專利名稱:小麥TaTOC1基因及其克隆方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥TaTOCl基因及其克隆方法與應(yīng)用，屬于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)變，即成花轉(zhuǎn)變，是植物完成整個(gè)生活周期的關(guān)鍵步驟。植物開(kāi)花時(shí)間受內(nèi)在發(fā)育信號(hào)和外部的環(huán)境信號(hào)共同控制。近些年來(lái)的研究表明，主要有四條途徑控制開(kāi)花，分別為光周期促進(jìn)途徑、自主促進(jìn)途徑、春化促進(jìn)途徑和GA促進(jìn)途徑。光周期現(xiàn)象是生物鐘調(diào)控的諸多過(guò)程的一個(gè)特例，它是由生物鐘和光信號(hào)共同作用的結(jié)果。光周期的感應(yīng)器可以使植物準(zhǔn)確地感知日照長(zhǎng)度的變化，從而選擇性地在合適的季節(jié)開(kāi)花。過(guò)量表達(dá)LHY/CCA1和TOCl三個(gè)基因中的任一個(gè)都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的晝夜節(jié)律性的破壞(Schaffer et al., 1998 ；ffang and Tobin, 1998),這說(shuō)明它們是植物中心振蕩器的核心 元件。TOCl基因?qū)儆跀M南芥PRR基因家族，它編碼的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver domain)和 CCT(CO, COL, and T0C1)結(jié)構(gòu)域(Makino etal.，2000)，采用模式化和聚類分析的方法證明了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可能分別發(fā)揮響應(yīng)信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能(Kolmos et al.，2008)。TOCl基因的mRNA和蛋白水平呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性的積累，這種情況即使是在持續(xù)光照或持續(xù)黑暗的條件下依然表現(xiàn)的很明顯(Strayer etal.,2000 ；Mas et al.，2003b)。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，TOCl在持續(xù)光照條件下的晝夜節(jié)律性表達(dá)的現(xiàn)象在擬南芥的根里并沒(méi)有被檢測(cè)到，而在莖中卻有很明顯的節(jié)律性的TOClmRNA量的積累，這說(shuō)明TOCl在不同器官中的作用模式很可能不同，這也用分子的證據(jù)說(shuō)明植物不同器官的生物鐘是具有特異性的，但并不排除不同器官的生物鐘之間的相互聯(lián)系與調(diào)控(James et al.,2008)。
擬南芥TOCl的第562位丙氨酸突變成纈氨酸后產(chǎn)生了 tocl_l，它是一種弱的功能缺失型突變體，tocl-Ι的生物鐘的晝夜節(jié)律周期相對(duì)于野生型擬南芥變短(Somers etal.，1998 ；Strayer et al.，2000)。而擬南芥中增加TOCl的表達(dá)時(shí)，植株的生物鐘周期變長(zhǎng)；當(dāng)TOCl被過(guò)量表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物鐘則完全變得紊亂(Makino et al.，2002 ；Mas et al.，2003a)。這些都說(shuō)明TOCl在維持生物鐘正常節(jié)律方面的重要功能。因此，可以利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育周期。
長(zhǎng)日照植物小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。人們?cè)噲D通過(guò)對(duì)育種和栽培方式的探索來(lái)改善其產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的主要育種手段之一是引種，即把外地或外國(guó)優(yōu)良的作物品種引入當(dāng)?shù)?，作為推廣品種或是育種材料應(yīng)用。但是小麥要完成從種子到種子的一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期，必須通過(guò)春化階段和光照階段，否則就不能正常結(jié)實(shí)獲取產(chǎn)量。但是由于全球各地的光照、溫度等氣候條件差異很大，所以引種工作受到很大的限制。如果能夠利用生物技術(shù)手段調(diào)節(jié)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育周期，那么引種的范圍就能夠極大的擴(kuò)大。
小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，是人類食物和營(yíng)養(yǎng)的基本來(lái)源。依賴于基因工程的進(jìn)展可以解決目前我國(guó)小麥生產(chǎn)面臨的干旱、病蟲(chóng)害以及遺傳育種中優(yōu)良品種引種范圍窄等問(wèn)題。由于小麥的遺傳背景較其它作物復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化困難，因此是三個(gè)重要的禾本科作物中最后一個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因成功的。盡管從1992年以來(lái)利用基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG法、電擊法和激光微束法分別獲得了轉(zhuǎn)基因小麥，但其轉(zhuǎn)化率未超過(guò)6 %。由基因槍法等物理轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)基因小麥存在外緣基因的拷貝數(shù)多、再生困難和不育等缺陷。小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為限制小麥基因工程研究發(fā)展的重要因素。由于這種限制，至今已獲得的有經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因小麥極其有限。
在現(xiàn)有的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化一直是國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次報(bào)道了以小麥幼胚和胚性愈傷組織為外植體獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因(npt II)再生植株，并提出了一套較為成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。1999年我國(guó)的夏光敏也報(bào)道了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將npt II基因?qū)胄←溣着吆团咝杂鷤M織，得到轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因頻率達(dá)到3.7-5.9%，明顯高于其它小麥轉(zhuǎn)化研究。但這些轉(zhuǎn)化方法均需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)再生植株。已有的研究表明小麥不同基因型的受體材料對(duì)植株再生有顯著影響。目前已知小麥幼胚和胚性愈傷組織的再生能力較高，但受基因型的限制很大，而我國(guó)多數(shù)生產(chǎn)用小麥當(dāng)家品種，由愈傷組織分化再生非常困難，這限制了需經(jīng)組織培養(yǎng)途徑進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用。
2005年2月16日公開(kāi)的公開(kāi)號(hào)為1580257,名稱為“ 一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法及其應(yīng)用”的中國(guó)專利申請(qǐng)中，采用小麥生長(zhǎng)點(diǎn)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，從根本上克服了小麥基因型對(duì)轉(zhuǎn)化后形成可育再生植株的限制，獲得了表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小麥，生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化率達(dá)到60-70%，成苗率平均90%，從而克服了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸問(wèn)題-基因型的限制。
上述技術(shù)的探索是一種適合于我國(guó)小麥的遺傳轉(zhuǎn)化方法，克服了當(dāng)前小麥遺傳轉(zhuǎn)化中存在的瓶頸問(wèn)題。然而，至今為止，通過(guò)上述技術(shù)轉(zhuǎn)化到小麥中的基因多是報(bào)告基因，獲得的有經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因小麥卻是少之又少。鑒于以上所述，本發(fā)明利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從小麥中分離出三個(gè)同源基因TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D，進(jìn)一步構(gòu)建RNAi的表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥CB037，并獲得抽穗期提iu的轉(zhuǎn)基因小麥。
縮略語(yǔ)和關(guān)鍵 術(shù)語(yǔ)定義:
TOCl =Timing Of CAB I( 一個(gè)與 CAB I 的定時(shí)有關(guān)的基因)；
LHY:Late Elongated Hypocotyl( 一個(gè)能導(dǎo)致下胚軸晚延伸的基因)；
CCAl:Circadian Clock Associated I ( 一個(gè)與晝夜節(jié)律鐘相關(guān)的基因)；
PRR:Pseudo-Response Regulators ( 一類非典型的響應(yīng)調(diào)節(jié)因子)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供小麥TaTOCl基因及其克隆方法和應(yīng)用。采用如下技術(shù)方案:
小麥TaTOCl 基因，包括 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D，TaTOCl-A 核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl-B 核苷酸序列為 SEQ ID NO:2 ;TaT0Cl_D 核苷酸序列為 SEQ ID NO:3。
小麥TaTOCl基因的克隆方法，包括以下步驟:1)利用Trizol試劑盒提取總RNA ；2)第一條鏈的合成:取2yg總RNA，加入5X反應(yīng)緩沖液4 μ 1，IOmM脫氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/yl)0.5yU|*oligodT(lyg/yl)lyl，S轉(zhuǎn)錄酶(iou/μ 1)2μ 1，42°C反應(yīng)60分鐘，85°C放置10分鐘終止反應(yīng)，稀釋至200 μ I ；3)PCR反應(yīng)；4)基因克隆:取2μ I PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按pMD18-TVector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜；挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；5)堿法提取質(zhì)粒DNA ；6)序列測(cè)定；7)5'序列的分離。
所述的小麥TaTOCl基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的應(yīng)用。
根據(jù)上述技術(shù)，從小麥中分離到了 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三個(gè)基因過(guò)量表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥延遲一周左右開(kāi)花，它們沉默表達(dá)會(huì)引起轉(zhuǎn)基因小麥提前5天左右開(kāi)花。小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，將該基因轉(zhuǎn)入小麥?zhǔn)蛊浣档捅磉_(dá)能夠調(diào)節(jié)小麥的抽穗時(shí)間，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1:小麥中 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D 與擬南芥中 TOCl 和水稻中 OsTOCl 的
氨基酸同源性比較。
圖2:小麥中TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D與不同植物中PRR家族蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系。
圖3:利用中國(guó)春缺體-四體小麥將TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因定位在六號(hào)染色體。
圖4 =TaTOCl-A, TaTOCl-B, TaTOCl-D基因在小麥不同組織和器官中的表達(dá)分析。莖尖(SAM)，幼根(YR)，幼葉(YL)，節(jié)(N)，莖(In)，葉鞘(LS)，老根(MR)，老葉(ML)，幼穗(Spi)。
圖5:過(guò)表達(dá)TaTOCl轉(zhuǎn)基因擬南芥在短日照條件下延遲開(kāi)花。
圖6 =TaTOCl-RNAi轉(zhuǎn)基因小麥長(zhǎng)日照條件下提前抽穗。
圖7 =TaTOCl-RNAi轉(zhuǎn)基因小麥短日照條件下提前開(kāi)花。
圖5中WT代表野生型；0X-3，_9和-14分別代表過(guò)表達(dá)TaTOCl轉(zhuǎn)基因擬南芥單株3、9和14。其中，A為轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的開(kāi)花比較圖；B SPCR鑒定圖；C為開(kāi)花時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖。
圖6、圖7中WT代表野生型，TaTOCl-RNAi代表沉默TaTOCl的轉(zhuǎn)基因小麥。
圖6中，長(zhǎng)日照條件下，A代表轉(zhuǎn)基因小麥與野生型抽穗比較圖；B-E，為PCR鑒定圖；F為轉(zhuǎn)基因小麥和野生型小麥抽穗比較圖。
圖7中，短日照條件下，A代表轉(zhuǎn)基因小麥與野生型抽穗比較圖；B-E，為PCR鑒定圖；F為轉(zhuǎn)基因小麥和野生型小麥抽穗比較圖。
具體實(shí)施例
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1:小麥 TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 基因的克隆
1)利用Trizol試劑盒提取總RNA，具體方法如下:
(1)在1.5mL離心管中加入1mL的Trizol試劑。
(2)稱取約100mg中國(guó)春小麥葉片,液氮研磨,轉(zhuǎn)至上述離心管中。鏇潤(rùn)震蕩混勻，常溫靜置5min。
(3) 4°C, 12，OOOrpm離心lOmin。取上清至一新的1.5mL離心管中。
(4)分相
①加0.2mL的氯仿，劇烈搖晃15s，15_30°C靜置3min。
②4 ，12，OOOrpm 離心 15min。
(5)沉淀并去除多糖
①取無(wú)色水相(大約是原初Trizol體積的60% )至一新的Eppendorf管中。
②加0.25mL異丙醇、0.25mL高鹽溶液，顛倒混勻，15_30°C靜置lOmin。
③4°C, 12，OOOrpm 離心 IOmin,棄去上清。
(6)清洗
①用200μ L的槍吸除多余上清，加ImL冰預(yù)冷的75%乙醇，漩渦震蕩。4°C，12, OOOrpm 離心 5min。
②用真空泵吸除乙醇，37°C干燥lOmin。
(7)加適量的DEPC' ddH20( —般為20 μ L)，槍打數(shù)次，置于55_60°C溶解lOmin。迅速放于冰浴中靜置5min，稍離心。置于-70°C保存。
2)第一條鏈的合成:取2 μ g總RNA，加入5 X反應(yīng)緩沖液4 μ I，IOmM脫氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制劑(40-200ιι/μ 1)0.5μ 1，引物 oligodT(lyg/y 1)1μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶(lOu/μ 1)2μ 1，42°C反應(yīng)60分鐘，85°C放置10分鐘終止反應(yīng)，稀釋至200 μ I。
3) PCR反應(yīng):聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為:
首先將下列試劑混在一起:
2Χ反應(yīng)緩沖液(25μ I)+脫氧核苷酸混合物(dNTP) (4μ I)+正向引物(5 μ Μ，4 μ I)+反向引物(5μΜ,4μ I) +模板cDNA(4y I)+TaqDNA聚合酶(0.5 μ I),加水補(bǔ)至總體積 50 μ 10
PCR反應(yīng)條件為:94°C 3分鐘；然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C I分鐘，62°C I分鐘，72°C I分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
4)基因克隆:取2μ I PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按寶生物(大連)公司產(chǎn)品PMD18-T Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_ Π引哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨節(jié)青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。
5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
(I)取ImL菌液，12, OOOrpm離心Imin收集菌體,棄去上清。
(2)用ImL STE緩沖液懸浮菌體，離心回收菌體，去盡上清。
(3)加入100 μ L預(yù)冷的SolutionI懸浮菌體，強(qiáng)烈振蕩混勻。
(4)加入200 μ L新配制的Solution II，溫和顛倒5次后，冰浴中放置3min。
(5)加入150 μ L冷的Solution III,溫和顛倒IOs,冰浴中放置3_5min,期間顛倒混勻3次。
(6) 12，OOOrpm離心5min,取上清,加入等體積的苯酹/氯仿,振蕩混勻。
(7) 12，OOOrpm離心2min，取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻后室溫放置2min, 12, OOOrpm 離心 5min,棄去上清。[0062](8)沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫干燥片刻。
(9) 30-50 μ L ddH20溶解沉淀，電泳檢測(cè)并測(cè)定0D260，_20°C保存。
6)序列測(cè)定:本工作在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。
7) 5'序列的分離:按 Clontech 公司的 SMAR TRACE cDNA Amplification Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
實(shí)施例2:小麥TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D氨基酸序列分析
I) TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 與 TOCl、OsTOCl 的氨基酸序列比對(duì)；
(I) NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出TOCl (擬南芥，NP_200946)和OsTOCl (水稻，BAD38854)的氨基酸序列。
(2)運(yùn)用 Vector NTI Explorer 軟件，將 TaTOCl-A (SEQ ID NO: 4)、TaTOC 1-B (SEQID NO:5)和TaTOCl-D (SEQ ID NO:6)與TOCl、OsTOCl的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果見(jiàn)附圖1，小麥 TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 基因全長(zhǎng) cDNA 分別長(zhǎng) 2149bp (SEQ ID NO:1),2162bp(SEQ ID NO:2)和 2143bp (SEQ ID NO:3)，分別包含長(zhǎng)度為 1551bp、1551bp 和 1563bp的開(kāi)放閱讀框架，相應(yīng)的編碼516aa、516aa和520aa。
將TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D與T0Cl、0sT0Cl的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 與 TOCl (擬南芥，NP_200946)、OsTOCl (水稻，BAD38854)具有較高的同源性，尤其在N端的非典型的接收域(pseudoreceiver-domain)和C端的CCT (CO, COL, and TOCI)結(jié)構(gòu)域，屬于PRR家族，為小麥生物鐘調(diào)控基因中的關(guān)鍵基因。
2)不同物種中PRR家族的蛋白聚類分析
(I)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出擬南芥 TOCl (Arabidopsis thaliana, NP_200946)、PRR3 (BAB13744)、PRR5(BAB13743)、PRR7 (BAB13742)、PRR9 (BAB13741)，大麥Ppd-Hl(Hordeum vulgare AAY42111),水稻 OsTOCl (Oryza sativa, BAD38854)、0sPRR37 (BAD38855)、0sPRR73 (BAD38856)、0sPRR95 (BAD38857)，大豆 GmTOCl (Glycine max,ABW87010),栗 CsTOCl(Castanea sativa, AAU20772),冰花 McTOCl(Mesembryanthemumcrystal I inum, AAQ73525)，浮萍 LgPRR37 (Lemna gibba, BAE72700)、LgPRR59 (BAE72701)、LgPRR95 (BAE72702),稀脈萍 LpPRR37(Lemna paucicostata, BAE72697)、LpPRR59(BAE72698)、LpPRR95(BAE72699)。
(2)利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)不同物種中PRR家族的蛋白進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，小麥TaT0Cl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D蛋白與水稻OsTOCl蛋白的親緣關(guān)系最近(見(jiàn)附圖2)
實(shí)施例3: TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的組織特異性表達(dá)
I)取21°C等長(zhǎng)日照(12h光照/12h黑暗)生長(zhǎng)條件下15天苗齡小麥的莖尖、幼根及幼葉和90天苗齡小麥的節(jié)、莖、葉鞘、老根、老葉及幼穗于液氮中迅速固定。
2)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(方法同實(shí)施例1)。
3)設(shè)計(jì)特異性引物:
TaTOCl-AF CCCCCAAAACAGACCAATG (SEQ ID NO:7)
TaTOCl-AR CATAGGCGTCTCAAAAGCTTC (SEQ ID NO:8)
TaTOCl-BF CAATTCCCGAGGAAAGACAC (SEQ ID NO:9)
TaTOCl-BR AATGATCATCCGCACACCAT (SEQ ID NO:10)[0082]TaTOCl-DF GGTATCGAGCACACCAATTCT (SEQ ID NO: 11)
TaTOCl-DR GCAATGATCATCCTCACTCCC (SEQ ID NO:12)
4)以2)中cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)。
實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序是95°C IOs預(yù)變性，95°C IOs變性，68°C退火/延伸50s，78°C Is后采集熒光信號(hào)，循環(huán)40次。從65°C每隔0.5°C采集依次熒光信號(hào)直至95°C做溶解曲線分析。結(jié)果見(jiàn)附圖3，結(jié)果顯示TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因被定位在六號(hào)染色體上。
實(shí)施例4: TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的染色體定位
I)改良的CTAB法從中國(guó)春缺體-四體小麥葉片中提取基因組DNA
(I)取約0.3g葉片，置于研缽中液氮研磨，加入CTAB提取緩沖液750 μ L。
(2)研磨至勻漿狀，將其裝入1.5mL離心管中，充分混勻，于65°C水浴中保溫Ih (間隔晃動(dòng)5-6次)。
(3)向離心管中加入等體積的氯仿，輕輕顛倒離心管lOmin，放置片刻。
(4)于 16。。下 10，OOOrpm 離心 IOmin0
(5)取上清液加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇中，靜置至出現(xiàn)絮狀物DNA沉淀。
(6)挑出絮狀DNA用70 %乙醇洗1_2次后,干燥,然后用ddH20溶解后保存?zhèn)溆谩?br>2)設(shè)計(jì)特異性引物:同實(shí)施例3中3)。
3)以中國(guó)春缺體-四體小麥的基因組DNA為模板，利用上述設(shè)計(jì)的特異引物組合在高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR反應(yīng)條件下同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，68°C退火加延伸50s，38個(gè)循環(huán)結(jié)束后，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后取15uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
通過(guò)對(duì)小麥不同的組織器官進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因在所研究的各個(gè)組織和器官中均有不同程度的表達(dá)，其中在幼葉和老葉中的表達(dá)量較高(見(jiàn)附圖4)。
實(shí)施例5:表達(dá)載體的構(gòu)建
I)過(guò)量表達(dá)TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因轉(zhuǎn)化擬南芥用表達(dá)載體構(gòu)建
(I)根據(jù)分離出的TaTOCl基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物:
正向引物:5'-TCGCAGACCAGCCACCGC-3' (SEQ ID NO: 13)
反向引物:5'-TAATGCCATGTGTATCRCTGA-3' (SEQ ID NO: 14)
以中國(guó)春小麥葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
(2)取2 μ I PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按寶生物(大連)公司產(chǎn)品PMD18-T Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。
(3)利用 pMD18-T Vector 的 XbaI 位點(diǎn)與 TaTOCl-A、TaTOCl-B 以及 TaTOCl-D 全長(zhǎng)cDNA 3’端非編碼區(qū)的SpeI位點(diǎn)分別進(jìn)行雙酶切三種重組質(zhì)粒，同時(shí)XbaI和SpeI雙酶切pCAM-HA-SDIR載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞，然后在含卡納青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
(4)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。[0107]2)沉默TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因轉(zhuǎn)化小麥用載體的構(gòu)建
(1)根據(jù)TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的核苷酸序列，在它們的同源保守區(qū)段設(shè)計(jì)加有Kpnl、SpeI和BamH1、SacI酶切位點(diǎn)的引物:
TaTRN1-F:5’ -GGGGTACCACTAGTTGCAGTATCCTTTGGTA-3’ (SEQ ID NO:15)
TaTRN1-R:5，-CGGGATCCGAGCTCGCAACTTTCTTCCGATT-3’ (SEQ ID NO:16)
以葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成TaRNi片段。
(2)用SpeI和SacI同時(shí)雙酶切TaTRNi片段和pTCK303，生成重組質(zhì)粒TaTRN1-pTCK303o 用 KpnI 和 BamHI 同時(shí)雙酶切 TaTRNi 片段和重組質(zhì)粒 TaTRNi_pTCK303，生成TaT0Cl-RNA1-pTCK303。被用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小麥實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例6:基因功能分析
1)轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花表型分析
(1)種植擬南芥。
(2)挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。
(3)離心收集菌體，沉淀用滲透培養(yǎng)基(5%蔗糖，0.1M MgCl2,0.5% SilwetL-77)懸浮，菌液0D600在0.8左右。
(4)將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。
(5)收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(1XMS鹽，1%蔗糖，pH 5.7，0.8 %瓊脂，潮霉素30 μ g/ml)篩選，得到抗性植株。
(6)將T3代純合株系種子種于GM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)種野生型作對(duì)照，植株抽花序時(shí)統(tǒng)計(jì)蓮座葉的數(shù)目以測(cè)量開(kāi)花時(shí)間。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株在短日照條件下延遲開(kāi)花(見(jiàn)附圖5)。
2)轉(zhuǎn)基因小麥的抽穗時(shí)間分析
(1)從消毒的授粉后12天的小麥種子種挑出幼胚(大小為1-1.5mm)，盾片朝上接種在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+30g/l蔗糖+2.4mg/l植物凝膠+0.5mg/l PAA+2mg/IDicamba7PH = 6.0)上，25°C黑暗條件下培養(yǎng)4天，產(chǎn)生的小愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料。
(2)收集農(nóng)桿菌C58C1菌液(OD = 0.7)，用懸浮培養(yǎng)基(1/10MS基本培養(yǎng)基+40g/l麥芽糖+0.75mg/l MgCl2+0.75mg/l MES+10mlMS 維生素(IOOx)+0.5mg/l 谷氛酸胺+0.lmg/I水解酪蛋白+10mg/l葡萄糖+100mg/l維生素C+2.2mg/l Pocloram+39mg/l乙酰丁香酮+0.5mg/l PAA+2mg/1 Dicamba, PH = 5.4)重懸液重懸，轉(zhuǎn)化前加入 Silwet L-77。
(3)將50-80個(gè)外植體轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)皿中，室溫下侵染30分鐘。
(4)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至放置無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，25°C黑暗條件下共培養(yǎng)2天。
(5)將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+MS維生素+30g/l蔗糖 +2mg/l Dicamba, PH = 5.8)上，25°C條件下暗培養(yǎng) 2-3 周。
(6)經(jīng)過(guò)篩選，成活的愈傷組織被轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/12,4D+30g/l 鹿糖 +IOmlMS 維生素(IOOx)+0.lg/Ι 維生素 C+8mg/l Agar+250mg/l 羧卞青霉素+25mg/l G418, PH = 6.0)上，22_24°C光照培養(yǎng) 3-4 周。
(7)分化的小苗長(zhǎng)到2_3cm時(shí)即可轉(zhuǎn)到生根壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+250mg/l羧卞青霉素+25mg/l G418，PH = 5.8)上，22_24°C，光照培養(yǎng)3-4周成苗。[0129](8) 50mg/L卡那霉素對(duì)TO代種子進(jìn)行篩選，經(jīng)4小時(shí)浸泡后于平皿中25°C黑暗中萌發(fā)48小時(shí)，以篩選TO代種子。
(9)卡那霉素篩選后萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到以蛭石為基質(zhì)的花盆中，在25°C、60%相對(duì)濕度、16/8小時(shí)光周期培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
(10)出第三片葉時(shí)，取葉片提取gDNA，PCR鑒定Tl代陽(yáng)性植株。
(11)T2代種子種植于分別種于25°C /18°C、60 %相對(duì)濕度、16/8小時(shí)長(zhǎng)日照和25°C/18°C、60%相對(duì)濕度、10/14小時(shí)短日照條件光照培養(yǎng)箱中的光照培養(yǎng)箱，同時(shí)種野生型作對(duì)照，統(tǒng)計(jì)小麥穗抽出苞葉1/2時(shí)的日期以測(cè)量開(kāi)花時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)附圖6、附圖7，結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株在不同光照條件下均提前抽穗。
根據(jù)上述技術(shù)，從小麥中分離到了 TaTOCl-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三個(gè)基因過(guò)量表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥延遲一周左右開(kāi)花，它們沉默表達(dá)會(huì)引起轉(zhuǎn)基因小麥提前5天左右開(kāi)花。小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，將該基因轉(zhuǎn)入小麥?zhǔn)蛊浣档捅磉_(dá)能夠調(diào)節(jié)小麥的抽穗時(shí)間，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換 都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求
的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.小麥TaTOCl基因在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因小麥抽穗時(shí)間中的應(yīng)用，所述的小麥TaTOCl基因?yàn)門(mén)aT0Cl-A、TaT0Cl-B、TaT0Cl-D，TaTOCl-A 核苷酸序列為 SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl_B 核苷酸序列為 SEQ ID NO:2 ；TaTOC1-D 核苷酸序 列為 SEQ ID NO:3。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了小麥TaTOC1基因及其克隆方法和應(yīng)用，包括TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D，TaTOC1-A核苷酸序列為SEQ ID NO1；TaTOC1-B核苷酸序列為SEQID NO2；TaTOC1-D核苷酸序列為SEQ ID NO3，根據(jù)本發(fā)明，從小麥中分離到了TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D基因，三個(gè)基因過(guò)量表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥延遲一周左右開(kāi)花，它們沉默表達(dá)會(huì)引起轉(zhuǎn)基因小麥提前5天左右抽穗。小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，將該基因轉(zhuǎn)入小麥?zhǔn)蛊浣档捅磉_(dá)能夠調(diào)節(jié)小麥的抽穗時(shí)間，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/84GKCN102220347 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110093145
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年4月14日
發(fā)明者張憲省, 趙翔宇, 陳祥彬, 葉興國(guó), 潘衍有 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),