNA 提取Trizol 提取 RNA 步驟I)液氮中將材料研磨充分。2)研磨好的材料轉到EP管中，加Iml Trizol。3)震蕩，室溫放置10分鐘。4)加入0. 2ml氯仿，震蕩，室溫放置10分鐘。5)4で，12000rpm，離心 10 分鐘。
6)取上清，加入I倍體積異丙醇，混勻，冰上放置15分鐘。7) 4°C, 12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。8)70%こ醇洗ー次，離心(4で，12000印111，5分鐘)，棄上清。超凈臺吹干。9)用30 ill DEPC處理過的水溶解，_70°C存放。冷酚法(適用于糖分含量多的材料，如花和果莢)提取RNA步驟I)在液氮中研磨材料至粉狀，轉入離心管中，冰上加抽提液500 ill。加入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 I)，冰浴I小時，每隔10分鐘振蕩一次。2) 14000rpm,4°C離心15分鐘,取上清,加等體積酹氯仿異戍醇，冰浴5分鐘。3)重復步驟2，直至有機相和水相無蛋白質為止。4)加入等體積的氯仿異戊醇(24 I), 14000rpm 4°C離心15分鐘。5)取上清，加0. 5倍體積的高鹽溶液和0. 5倍體積的異丙醇，混勻后_70°C I小吋。6) 14000rpm 4°C離心20分鐘,去上清,沉淀溶于150ul H2O中。7) 14000rpm 4°C離心10分鐘，取上清轉至一新管中。8)加入1/3體積的8M LiCl, _20°C過夜沉淀RNA。9) 14000rpm 4°C離心 15 分鐘。10)沉淀用70%こ醇洗兩次。11) 50 ii I H2O 溶解 RNA。試劑抽提液1MTris-HCl, 50mM EDTA，pH 8. 0高鹽溶液0. 8M檸檬酸鈉，I. 2M NaCleDNA合成步驟反轉錄體系(20 U I)5X AMV 緩沖液 4 U I2mM dNTPIOu I20 U M oligo dT18 In IRNA2u IRNase 抑制劑0. 5 ii IAMVI u IDEPC 水I. 5 ill25°C 10 分鐘，42°C反應 I 小時，94°C 5 分鐘。I. 4Northern 雜交7. 5%聚丙烯酰胺膠的配置7. 5%聚丙烯酰胺膠工作液(75ml)Urea31. 5g40%丙烯酰胺化合物14ml(38g/100ml丙烯酰胺，2g/100ml N，N，-亞甲基ニ丙烯酰胺)5 X TBE15mlH2O23.5ml配膠
工作液IOml10% AP 50u ITEMED :10 ill加樣緩沖液用尿素飽和，盡量保證RNA的上樣量在10 ii g以上。電泳1XTBE，80V，2 小時轉膜0. 5XTBE，28mA，過夜紫外交聯2分鐘，80°C烘膜2小時雜交液IOOml (2張膜)SDS7gNa2HPO4. 12H20 12. 24gNaH2PO4. 2H202. 46g0.5MEDTA200 u IBSAIgy -P32ATP末端標記探針H2O21 u IPNKI. 5 illIOXbuffer3 U IProbe2 U Iy -P32ATP3. 5 ill洗膜I X SSC和I % SDS洗膜3次，壓磷屏。探針序列bfas5 ggtagttcttctgtcttcacc(S EQ ID NO :1)probe a atggccacgtctctctctactgcaa(SEQ ID NO :2)probe b gatacaaagttaattggcgtaaacacac (SEQ ID NO :3)probe c cccatgacaatgcgcgctttagata(SEQ ID NO :4)I. 5染色質免疫共沉淀甲醛交聯將新鮮葉片放到50ml 1%的甲醛(1.35ml 37%甲醛，48. 65ml H2O)中，在真空泵中抽真空10分鐘，然后加入0. 375g甘氨酸(終濃度0. 1M)室溫5分鐘解交聯。樣品用蒸餾水洗3遍后,液氮凍存。提染色質將葉片在液氮中磨碎，加入3ml緩沖液(0. 4M sue, IOmM Tris-HClpH8. 0, IOmMMgCl2, 5mM B-巰基こ醇)，用4層紗布濾去細胞壁等雜質，滲出的液體轉到新的離心管中， 4C，12000rpm，離心 10 分鐘。去上清，沉淀用緩沖液(0. 25M sue, IOmM Tris-HCl pH8. 0，IOmM MgCl2,1 % TritonlOO, 5mM B-疏基こ醇)洗一遍,4C, 12000rpm,離心 10 分鐘。沉淀再在 buffer (I. 7M sue, IOmMTris-HCl pH8. 0,0. 15% Triton 100, 2mM MgCl2)中重懸，4C，16000g，離心I小時。
超聲波打碎染色體將沉淀融入200 微升核裂解 buffer (50mM Tris-HCl pH8. 0，IOmM EDTA, I % SDS)中，冰上放置10分鐘。然后超聲波破碎(15秒工作/60秒間隙，重復5次)。4C，12000rpm,離心30分鐘，取上清。免疫沉淀將上清轉到新的離心管中，加800微升的緩沖液(I. 1% TritonlOO, I. 2mMEDTA,16. 7mM Tris-HCl pH8. 0,167mM NaCl),再加入40微升protein-A agarosebeads, 4°C放置 I小吋。2300g，離心I分鐘。上清分成兩份，每份500微升，其中ー份加入5微升H3K27me3的抗體，另一份不加，4°C放置過夜。第二天,姆管加入30微升50% proteinA-agorose beads,4°C放置I小吋。清洗分別用低鹽緩沖液、高鹽緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液清洗珠。溶解DNA加入250 微升 chip elution buffer (I %w/v SDS,0. IM Na_HC03)，65°C，15 分鐘。重復一次，合井上清。解交聯500微升的上清中加入20微升5M NaCl，在65°C水浴鍋中放置6_8小吋。然后加入蛋白酶K，55°C處理2小時。DNA 純化DNA通過酚，氯仿抽提，和酒精沉淀來純化。純化好的DNA加入50微升水。引物的序列及在BrpFLC基因組DNA上的位置bfgd5 ggtaccccatagtatttgagatctaaccat(SEQ ID NO :5)BrpFLC~22a cttctgtctccgagaagcct(SEQ ID NO :6)BrpFLC-1993s ggacaggatcttcagtcaaa(SEQ ID NO :7)BrpFLC3 gagtcgacgcttacatcaga(SEQ ID NO :8)probes ttgcagtagagagagacgtggccat(SEQ ID NO :9)bfgd3 ggtaccgaatattaagaactcggcctactg(SEQ ID NO :10)PCR 程序94°C 3min94°C 30sec58°C 30sec72°C 30sec35 輪72C IOmin2結果與分析2. IBrpFLC 基因 3’ UTR 下游短片段 RNA2007年通過Northern blot在擬南芥FLC基因3’ -UTR下游雜到一個24ntsRNA。它的方向與FLC轉錄的方向相反，與之互補的探針的序列為agggacgtggctctctctctctctc (SEQ ID NO :11)。sRNA 在花和果莢中表達較高，sRNA 產生區(qū)域的染色體是H3K9me2甲基化的，但文中并沒有提及該sRNA與春化的關系。2009年底公布了擬南芥FLC兩個反向轉錄本的全長序列，把反向轉錄本的5’端貼到基因組DNA上，可看到sRNA產生的位置不在反向轉錄本上,而位于反向轉錄本的啟動子區(qū)域。進ー步驗證24ntsRNA是通過RNA聚合酶IVa，RNA-依賴性RNA聚合酶2，和DICER-LIKE3途徑產生的，但產生該sRNA的模板來源仍是個問題。2007年的文章中還提到在FLC3’區(qū)域存在ー個30nt的sRNA。它是通過用FLC基因3’-UTR下游區(qū)域300bp的DNA片段制作的隨機探針雜到的，文章報道了 30nt sRNA的產生機制與24nt的不同，30nt sRNA的具體產生機制仍不清楚。2010年在動物 Polycomb target gene 的 5’端發(fā)現存在 50_200nt 的短 RNA (promoter-associatedshort RNA),這些短RNA的ニ級結構可以結合SUZ12,從而招募polycomb complexes來修飾基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3K27me3甲基化。擬南芥3’端存在ー些小RNA，其中部分小RNA的來源機制并不清楚，它們的位置正好是反向轉錄本的啟動子區(qū)域，那么這些RNA是否屬于promoter-associated short RNA 一類，并介導了春化中FLC染色體上組蛋白H3K27me3的甲基化，如果該機制存在，它也適用于大白菜BrpFLC的3’端。
通過搜索大白菜BrpFLC3’區(qū)域的序列，我們找到與擬南芥24ntsRNA探針的同源序列atggccacgtctctctctactgcaa(SEQ ID NO :12),它對應于反義鏈，如果用它作探針雜到的RNA應該是正向的。我們以此序列制作探針,通過Northern blot在大白菜花,果莢，和春化中葉片中檢測到150nt左右的短RNA。為了證明該短RNA參與了春化過程中BrpFLC組蛋白H3K27me3的甲基化，我們通過染色質共沉淀檢測春化中BrpFLC組蛋白H3K27me3的甲基化情況，看甲基化程度是否與短RNA表達量吻合。2. 2Northern Blot 檢測 fcpFLC 3’ -UTR 下游短片段 RNA07年的研究報道擬南芥FLC基因3’ -UTR下游存在ー個非編碼小RNA片段，我們利用該小RNA片段互補的序列作為探針Probe a(圖I),做Northernblot在大白菜BrpFLC基因的3’端序列上雜到大小在150nt的RNA片段，序列分析發(fā)現，我們找到了與擬南芥FLC基因3’-UTR下游非編碼小RNA片段同源的大白菜中的小RNA同源片段，與擬南芥不同的是它位于反義鏈上，并且它對應于BrpFLC反向轉錄本的第一個外顯子。以此探針做Northernblot在比熱和大散葉的花中都能雜到150nt大小的短RNA，在比熱中有兩條帶，在大散葉中有一條帶。把該探針和U6探針放在一起作Northern blot,發(fā)現該短RNA的長度略大于U6,U6 是 102nt。為了進ー步確認該短RNA的精確序列，我們在探針probe a的左右兩側分別設計探針作Northern blot(探針的位置如圖2所示)。數字表示核苷酸相對于克隆的BrpFLC基因組DNA片段4093bp中所在的位置。結果表明，probe a 5’端的探針雜bfas5沒有信號，而3’端的探針probe b能夠雜到相同位置的條帶。說明probe a所對應的序列已經位于短RNA的5’端。進一步用探針probe b對應片段位置3’端的探針probe c做Northernblot，能夠雜到相同位置的條帶，但明顯信號非常弱，說明探針probe c部分對應于該小RNA片段3’端位置。這樣我們基本上把該小RNA片段序列范圍確定下來。在早薹zaotai中檢測短RNA的表達模式，用的材料包括6葉期沒有春化的成熟葉，春化12天和30天的葉，花和果莢。發(fā)現短RNA在花和果莢中表達較高，在未春化的葉中表達較低(圖3)。隨著春化的進行，表達量逐漸升高。
2. 3BrpFLC染色體上組蛋白H3K27me3甲基化為了解BrpFLC甲基化的情況，我們采用染色質免疫共沉淀的方法檢測春化中早薹zaotai的BrpFLC2染色體上組蛋白H3K27me3甲基化。在低溫處理前，BrpFLC2的基因中間的部分(圖4中引物P3和P4之間的序列)不存在H3K27me3甲基化。在春化13天的早薹zaotai成熟葉中，BrpFLC2的基因中間的部分(引物3和4之間的序列)存在H3K27me3甲基化，而在BrpFLC2的5’和3’區(qū)域未發(fā)現H3K27me3甲基化。這個結果說明，低溫誘導BrpFLC2的基因中間部分(圖4中引物P3和P4之間的序列)H3K27me3的甲基化低溫春化過程中，BrpFLC 3’ -UTR下游短片段RNA表達與BrpFLC2的基因中間部分H3K27me3的甲基化表現一致，根據已有文獻報道，動物中發(fā)現的promoter-associatedshort RNA可以結合SUZ12，從而招募PRC2，導致產生短RNA片段的基因的染色體上H3K27me3甲基化，進而對該基因表觀遺傳上調控表達(Yap，K. L.，S. Li，etal.(2010). " Molecular interplay of the noncoding RNAANRIL and methylated histoneH31ysine 27by polycomb CBX7in transcriptionalsilencing ofINK4a. " Mol Cell38(5) :662-74.)。隨著春化的進行，BrpFLC3’端的短RNA表達量升高，這提示了它參與春化過程中BrpFLC染色體上組蛋白H3K27me的甲基化，從而調節(jié)大白菜開花時間。2. 4BrpFLC 3’ -UTR下游短片段RNA同源序列對比我們將十字花科中大蒜芥屬的水蒜芥(Sisymbrium irio, Si)和蕓薹屬的甘藍(Brassica oleracea,Bo)中的同源序列與大白菜(Br)的序列進行對比，結果如圖6。如圖所示，同科不同屬之間的植物中，該短RNA片段序列保守性很強。3 結論BrpFLC基因3’ -UTR下游短片段RNA與VRN2有相互作用，調控大白菜開花時間。短RNA的序列延伸到BrpFLC反向轉錄本的5'末端外，所以可以排除短RNA是通過RNA-依賴性RNA聚合酶途徑產生的。由于它產生的位置在BrpFLC反向轉錄本的啟動子附近，所以我們推測它是類似動物中發(fā)現的promoter-associated short RNA。而且promoter-associated short RNA可以結合SUZ12,從而招募PRC2,導致產生短RNA基因的染色體上H3K27me3甲基化。隨著春化的進行，BrpFLC3’端的短RNA表達量升高，這提示了它參與春化過程中BrpFLC染色體上組蛋白H3K27me的甲基化，從而調節(jié)大白菜開花時間。
權利要求
1.一種分離的多核苷酸序列，選自(a)含SEQID NO 13所示序列的多核苷酸序列；(b)對(a)所述的序列進行一個或幾個堿基的取代、缺失、插入修飾所獲得的多核苷酸序列，該多核苷酸序列能夠調節(jié)十字花科植物春化作用；(C)與(a)或(b)所述多核苷酸序列互補的序列；和(d)在嚴格條件下與(a)、(b)或(C)所述序列雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求I所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQID NO 13所示。
3.—種多核苷酸構建物,其特征在于,所述多核苷酸構建物含有權利要求I或2所述的多核苷酸序列。
4.一種轉化體，其特征在于，所述轉化體轉化了權利要求3所述的多核苷酸構建物。
5.如權利要求4所述的轉化體，其特征在于，所述轉化體選自十字花科植物的細胞、組織和器官。
6.一種調控十字花科植物開花時間的方法，其特征在于，所述方法包括調控所述十字花科植物中SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的表達，從而調控該十字花科植物的開花時間。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括抑制所述十字花科植物中SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的表達，從而推遲該十字花科植物的開花時間；或所述方法包括提高所述十字花科植物中SEQ ID NO :13所示的序列或其同源序列的表達，從而促進該十字花科植物的開花時間。
8.一種制備轉基因十字花科植物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)構建能過表達SEQID NO :13所示的序列或其同源序列的多核苷酸構建物，或能敲除或突變SEQ ID NO 13所示的序列或其同源序列的多核苷酸構建物；(2)將步驟(I)所獲得的的多核苷酸構建物轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得SEQ ID NO 13所示的序列或其同源序列過表達、弱表達或不表達的植物細胞、組織、器官或種子;和(3)將步驟(2)獲得的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
9.如權利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述十字花科植物選自自大白菜、青菜、甘藍、油菜和蘿卜。
10.權利要求I或2所述的多核苷酸序列或權利要求3所述的多核苷酸構建物在調控大白菜FLC2基因或其同源基因的基因中間部分H3K27me3的甲基化中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及調控十字花科植物開花時間的物質和方法。具體而言，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO13所示序列的多核苷酸序列、含有該序列的多核苷酸構建物、轉化體，調控十字花科植物開花時間的方法，以及所述序列或構建物的用途。
文檔編號C12N15/113GK102618540SQ201110033488
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權日2011年1月31日
發(fā)明者何玉科, 孫傳寶, 張紹峰 申請人:中國科學院上海生命科學研究院