專利名稱：六聚體膽色素原合成酶作為開發(fā)抗生素和除草劑的靶的制作方法
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背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及四吡咯的生物合成，并且更具體涉及抑制膽色素原合成酶活化的機(jī)制。
2.相關(guān)技術(shù)描述四吡咯生物合成是動(dòng)物，植物和微生物包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌，原生生物和病毒的關(guān)鍵途徑。最常見的中間產(chǎn)物是5-氨基酮戊酸(ALA)。在所有生物體中從ALA到原卟啉IX的酶反應(yīng)對(duì)四吡咯的生物合成而言是常見的。
膽色素原合成酶(PBGS)，也稱作5-氨基酮戊酸脫水酶(ALAD)，是古老的和高度保守的蛋白，其催化四吡咯包括血紅素、葉綠素、維生素B12和輔因子F430(1，2)生物合成最常見的步驟。PBGS催化兩個(gè)5-氨基酮戊酸分子縮合形成四吡咯前體膽色素原。
PBGS以前被理解為是同型八聚體金屬酶，其在催化位點(diǎn)和變構(gòu)位點(diǎn)使用多種二價(jià)或一價(jià)陽(yáng)離子。哺乳動(dòng)物和酵母通常需要Zn(II)，一些原核生物的酶需要Mg(II)或Zn(II)或兩者以達(dá)到最大活性，而植物的酶似乎只需要Mg(II)以實(shí)現(xiàn)酶活性。少量的生物體具有既不需要Zn(II)也不需要Mg(II)的PBGS。使用金屬離子的差異是由至少兩個(gè)金屬結(jié)合區(qū)域的初級(jí)結(jié)構(gòu)中殘基的變化所引起的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些來(lái)源的PBGS的比活性依賴于蛋白濃度。例如已經(jīng)在日本慢生根瘤菌(B.japonicum)，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，和豌豆PBGS中可見對(duì)比活性的蛋白濃度依賴性，但是還沒(méi)有關(guān)于來(lái)自大腸桿菌(E.coli)，酵母，或哺乳動(dòng)物來(lái)源(22)的PBGS的文獻(xiàn)證明。
已知通過(guò)從活性位點(diǎn)除去金屬，例如將PBGS用乙二胺四乙酸(EDTA)處理可以抑制PBGS。
關(guān)于PBGS的更多信息公開于參考文獻(xiàn)(3-5)和(7)。
目前，更多的消費(fèi)者要求個(gè)人健康護(hù)理產(chǎn)品比如濕巾，尿布等不僅能提供他們想要的功能，還能夠治療或預(yù)防由于接觸例如細(xì)菌域，古細(xì)菌域，和/或真核生物域(eucarya)而導(dǎo)致的疾病或損傷，同時(shí)不損害消費(fèi)者的健康。為滿足這樣的需求，已經(jīng)在廣泛范圍的消費(fèi)產(chǎn)品例如濕巾中摻入抗微生物劑，以抵抗皮膚上暫留或駐留的細(xì)菌。含抗微生物劑的產(chǎn)品目前以很多形式在市場(chǎng)出現(xiàn)，例如洗劑，祛味肥皂，硬表面清潔劑，濕巾，和外科消毒劑。
然而許多含有抗微生物劑的產(chǎn)品由于用于提供抗微生物效果的化學(xué)品的性質(zhì)而對(duì)皮膚產(chǎn)生傷害或刺激。例如，一些硬表面清潔劑和外科消毒劑使用高水平醇和/或表面活性劑，其已經(jīng)被重復(fù)顯示使皮膚組織干燥并產(chǎn)生刺激。其他目前可用的濕巾使用苛刻的陽(yáng)離子表面活性劑而不添加酸。盡管表面活性劑能夠深入并殺死多種類型的細(xì)菌，其對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激和傷害。
許多含有抗微生物劑的產(chǎn)品使用有機(jī)酸，與陰離子或陽(yáng)離子表面活性劑組合作為抗微生物劑。盡管一些有機(jī)酸可以無(wú)需表面活性劑而安全地用于產(chǎn)品以控制微生物，大多數(shù)只摻入有機(jī)酸的產(chǎn)品抗細(xì)菌效果不佳，除非使用很高的濃度。在很高濃度下，這些酸使得最后的產(chǎn)品不經(jīng)濟(jì)并且甚至引起皮膚刺激的問(wèn)題。
此外，生物膜也是某些表面存在的問(wèn)題。生物膜可以在基本上任何存在充分濕氣的環(huán)境表面上發(fā)現(xiàn)。它們?cè)谧銐驙I(yíng)養(yǎng)物可得的流動(dòng)系統(tǒng)中的發(fā)展最快速。生物膜由吸附到環(huán)境表面的微生物種群或群落構(gòu)成，其是細(xì)胞和多糖復(fù)雜的聚集體。這些微生物通常被包圍在它們合成的細(xì)胞外多糖中。該生物膜，例如可以從銅綠假單胞菌，熒光假單胞菌(P.fluorescens)和肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumonia)的混合培養(yǎng)物形成。生物膜可以在與濕氣接觸的固體基層(substrate)上形成，在活生物體的軟組織表面形成和在液體空氣界面形成。產(chǎn)生生物膜通常的位置包括海洋或淡水環(huán)境的巖石和其他基質(zhì)表面。生物膜還通常與活生物體有關(guān)，包括植物和動(dòng)物。組織表面例如持久浸浴在豐富含水介質(zhì)的牙齒和小腸粘膜快速發(fā)展包膜在它們自己產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖中的微生物的復(fù)雜聚集體?？谇患?xì)菌在其細(xì)胞內(nèi)部?jī)?chǔ)存親碘性多糖或糖原樣分子的能力與牙齒齲洞有關(guān)，因?yàn)檫@些儲(chǔ)存化合物能使可能形成乳酸的時(shí)間延長(zhǎng)。正是暴露于乳酸的時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致了牙釉質(zhì)脫鈣。
人們利用微生物生物膜，主要在生境補(bǔ)救區(qū)中。水處理工廠，廢水處理工廠和與個(gè)人家庭相關(guān)的腐敗系統(tǒng)通過(guò)與生物膜相互作用除去病原體并降低水或廢水中有機(jī)物質(zhì)的含量。在另一方面，生物膜可以是對(duì)健康的嚴(yán)重危害，尤其是在引入人工基層的病人中。此外，生物膜是對(duì)輪船底部的威脅，因?yàn)樘賶啬茉谄浔砻嫔L(zhǎng)并腐蝕該表面或管道例如油泵或除濕器的內(nèi)壁。
盡管有如上所述的發(fā)展，對(duì)于提供具有普遍應(yīng)用的抗微生物組合物仍然有著需求。還需要提供能夠干擾多聚體蛋白質(zhì)單元平衡的試劑，例如，能夠抑制植物和/或細(xì)菌中四吡咯生物合成的抑制劑。還需要通過(guò)不適用于人或動(dòng)物的機(jī)制來(lái)完成抑制，從而產(chǎn)生一種新的、高度特異的抑制細(xì)菌、抗生或除草劑活性的方法。
此處引用的所有參考文獻(xiàn)以其全文引作參考。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明提供一種包含試劑的組合物，該試劑通過(guò)結(jié)合到多聚體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)并從而影響單元的平衡而影響多聚體蛋白，其中所述多聚體蛋白包括具有多個(gè)所述單元的集合，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面并且一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是至少一種下列不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型，條件是所述多聚體蛋白中(1)各所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能。在某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。
在某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響多聚體蛋白的功能。所述多聚體蛋白功能非限制性的例子是活性，而其中影響是指抑制或激活中的至少一種。
在某些實(shí)施方案中，該試劑結(jié)合到具有更低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型或具有更高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種。
在某些實(shí)施方案中，各所述單元選自單體、二聚體、三聚體、四聚體、六聚體和八聚體。
在某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白選自膽色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸還原酶。
在某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白是包含八個(gè)膽色素原合成酶單體的膽色素原合成酶。在另外的實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶的活性形式具有少于八個(gè)單體。
在某些實(shí)施方案中，該試劑是結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的抑制劑，并且其中四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型含有少于八個(gè)膽色素原合成酶單體。在某些實(shí)施方案中，抑制劑是迷迭香酸(rosmarinic acid)或其衍生物。
在某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白是Ia型核糖核苷酸還原酶，該試劑通過(guò)選擇性結(jié)合到對(duì)具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)而抑制Ia型核糖核苷酸還原酶。
還提供一種組合物，其含有抑制劑，該抑制劑通過(guò)結(jié)合到具有第二數(shù)量單體的多聚體膽色素原合成酶的較低活性形式而抑制具有第一數(shù)量單體的多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成，其中第一數(shù)量單體多于第二數(shù)量單體。
在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶衍生自細(xì)菌域，古細(xì)菌域或真核生物域，假設(shè)八聚體膽色素原合成酶包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。在該實(shí)施方案的一個(gè)變體中，多聚體膽色素原合成酶包含催化的鋅結(jié)合位點(diǎn)。
在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶不包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和催化的鋅結(jié)合位點(diǎn)。
在某些實(shí)施方案中，所述較低活性形式是六聚體。在某些實(shí)施方案中，其中所述較低活性形式是二聚體。在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶的活性形式是八聚體。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑取代金屬離子從而結(jié)合在金屬離子結(jié)合位點(diǎn)處。在某些實(shí)施方案中，金屬離子是鋅和/或鎂。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑結(jié)合在活性位點(diǎn)。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑不是金屬陽(yáng)離子。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑抑制多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成，所述活性形式是通過(guò)結(jié)合到含有少于八個(gè)單體的較低活性形式多聚體膽色素原合成酶的不能實(shí)施擁抱(hug-disabling)的結(jié)構(gòu)域的八聚體膽色素原合成酶。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑通過(guò)結(jié)合在活性位點(diǎn)和/或金屬離子結(jié)合位點(diǎn)以外的位點(diǎn)處而抑制多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成。
在某些實(shí)施方案中，抑制劑通過(guò)去除金屬離子之外的機(jī)制抑制多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成。
在某些實(shí)施方案中，該組合物還包括遞送介質(zhì)，所述遞送介質(zhì)選自藥物可接受的介質(zhì)，口服可接受的載體，抗細(xì)菌介質(zhì)和有效除草介質(zhì)。
有利的是，該組合物有效抑制或防止多聚體膽色素原合成酶的活性形式的形成，并從而抑制或防止細(xì)菌，古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假設(shè)多聚體膽色素原合成酶的活性形式含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。在本實(shí)施方案的一個(gè)變體中，組合物有效治療或預(yù)防由于接觸細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物引起的疾病。在本實(shí)施方案的一個(gè)變體中，組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑中的至少一種。
在某些實(shí)施方案中，該組合物有效抑制或預(yù)防多聚體膽色素原合成酶的活性形式的形成并從而抑制或預(yù)防細(xì)菌，古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假設(shè)多聚體膽色素原合成酶的活性形式不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和催化的鋅。在本實(shí)施方案的一個(gè)變體中，該組合物有效治療或預(yù)防由接觸細(xì)菌，古細(xì)菌和/或真核生物引起的疾病。在本實(shí)施方案的一個(gè)變體中，該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑中的至少一種。
還提供抗除草劑的植物，其對(duì)主要以擁抱二聚體的多聚體形式存在的多聚體膽色素原合成酶是轉(zhuǎn)基因的。在某些實(shí)施方案中，該多聚體膽色素原合成酶來(lái)自人。在某些實(shí)施方案中，該多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
還提供一種組合物，其包含結(jié)合到不需要鋅實(shí)現(xiàn)催化功能的多聚體膽色素原合成酶的抑制劑。
還提供影響多聚體蛋白的方法，該方法包括提供包括具有多個(gè)單元集合的多聚體蛋白，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及其中一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是(1)各所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能；提供包括試劑的本發(fā)明的組合物，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到該集合上的結(jié)合位點(diǎn)而影響平衡；并將該集合與試劑接觸，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到結(jié)合位點(diǎn)并由此影響所述多聚體蛋白而影響平衡。在該方法的某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。在該方法的某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響所述多聚體蛋白的功能。
在該方法的某些實(shí)施方案中，單元是選自單體、二聚體、三聚體、四聚體、六聚體和八聚體。
在該方法的某些實(shí)施方案中，試劑影響所述多聚體蛋白的功能。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白的功能是活性并且其中影響是抑制或活化中的至少一種。
在該方法的某些實(shí)施方案中，試劑被結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型或具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種。
在該方法的某些實(shí)施方案中，試劑結(jié)合到具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白選自膽色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸還原酶。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白是包含八個(gè)膽色素原合成酶單體的膽色素原合成酶。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述多聚體蛋白是Ia型核糖核苷酸還原酶，而試劑通過(guò)選擇性結(jié)合到對(duì)具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)而抑制Ia型核糖核苷酸還原酶。
還提供調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織或生物體生理活性的方法，該方法包括提供細(xì)胞、組織和生物體，其中細(xì)胞、組織或生物體包括的多聚體蛋白含有具有多個(gè)單元的集合，其中各單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是(1)各所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能；并向細(xì)胞、組織或生物體提供本發(fā)明的組合物，該組合物包括試劑，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到單元上的結(jié)合位點(diǎn)并由此影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成和調(diào)整生理活性而影響平衡。
還提供抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式的方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物施用于多聚體膽色素原合成酶；將組合物與較低活性形式相連；抑制較低活性形式組裝形成活性形式并從而抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式。
還提供操縱植物生長(zhǎng)或發(fā)育的方法，包括將作為除草劑的本發(fā)明組合物施用到植物，其中該植物是除草劑抗性的，并對(duì)基本以擁抱二聚體的多聚體形式存在的多聚體膽色素原合成酶是轉(zhuǎn)基因的。在本方法的一個(gè)變體中，多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
還提供制備抗細(xì)菌表面的方法，該方法包括(1)提供本發(fā)明的組合物，其中該組合物有效抑制或防止多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成并從而抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌、和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假設(shè)多聚體膽色素原合成酶的活性形式包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)以及該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑中的至少一種；(2)提供形成表面基質(zhì)(matrix)；和(3)將組合物與表面形成基質(zhì)結(jié)合，并從而制備抗細(xì)菌表面。在本方法的一個(gè)變體中，抗細(xì)菌表面防止和抑制生物膜的形成。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明結(jié)合下面的附圖給予描述，其中對(duì)同樣元件給予同樣標(biāo)號(hào)，其中

圖1A顯示野生型人PBGS相對(duì)于F12L變體的pH變化圖。
圖1B顯示在mono-Q柱上色譜分離野生型人(Wt)PBGS和F12L。
圖1C顯示野生型(Wt)人PBGS和F12L在12.5％聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳的泳動(dòng)性差異。
圖2A顯示野生型人PBGS的二聚體、四聚體和八聚體的示意圖。
圖2B顯示人PBGS變體F12L的二聚體、四聚體和六聚體的示意圖。
圖3A顯示PBGS蛋白的兩個(gè)峰在Q-Sepharose(KCl梯度(---)，A280(-))上的色譜分離。
圖3B顯示W(wǎng)t和F12L的兩個(gè)池相對(duì)于野生型(Wt)人PBGS和F12L在非變性凝膠電泳中的泳動(dòng)性差異。
圖3C顯示在Sephacryl S300上進(jìn)一步純化后Wt和F12L的池I(●)和池II(■)的pH變化圖。
圖3D顯示ALA的活性對(duì)濃度的圖表，用于確定S300純化的池I(圓圈)和池II(方塊)在pH 7(黑色)和pH 9(灰色)的Km和Vmax值。
圖4A顯示大腸桿菌(E.coli)PBGS晶體結(jié)構(gòu)的示意圖，包括變構(gòu)的鎂的位置。
圖4B顯示人PBGS八聚體(左)相對(duì)于六聚體(右)的亞基界面的示意圖。
圖5A顯示二聚體、六聚體和八聚體PBGS間存在的平衡的示意圖。
圖5B顯示在存在鎂的情況下分離的豌豆PBGS，在分析條件和EDTA濃度增加的情況下非變性凝膠電泳。
圖6顯示根據(jù)存在變構(gòu)的鎂(Mg)(方格區(qū)域)，沒(méi)有變構(gòu)的鎂(白色區(qū)域)，存在活性位點(diǎn)鋅(深灰色區(qū)域)，和不存在活性位點(diǎn)鋅(白色區(qū)域)的獨(dú)立隔離標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PBGS的分類。得到的矩陣(最右)由四個(gè)象限組成，其中西北象限(NW象限)代表+Zn/-Mg，東北象限(NE象限)代表-Zn/-Mg，西南象限(SW象限)代表+Zn/+Mg，以及東南象限(SE象限)代表-Zn/+Mg。
圖7A顯示真核生物和古細(xì)菌PBGS序列活性位點(diǎn)金屬結(jié)合殘基的比對(duì)，序列于2002年4月在GenBank和其他可網(wǎng)絡(luò)檢索的基因組獲得。
圖7B顯示真細(xì)菌PBGS序列活性位點(diǎn)金屬結(jié)合殘基的比對(duì)，序列于2002年4月在GenBank和其他可網(wǎng)絡(luò)檢索的基因組獲得。
圖8是包括細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物的PBGS來(lái)源的分類，其中PBGS的金屬結(jié)合性質(zhì)的分配根據(jù)圖6編碼。
圖9A顯示E.coli PBGS的一個(gè)二聚體的立體圖，其中蛋白亞基顯示為帶狀圖。活性位點(diǎn)鋅離子顯示為淺灰色球(sphere)，而變構(gòu)的鎂離子顯示為黑色球。
圖9A顯示E.coli PBGS的一個(gè)二聚體的立體圖，其中蛋白亞基顯示為帶狀圖并以黑色和淺灰色著色?；钚晕稽c(diǎn)鋅離子顯示為灰色球(sphere)，而變構(gòu)的鎂離子顯示為黑色球?；钚晕稽c(diǎn)配體未顯示。
圖9B顯示活性位點(diǎn)鋅的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的立體圖。半胱氨酸配體被標(biāo)記而半胱氨酸的硫原子被顯示為白色球。水被標(biāo)記?；钚晕稽c(diǎn)配體4，7-DOSA被顯示為灰色，而氧原子為球形。
圖9C顯示變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的立體圖。白球表示在鄰近殘基的鎂和氧和氮原子之間形成延伸的連接網(wǎng)絡(luò)的水分子。包含在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的氨基酸顯示為棒形，碳的顏色根據(jù)圖9A的鏈為淺或深色。包含在連接網(wǎng)絡(luò)中的氧或氮原子以對(duì)比的陰影顯示。標(biāo)記的氨基酸E231是鎂的第一配位層中唯一的氨基酸。R11來(lái)自擁抱二聚體相鄰亞基的N末端臂。
圖10顯示本發(fā)明抑制過(guò)程的實(shí)施方案的示意圖，其中本發(fā)明的抑制劑(由圓圈表示)結(jié)合到二聚體或六聚體PBGS的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域以抑制形成八聚體，穩(wěn)定結(jié)合的形式并移動(dòng)平衡。
圖11是蛋白的兩個(gè)同工型之間平衡的兩維示意圖，其顯示能夠影響蛋白功能的試劑在單元的一種形式上具有結(jié)合位點(diǎn)而在另一種形式上不具有。在這兩種情況下，多聚化的規(guī)則是將一條粗線與一條虛線并置。
圖12是蛋白的兩個(gè)同工型之間平衡的兩維示意圖，其顯示平衡必需能經(jīng)歷不同單元的互換。
圖13是多種四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型和單元與寡聚體之間的平衡的兩維示意圖。其顯示蛋白亞基的四種不同構(gòu)型(多聚體蛋白)。多聚體蛋白可以是二聚體(此處顯示為橢圓形)，三聚體(顯示為球形)，和四聚體(顯示為方形)。單元的形狀控制多聚體蛋白的形狀，例如，有可以形成二聚體、三聚體和四聚體的單元；此外，也有不能寡聚化的單元。該圖顯示單元必須經(jīng)歷特定的構(gòu)型轉(zhuǎn)換以形成某種形狀的寡聚體(同工型)。在各種情況下，單體的結(jié)構(gòu)規(guī)定了寡聚體的狀態(tài)，而寡聚體的狀態(tài)規(guī)定了功能特征。在各種情況下，必須利用單元的兩種不同構(gòu)型以在多聚體之間平衡。
圖14是單元和包含變構(gòu)調(diào)節(jié)因子(試劑)的寡聚體之間平衡的兩維示意圖。變構(gòu)調(diào)節(jié)因子顯示為結(jié)合到單元或多聚體蛋白的填充的灰色體。變構(gòu)調(diào)節(jié)因子能干擾寡聚體狀態(tài)之間的平衡。
圖15顯示當(dāng)S756393擬合到六聚體銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)PBGS模型中的結(jié)構(gòu)(空間填充)。
圖16A在不同的分析時(shí)間測(cè)量的A555值(未填充的圓圈形成不使用抑制劑的曲線(Kd＝3.5μg/ml)而填充的圓圈形成使用迷迭香酸的曲線(Kd＝13.5μg/ml)。
圖16B是顯示比活性對(duì)抑制劑濃度的圖(未填充的圓圈形成未使用迷迭香酸的曲線而填充的圓圈形成使用62.5mM迷迭香酸的曲線)。
圖16C顯示抑制與穩(wěn)定豌豆PBGS的較小寡聚體形式有關(guān)(10mg/ml豌豆PBGS，與迷迭香酸預(yù)孵育30min。IC50＝62.5mM)。
發(fā)明詳述本發(fā)明來(lái)自發(fā)明人對(duì)四吡咯生物合成基礎(chǔ)科學(xué)的研究。本發(fā)明提供考慮不同的寡聚化狀態(tài)，例如那些與信號(hào)和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的寡聚化狀態(tài)是如何能夠上調(diào)或下調(diào)途徑的新方法。根據(jù)本發(fā)明，任何變構(gòu)調(diào)節(jié)可以通過(guò)morpheins之間的平衡來(lái)定義的蛋白，其活性可以被結(jié)合到一個(gè)或另一個(gè)morpheins的獨(dú)特表面特征并移動(dòng)四級(jí)結(jié)構(gòu)形式的平衡的試劑(如小分子)調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，四吡咯生物合成可以通過(guò)調(diào)節(jié)PBGS的morpheins之間的平衡而調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抑制劑分子可以被發(fā)現(xiàn)其優(yōu)選與PBGS六聚體的獨(dú)特表面組分相互作用，并取代morpheins向六聚體形式的分配(其在植物和一些細(xì)菌PBGS中被認(rèn)為是非活性形式)。
有利的是，本發(fā)明提供一種組合物，其包括通過(guò)結(jié)合到多聚體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)并從而影響單元的平衡而影響多聚體蛋白的試劑，其中所述多聚體蛋白包括具有多個(gè)所述單元的集合，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及其中一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是在所述多聚體蛋白中(1)各所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能。本發(fā)明的組合物可以用于抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌、和/或真核生物在人或動(dòng)物宿主中的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)。例如，本發(fā)明的組合物可以用于藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑形式。本發(fā)明提供選擇靶生物體并影響該生物體以獲得所需效果的指南。
多聚體蛋白的單元可以是，例如單體、二聚體、三聚體、四聚體、六聚體和八聚體。在某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。在某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響所述多聚體蛋白的功能。所述多聚體蛋白功能非限制性的例子是活性并且其中影響是抑制或活化中的至少一種。如下文所述，根據(jù)本申請(qǐng)，試劑可以結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型或具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，從而抑制或活化多聚體蛋白。
示例性的多聚體蛋白是膽色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸還原酶。因此，在某些實(shí)施方案中，該試劑是結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的抑制劑，以及其中四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型含有少于八個(gè)膽色素原合成酶單體。相似地，當(dāng)多聚體蛋白是Ia型核糖核苷酸還原酶，該試劑通過(guò)選擇性結(jié)合到對(duì)較低活性四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)而抑制Ia型核糖核苷酸還原酶。
本發(fā)明現(xiàn)在將描述使用PBGS作為多聚體蛋白的例子。因此，本發(fā)明提供一種組合物，其包括抑制劑，該抑制劑通過(guò)結(jié)合到具有第二數(shù)量單體的較低活性形式的多聚體膽色素原合成酶而抑制具有第一數(shù)量單體的多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成，其中單體的第一數(shù)量多于第二數(shù)量。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PBGS能夠以至少兩種替換的四級(jí)結(jié)構(gòu)，八聚體和六聚體存在。具有較少數(shù)量PBGS單體的多聚體PBGS也包括在本發(fā)明中。之前，只知道存在八聚體形式。在兩種形式中，單體包含包括C末端300個(gè)氨基酸的α8β8桶，其中α8β8桶的中央包含活性位點(diǎn)。該亞基的可變長(zhǎng)度N末端部分形成延伸的臂結(jié)構(gòu)，其與兩種寡聚體形式即八聚體和六聚體中廣泛的亞基間相互作用有關(guān)。這兩個(gè)四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要差別是N末端臂的構(gòu)型。
在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶來(lái)自細(xì)菌、古細(xì)菌或真核生物，假設(shè)八聚體膽色素原合成酶包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。在本實(shí)施方案的一個(gè)變體中，多聚體膽色素原合成酶包含催化的鋅結(jié)合位點(diǎn)。
下面的概念和定義用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述。
MORPHEINS概念現(xiàn)代生物化學(xué)的一個(gè)教條是蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列直接決定的。結(jié)果，我們被教導(dǎo)一個(gè)蛋白的序列決定了其天然結(jié)構(gòu)。朊病毒的發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了一個(gè)結(jié)構(gòu)的概念，但是如果有人認(rèn)為那是“錯(cuò)誤折疊”的話，則他會(huì)堅(jiān)持上述的教條。本發(fā)明得出了新的發(fā)現(xiàn)，即morpheins，其是交替的蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)，單體單元的構(gòu)型改變的生理學(xué)相關(guān)的結(jié)果。就morpheins而言，交替的天然狀態(tài)彼此能量接近，但是各狀態(tài)規(guī)定不同的有限四級(jí)結(jié)構(gòu)多樣性，如圖11-14示意性所示。morpheins的第一個(gè)例子是膽色素原合成酶(PBGS)系統(tǒng)，其中四級(jí)結(jié)構(gòu)平衡形成變構(gòu)現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
在圖11-14中，基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單元是單體，任何兩個(gè)單元的結(jié)合受到鄰近粗線放置虛線的驅(qū)動(dòng)。這是集合的規(guī)則。圖13兩維地顯示集合的多樣性受基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單元(顯示為單體)形狀和集合規(guī)則的指導(dǎo)的概念。在圖13中基礎(chǔ)單元有四種不同形狀。左下角的單體pac-man-like形狀不能與其自身以相鄰粗線放置虛線的方式結(jié)合在一起，該單體不能寡聚化。半橢圓單體形狀能夠與其自身結(jié)合到一起形成二聚體。一旦形成二聚體，所有的虛線與所有的粗線相鄰，寡聚化以二聚體結(jié)束。餡餅楔形物形狀可以以相同的方式與其自身結(jié)合，但一個(gè)形狀需要三個(gè)單元以使得所有的虛線與所有的粗線相鄰。這個(gè)餡餅楔形物單體的命運(yùn)是寡聚化為三聚體。最后，根據(jù)相同的邏輯，方形單體形式的命運(yùn)是形成四聚體集合。采用morphein概念，各單體具有不同的生理相關(guān)的功能特征，例如不同的Km和Vmax值。例如，一個(gè)多聚體可以是變構(gòu)的“打開狀態(tài)”具有高酶活性而另外的多聚體可以是變構(gòu)的“關(guān)閉狀態(tài)”具有低活性。或者，不同的寡聚體的功能可以是寡聚體分子表面差異的結(jié)果。例如，圖11-14中三聚體的圓形表面將與和二聚體的橢圓表面和四聚體的尖表面不同的受體和結(jié)合伴侶相互作用。這些分子表面差異規(guī)定復(fù)合物的細(xì)胞定位。
變構(gòu)是總的概念，其中酶的活性受變構(gòu)調(diào)節(jié)分子結(jié)合到蛋白上非催化位點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)的影響。大多數(shù)變構(gòu)調(diào)節(jié)的模型建議活性的和非活性的狀態(tài)是相同多樣性的寡聚體，以及這兩種形式處于彼此的平衡，并且變構(gòu)調(diào)節(jié)分子的結(jié)合可以移動(dòng)該平衡?？偟膩?lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)信息(例如三維X射線晶體結(jié)構(gòu))不足以了解變構(gòu)調(diào)節(jié)因子結(jié)合的位置，兩種形式彼此如何產(chǎn)生差異，為什么一種形式比其他形式活性更高。我們最近發(fā)現(xiàn)膽色素原合成酶(PBGS)的兩種不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其中可以檢查這些形式并推斷一些生物體通過(guò)鎂變構(gòu)調(diào)節(jié)PBGS的合理解釋。該發(fā)現(xiàn)是morpheins的第一個(gè)具體例子并詳細(xì)描述于本申請(qǐng)中。然而，對(duì)PBGS交替的四級(jí)結(jié)構(gòu)的觀察導(dǎo)致對(duì)morpheins概念作為蛋白功能的調(diào)節(jié)機(jī)制的總描述和對(duì)能夠捕獲一種或另一種morpheins形式以指導(dǎo)蛋白功能的試劑的描述。圖11示例了使用例如圖13所示的四聚體和三聚體的這種概念，但添加了裂片以說(shuō)明變構(gòu)調(diào)節(jié)因子只能結(jié)合到四聚體。裂片的結(jié)合干擾四級(jí)結(jié)構(gòu)的平衡并使系統(tǒng)朝向四聚體形式。圖14說(shuō)明能捕獲蛋白的所需四級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)并因此將平衡拉向這個(gè)狀態(tài)的試劑(顯示為楔形物)的概念。因此，這些將干擾morpheins四級(jí)結(jié)構(gòu)平衡的試劑能夠抑制或活化蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑是抑制劑，其捕獲非活性形式并因此阻止形成活性形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白是PBGS，非活性形式是六聚體而活性形式是八聚體。該抑制劑的非限制性的例子是迷迭香酸或其衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑是激活劑，其捕獲該蛋白的活性形式。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)域”指通常在編碼序列上游(5’)發(fā)現(xiàn)的核酸序列，其通過(guò)提供RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)或在正確的位置啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄必需的其他因子來(lái)控制信使RNA(mRNA)的產(chǎn)生而控制編碼序列的表達(dá)。這里所述的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域包括通過(guò)連接到各種調(diào)控序列，隨機(jī)的或控制的突變，和添加或重復(fù)增強(qiáng)子序列而衍生的啟動(dòng)子變化。此處公開的啟動(dòng)子序列，和生物功能等同物當(dāng)被作為合適的重組載體的一部分引入到宿主中后負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)在其控制之下的編碼序列轉(zhuǎn)錄，正如其產(chǎn)生mRNA的能力來(lái)體現(xiàn)。
“再生”指從植物細(xì)胞(例如植物原生質(zhì)體或外植體)生長(zhǎng)植物的過(guò)程。
“轉(zhuǎn)化”指向細(xì)胞或原生質(zhì)體中引入外源核酸序列(例如，載體，重組核酸分子)的方法，其中外源核酸被整合到染色體中或能夠自主復(fù)制。
“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”是已經(jīng)通過(guò)引入外源核酸分子到細(xì)胞中而改變DNA的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“基因”指染色體DNA，質(zhì)粒DNA，cDNA，合成DNA，或其他編碼肽、多肽、蛋白的DNA，或RNA分子和與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的編碼序列的兩翼區(qū)域。
短語(yǔ)“對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域異源的DNA片段”表示編碼DNA區(qū)段不天然存在于與目前和啟動(dòng)子連接的相同基因中。
術(shù)語(yǔ)“編碼DNA”指編碼此處討論的任何酶的染色體DNA，質(zhì)粒DNA，cDNA，或合成DNA。
術(shù)語(yǔ)“基因組”當(dāng)其用于細(xì)菌時(shí)既包括細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體也包括質(zhì)粒。引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞中的本發(fā)明的編碼DNA因此或是染色體整合或是定位于質(zhì)粒中。術(shù)語(yǔ)“基因組”當(dāng)其應(yīng)用于植物細(xì)胞時(shí)不僅包括在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的染色體DNA中，還包括在細(xì)胞的亞細(xì)胞組分中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器DNA中。本發(fā)明引入到植物細(xì)胞中的DNA因此或是染色體整合或是定位于質(zhì)粒中。
術(shù)語(yǔ)“除草劑”指用于殺死或抑制植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“抑制劑”指滅活蛋白例如對(duì)生物體的生長(zhǎng)或生存來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的生物合成酶、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物和運(yùn)輸?shù)鞍椎拿富钚缘幕瘜W(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，抑制劑是滅活膽色素原合成酶的酶活性的化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“除草劑”此處用來(lái)定義施用于植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織的抑制劑。
術(shù)語(yǔ)“微生物”或“微生物體”指藻類、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物。
“過(guò)量表達(dá)”指由引入到宿主細(xì)胞的DNA編碼的多肽或蛋白的表達(dá)，其中所述多肽或蛋白或是不正常地存在于宿主細(xì)胞中，或是所述多肽或蛋白以比通常由編碼所述多肽或蛋白的內(nèi)源基因表達(dá)更高的水平存在于所述宿主細(xì)胞中。
術(shù)語(yǔ)“植物”指處于任何發(fā)育階段的植物或植物的部分。此處還包括插條，細(xì)胞或組織培養(yǎng)物和種子。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“植物組織”包括但不限于整個(gè)植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)物和組織形成結(jié)構(gòu)和/或功能單元的植物細(xì)胞的任何群體。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)體”指包括造粉體，葉綠體，有色體，造油體，eoplasts，黃化質(zhì)體，白色體和原質(zhì)體的植物細(xì)胞細(xì)胞器種類。這些細(xì)胞器是自主復(fù)制度并包含通常稱作“葉綠體基因組”的環(huán)狀DNA分子，其大小范圍從大約120kb到大約217kb，取決于植物種類，并通常包含反向重復(fù)區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)“固體”指塊莖(如土豆中)或果實(shí)(如西紅柿中)的非水性組分，主要包括淀粉和其他多糖，簡(jiǎn)單糖，非結(jié)構(gòu)糖類，氨基酸和其他有機(jī)分子。
術(shù)語(yǔ)“耐受/抵抗”指當(dāng)暴露于抑制劑或除草劑后繼續(xù)正常生長(zhǎng)或起作用的能力。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指向細(xì)胞、組織或植物中引入異源DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織或植物被理解為不僅包括轉(zhuǎn)化過(guò)程的終產(chǎn)物，還包括其轉(zhuǎn)基因后代。
“口用組合物”是一種產(chǎn)品，其在通常使用過(guò)程中為全身給藥具體治療劑的目的不是有意被吞服，而是為口腔活性的原因保留在口腔中一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間以基本接觸所有的牙齒表面和/或口腔組織?？谟媒M合物可以是單相口用組合物或可以是兩種或更多種口用組合物的組合。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“口服可接受的載體”表示合適的媒介，其能被用于以安全和有效的方式施用本發(fā)明組合物至口腔。這樣的媒介物包括的材料例如氟離子源、另外的抗結(jié)石劑，緩沖劑、其他的研磨材料，過(guò)氧化物源，堿金屬碳酸氫鹽，增稠劑，保濕劑，水，表面活性劑，二氧化鈦，香料系統(tǒng)，甜味劑，木糖醇，著色劑及其混合物。
術(shù)語(yǔ)“morpheins”在本發(fā)明公開中被用于描述具有不同功能特性(例如，不同的催化性質(zhì))的蛋白的不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型。用于這些四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的另外的術(shù)語(yǔ)包括“quatreins”，“isoquatomers”和”selkeins”。選擇后面的術(shù)語(yǔ)是根據(jù)神話中的selkie，其能夠?qū)?yīng)于特異的刺激而改變形式和功能。就植物和一些細(xì)菌PBGS而言，在morpheins之間轉(zhuǎn)換的刺激是變構(gòu)調(diào)節(jié)因子，即，試劑(如，鎂)。
給定的蛋白的Morpheins在二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上有部分差異，這些差異決定了四級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。在某些方面，morpheins類似朊蛋白；一個(gè)蛋白的序列可以經(jīng)歷構(gòu)型改變，其產(chǎn)生四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化(聚集狀態(tài))。然而，在另外的方面，morpheins與朊蛋白的差異在于寡聚體屬于固定多樣性而且四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是不可逆的，非致病性的，以及是正常生理調(diào)控過(guò)程的一部分。
因此，在本發(fā)明中，建議使用morpheins(四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型)的變構(gòu)調(diào)節(jié)的總機(jī)制。在該機(jī)制中，單體結(jié)構(gòu)不同于他們的二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)的某些方面，而這些差異決定了集合成為一種或另一種morphein。該機(jī)制示意性顯示于圖11-14中。
圖11是蛋白(morpheins)的兩種形式之間的平衡的兩維表示。一種形式的單元(如，單體)(此處顯示為方塊)含有四種不同的表面，為線、粗線、虛線和曲折線。自然相連的互補(bǔ)表面在此描述成粗線和虛線。這種聯(lián)系限定了單元之間接合的規(guī)則。當(dāng)方塊的亞基聯(lián)系潛能被滿足(換句話說(shuō)當(dāng)所有的粗線與所有的虛線聯(lián)系時(shí))，得到的最優(yōu)化的集合是四聚體。因此，寡聚體集合由單體的結(jié)構(gòu)和接合的規(guī)則規(guī)定。如圖11所示，方塊結(jié)構(gòu)與“裂片(splinter)”聯(lián)系，其是試劑(例如，變構(gòu)調(diào)節(jié)因子分子)的圖示形式；將方塊單體和方塊四聚體與裂片聯(lián)系影響多聚體蛋白的功能，例如就植物和一些細(xì)菌PBGS而言，鎂提供這些蛋白形式的穩(wěn)定性。
方塊單元與另一結(jié)構(gòu)處于平衡，后者與前者有一些然而不是全部的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相同，因此只共有一些表面特性。交替的單元顯示于圖11中的區(qū)段。該單體含有由粗線和虛線描述的表面；這些表面之間接合的規(guī)則與方形單元的規(guī)則相同。結(jié)果，遵循這一接合規(guī)則，交替的單元組裝成為三聚體。三聚體結(jié)構(gòu)和其單獨(dú)的組分不含變構(gòu)調(diào)節(jié)因子分子(裂片)的結(jié)合位點(diǎn)是重要的。因?yàn)榱哑€(wěn)定方塊及其寡聚體，存在裂片將把四級(jí)結(jié)構(gòu)的平衡拉向方塊和其寡聚體。
對(duì)六聚體PBGS的觀察提供了四級(jí)結(jié)構(gòu)如何用作變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的第一個(gè)例子。在來(lái)自光合成生物和一些細(xì)菌的PBGS中，比活性的蛋白濃度依賴性提供了全活性(假定是八聚體)形式和滅活(假定是六聚體)形式之間的平衡的證據(jù)(參見圖5A)。
圖11是對(duì)PBGS行為總體的描述。就PBGS而言，方形是擁抱二聚體而區(qū)段是分開的二聚體。在各情況下，有些結(jié)構(gòu)相同，但不是所有的表面特征相同，表面之間的接合規(guī)則必定是在兩個(gè)交替的結(jié)構(gòu)之間共有的第一近似值。就PBGS而言，寡聚體結(jié)構(gòu)的差異轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ芴匦缘牟町悺？梢院侠淼丶僭O(shè)其他蛋白的不同四級(jí)結(jié)構(gòu)也轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ芴匦缘牟町悺Ｒ呀?jīng)公知受體的二聚化與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。在本發(fā)明之前尚未被認(rèn)識(shí)的是，二聚體結(jié)構(gòu)內(nèi)單體的結(jié)構(gòu)可以與當(dāng)該單體的結(jié)構(gòu)不處在二聚體結(jié)構(gòu)時(shí)是不一樣的。
含有morpheins的蛋白另一個(gè)非限制性的例子是Ia型核糖核苷酸還原酶。為Ia型核糖核苷酸還原酶變構(gòu)調(diào)節(jié)提出的最新模型描述四聚體和六聚體之間的平衡(Cooperman和Kashlan，2003，Adv.In EnzymeRegulation，43167-187)。在該例子中，模型只是用于示例的目的而作者不具有蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)定義假定的morpheins的差別。然而，核糖核苷酸還原酶對(duì)于DNA的從頭生物合成是關(guān)鍵的，Ia型酶在所有真核生物中發(fā)現(xiàn)，而抑制DNA的從頭生物合成是癌癥化學(xué)治療的合理途徑。因此可以通過(guò)選擇性地將效應(yīng)物結(jié)合到對(duì)較低活性morphein獨(dú)特的表面而實(shí)現(xiàn)影響Ia型核糖核苷酸還原酶的功能(例如，抑制)。
本發(fā)明的多聚體蛋白應(yīng)該具有至少一個(gè)特性，例如蛋白濃度依賴的比活性或通過(guò)例如離子交換、非變性凝膠電泳，分析超離心，大小排阻層析(依據(jù)大小)而分離成為不同的集合的能力。
為證明上述平衡，可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究以顯示例如Km和Vmax；適用MM等式的作為底物濃度函數(shù)的活性；morpheins不能很好地?cái)M合雙曲線而是擬合雙雙曲線(參見Nature Structure Biology)。
多聚體蛋白功能非限制型的例子是酶活性和與其他分子相互作用的能力，例如，結(jié)合不同蛋白的能力。該功能可以被抑制或增強(qiáng)。監(jiān)測(cè)功能的改變可以通過(guò)例如監(jiān)測(cè)本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過(guò)穩(wěn)定較低活性的morphein來(lái)抑制蛋白的功能。
在某些實(shí)施方案中，試劑影響多聚體蛋白的功能。多聚體蛋白的功能非限制性的例子是活性，其中影響是抑制或活化中的至少一種。在某些實(shí)施方案中，試劑與具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型有關(guān)。在某些實(shí)施方案中，試劑結(jié)合到具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型。下文描述抑制八聚體PBGS的試劑的非限制性的例子。
PBGS的八聚體形式以生理相關(guān)的濃度范圍結(jié)合到底物，并且在生理pH下是有活性的。八聚體由四個(gè)擁抱二聚體組成，其中一個(gè)亞基的臂以強(qiáng)的桶對(duì)桶相互作用抱緊相鄰亞基的桶狀結(jié)構(gòu)。
新發(fā)現(xiàn)的八聚體形式PBGS是在生物體的子集中調(diào)控四吡咯生物合成的關(guān)鍵組分，該子集包括植物和一些致病細(xì)菌，但不包括人，動(dòng)物和真菌。六聚體形式在生理?xiàng)l件下基本是無(wú)活性的。具體而言，六聚體不能在生理相關(guān)濃度范圍內(nèi)結(jié)合底物，因?yàn)槠銴m值比八聚體的Km值大至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)。六聚體由三個(gè)分開的二聚體組成，其中N末端臂不與相鄰亞基以強(qiáng)的桶對(duì)桶接觸相互作用。
六聚體和八聚體形式之間的轉(zhuǎn)換包括蛋白結(jié)構(gòu)的顯著改變。參見，如圖5A。本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及抑制從六聚體到八聚體的結(jié)構(gòu)變化，以抑制植物和/或細(xì)菌中PBGS的活化和四吡咯的生物合成。由于抑制機(jī)制對(duì)植物和細(xì)菌有效，而對(duì)動(dòng)物無(wú)效，本發(fā)明提供了抑制細(xì)菌、抗菌和除草劑應(yīng)用的新途徑。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括那些PBGS在生理?xiàng)l件下被鎂調(diào)控后從六聚體向八聚體轉(zhuǎn)換的抑制劑。抑制劑可以是已知的或新的化合物。抑制劑在植物和細(xì)菌病原體的生長(zhǎng)和增長(zhǎng)過(guò)程中生理上顯著進(jìn)行六聚體向八聚體轉(zhuǎn)換的時(shí)候有效抑制四吡咯的生物合成。對(duì)從六聚體PBGS向八聚體PBGS的四級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的抑制是開發(fā)抗生素和除草劑的新靶。
PBGS蛋白的系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程中有一些變異，其中一些蛋白具有變構(gòu)的鎂，而其他蛋白不具有。具有變構(gòu)的鎂的PBGS包括古細(xì)菌域，除紅細(xì)菌(Rhodobacter)屬以外的所有細(xì)菌和所有光合成的真核生物域(如綠色植物)(24)。最近另一例外是瘧疾寄生蟲瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)。根據(jù)發(fā)明人先前確定的大腸桿菌(E.coil)PBGS的晶體結(jié)構(gòu)和此處公開的六聚體PBGS的結(jié)構(gòu)，看來(lái)變構(gòu)的鎂的作用是誘導(dǎo)低活性六聚體和高活性八聚體之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。Mg作用于PBGS上的六聚體-八聚體轉(zhuǎn)換是變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白功能的新型結(jié)構(gòu)范例。
E.coli PBGS的結(jié)構(gòu)顯示于圖9A-C并用于顯示PBGS結(jié)構(gòu)中常見的金屬結(jié)合變異。各E.coli PBGS單體含有兩個(gè)金屬離子，這兩個(gè)在系統(tǒng)發(fā)生上都不是保守的。活性位點(diǎn)含有對(duì)E.coli PBGS活性關(guān)鍵的鋅離子，但其三個(gè)半胱氨酸配體在許多PBGS中不存在。鋅在第二底物分子(33)的結(jié)合和反應(yīng)性中起作用。鋅位點(diǎn)的細(xì)節(jié)顯示于圖9B。此外，變構(gòu)的鎂可見與相鄰亞基的N末端臂在各α，β桶的界面處結(jié)合，結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)顯示于圖9C。結(jié)合變構(gòu)的鎂的序列決定簇不存在于所有PBGS中。
圖6顯示根據(jù)PBGS是否使用活性位點(diǎn)鋅和是否使用變構(gòu)的鎂將其分為四類(24)的示意圖。第一矩陣(最左)分為兩類(a)左邊的活性位點(diǎn)鋅(陰影)，和(b)右邊的無(wú)活性位點(diǎn)鋅(無(wú)陰影)。第二矩陣被分為兩類(a)頂部的無(wú)變構(gòu)的鎂(菱形)，和(b)底部的變構(gòu)的鎂(方塊)。組合兩個(gè)矩陣提供由四個(gè)象限組成的矩陣(最右)，其中西北象限(QNW)代表+Zn/-Mg，東北象限(QNE)代表-Zn/-Mg，西南象限(QSW)代表+Zn/+Mg，東南象限(QSE)代表-Zn/+Mg。
發(fā)明人以前定量了(24)已知序列向四個(gè)象限的下列分配QNW＝9；QNE＝2；QSW＝55和QSE＝63。因此，目前可用序列大約一半編碼需要的活性位點(diǎn)鋅，而另外一半相反(即，QNW+QSW～QNE+QSE)。與活性位點(diǎn)金屬模式的分配相反，超過(guò)90％的PBGS序列含有變構(gòu)的鎂結(jié)合的決定簇(即，QSW+QSE＞＞QNW+QNE)。
抑制劑對(duì)于含有變構(gòu)的鎂而不含有活性位點(diǎn)鋅的PBGS的亞組(即，QSE內(nèi)的PBGS)最有效。這些亞組是光合成的真核生物和細(xì)菌的亞組，包括病原體例如銅綠假單胞菌。這些PBGS蛋白引發(fā)蛋白濃度依賴的比活性性質(zhì)，其指示了活性較大的四級(jí)結(jié)構(gòu)形式和活性較小的四級(jí)結(jié)構(gòu)形式之間的相互轉(zhuǎn)換。另外參考NE象限，其中初步證據(jù)表明活性形式是六聚體。
因此，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑有效抑制來(lái)自細(xì)菌、古細(xì)菌或真核生物的八聚體PGBS的形成，假設(shè)八聚體PGBS含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)?？梢员槐景l(fā)明的組合物抑制的八聚體PGBS源的非限制性的列表顯示于圖8，其是包括細(xì)菌域、古細(xì)菌域和真核生物域的生物體的分類。圖7A和7B代表于2002年4月從GenBank和其他可網(wǎng)絡(luò)檢索的基因組獲得的PBGS序列的活性位點(diǎn)金屬結(jié)合殘基的比對(duì)?；趫D7顯示的信息將生物體分配到圖6的四個(gè)象限之一。富含半胱氨酸的叢(人PBGS第122，124和132位)結(jié)合位于活性位點(diǎn)蓋子(lid)上的精氨酸殘基(人PBGS第221位)顯示活性位點(diǎn)鋅結(jié)合位點(diǎn)的存在。不具有富含半胱氨酸位點(diǎn)鋅結(jié)合叢的種類反而含有富含天冬氨酸的區(qū)域和活性位點(diǎn)蓋子殘基是賴氨酸。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抑制劑取代金屬離子從而結(jié)合在金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選金屬離子是鋅或鎂。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抑制劑結(jié)合在活性位點(diǎn)。抑制劑可以結(jié)合在任何地方，但結(jié)合位點(diǎn)必須穩(wěn)定一種四級(jí)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選結(jié)合至在一種多聚體而不在另一種多聚體中存在的位點(diǎn)。
本發(fā)明的抑制劑可以使用以下方案鑒定。首先，提供包含變構(gòu)的鎂而不包含活性位點(diǎn)鋅的六聚體形式PBGS的模型。最初的模型可以是例如豌豆PBGS之一。其次，計(jì)算機(jī)虛擬篩選小分子數(shù)據(jù)庫(kù)以尋找會(huì)適合到與亞基的N末端部分相鄰的不能實(shí)施擁抱的結(jié)構(gòu)域的分子。不能實(shí)施擁抱的結(jié)構(gòu)域是分開的二聚體的至少一個(gè)區(qū)域，抑制劑結(jié)合到該區(qū)域上抑制二聚體的臂抱緊二聚體的桶，而這是形成另一個(gè)二聚體以形成活性八聚體所必須的。參見圖10，其中圓圈代表抑制劑。不能實(shí)施擁抱的結(jié)構(gòu)域的可能位點(diǎn)位于抱緊臂結(jié)合亞基主體的結(jié)合處(即，位于“腋窩”處)之下。理論上合適的分子將通過(guò)測(cè)定它們對(duì)豌豆PBGS的蛋白濃度依賴的比活性的作用而在體外按經(jīng)驗(yàn)測(cè)定，這可以使用人工基因構(gòu)建體獲得。這些以蛋白濃度方式抑制蛋白比活性的分子是良好的候選抑制劑。
以下的方法將允許鑒定結(jié)合到任何地方的抑制劑，不必須在PBGS上的不能實(shí)施擁抱的結(jié)構(gòu)域以抑制八聚體形成。PBGS比活性的功能分析將被首先用于從計(jì)算機(jī)篩選中鑒定的可得到的分子中選擇潛在的抑制劑，所述分子例如對(duì)人無(wú)害的物質(zhì)。在選擇了潛在的抑制劑后，它們將根據(jù)蛋白濃度進(jìn)一步篩選對(duì)比活性的影響。
因此，本發(fā)明提供影響多聚體蛋白的方法，該方法包括提供包括具有多個(gè)單元集合的多聚體蛋白，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及其中一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是(1)所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能；提供包括試劑的本發(fā)明的組合物，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到該集合上的結(jié)合位點(diǎn)而影響平衡，并將該集合與試劑接觸，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到結(jié)合位點(diǎn)并由此影響所述多聚體蛋白而影響平衡。在該方法的某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。在該方法的某些實(shí)施方案中，影響所述多聚體蛋白包括影響所述多聚體蛋白的功能。
還提供抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式的方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物施用于多聚體膽色素原合成酶；將組合物與較低活性形式聯(lián)系；抑制較低活性形式組裝形成活性形式并從而抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式。抑制劑非限制性的例子是迷迭香酸或其衍生物。
本發(fā)明組合物物優(yōu)選的應(yīng)用是用于抑制或防止人或動(dòng)物宿主中細(xì)菌域、古細(xì)菌域和/或真核生物域的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)。本發(fā)明組合物的其他應(yīng)用包括預(yù)防或抑制各種表面包括牙齒、管道、輪船或浸沒(méi)于水/空氣混合物中的任何表面的生物膜，上述各種表面可能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致?lián)p失的細(xì)菌。因此，例如，本發(fā)明的組合物可以有效預(yù)防或抑制藤壺在輪船表面的生長(zhǎng)。
取決于靶向的生物體，本發(fā)明的組合物可以用于預(yù)防或防止由某些種類導(dǎo)致的損失。QSE中的生物體的例子在表1，所以這些生物體是施用本發(fā)明的組合物的主要靶。使用表1作為指南，本發(fā)明組合物的各種應(yīng)用可以設(shè)想為，例如藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑。
表1具有SE象限的PBGS的細(xì)菌
有利的是，本發(fā)明的組合物有效治療或預(yù)防由細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物引起的疾病。該組合物有效防止形成多聚體PBGS(如，八聚體PBGS或具有較少數(shù)量單體的其他活性形式)并從而抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，多聚體PBGS含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。在該實(shí)施方案的一個(gè)變體中，該組合物有效治療或預(yù)防由于接觸細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物而導(dǎo)致的疾病。在該實(shí)施方案的另一個(gè)變體中，該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑中的至少一種。
在某些實(shí)施方案中，該組合物不包括變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和催化的鋅。在該實(shí)施方案的一個(gè)變體中，該組合物有效治療或預(yù)防由于接觸細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物而導(dǎo)致的疾病。在該實(shí)施方案的另一個(gè)變體中，該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑中的至少一種。
抗生素，除草劑和殺真菌劑通?；趯?duì)細(xì)菌、植物或真菌特異的而不存在于人/動(dòng)物中的關(guān)鍵途徑的抑制。例如，1)青霉素類抗生素針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，而動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，或2)除草劑草甘膦針對(duì)芳香氨基酸生物合成，而人不具有該途徑，我們必須食用芳香氨基酸。隨著我們對(duì)不同蛋白/酶的序列和結(jié)構(gòu)的差異了解越多，越有可能靶向普遍存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌中的關(guān)鍵途徑。通過(guò)抑制PBGS而靶向四吡咯生物合成途徑作為抗微生物劑或除草劑的基礎(chǔ)就是這樣的情況。在系統(tǒng)發(fā)生中各種生物PBGS金屬結(jié)合位點(diǎn)的變異為開發(fā)不抑制人PBGS的抑制劑提供了足夠的結(jié)構(gòu)差異。就PBGS而言，PBGS在morphein形式和在morphein表面的氨基酸序列之間平衡的固有能力，不同生物有著顯著的差異。就通過(guò)選擇性穩(wěn)定一種morphein形式而更普遍地抑制蛋白功能而言，可能的情況是，靶是不存在于人中的途徑，或者可能的情況是，靶只在活性位點(diǎn)外具有足夠的系統(tǒng)發(fā)生變異，因morpheins的表面差別很大。
在某些實(shí)施方案中，該組合物除了試劑外包括藥物可接受的介質(zhì)?！八幬锟山邮艿慕橘|(zhì)”表示的介質(zhì)，例如能夠以相對(duì)安全和有效的方式遞送抑制劑以及組合物中其他任何活性試劑至靶生物體的溶劑。該介質(zhì)本身不需要具有任何藥物活性。
這里使用的“藥物可接受的介質(zhì)”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑等。這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。除了目前所知的任何與本發(fā)明的抑制劑不匹配的常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，都可考慮在藥物組合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充的活性成分也可以摻入到組合物中。
作為游離堿或藥物可接受鹽的活性成分的溶液可以通過(guò)在水中與表面活性劑，例如羥丙基纖維素合適地混合而制備。分散系還可以在甘油、液體聚乙二醇，以上兩者的混合物和在油中制備。在通常的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制品包括防止所有微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
本發(fā)明的組合物可以包括傳統(tǒng)的藥物制品。本發(fā)明組合物的給藥將經(jīng)由任何常見途徑，只要靶組織可以通過(guò)該途徑是可獲得的。途徑包括口、鼻、頰、直腸、陰道或局部。另外，給藥可以通過(guò)原位的、皮內(nèi)的、皮下的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射。這些組合物正常情況下將以上述藥物可接受的組合物給藥。
本發(fā)明的組合物以液體溶液或懸液的可注射組合物的形式有利地給藥，也可以制備注射前在液體中適于制成溶液或懸液的固體。這些制品也可以被乳化。用于這一目的的典型組合物按每毫升磷酸鹽緩沖液包括50mg或直至大約100mg的人血清白蛋白。其他藥物可接受的載體包括水溶液，無(wú)毒賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機(jī)酯，例如油酸乙酯。水相載體包括水、醇/水溶液、鹽水溶液，胃腸道外的媒介例如氯化鈉、Ringer氏葡萄糖等。靜脈內(nèi)媒介包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。藥物中不同組分的pH和實(shí)際濃度根據(jù)公知的參數(shù)調(diào)整。
其他的制品適合用于口服給藥。口服制品包括典型的賦形劑，例如藥物等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。組合物采取溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋劑或粉末的形式。當(dāng)給藥途徑是局部時(shí)，藥物形式可以是乳膏、油膏、軟膏或噴劑。
治療劑的有效量根據(jù)預(yù)計(jì)的目標(biāo)來(lái)決定。術(shù)語(yǔ)“單位劑量”指適合給對(duì)象使用的物理上不連續(xù)的單位，各單位包含預(yù)定量的藥物組合物，該量被計(jì)算以產(chǎn)生與其給藥有關(guān)的所需反應(yīng)，所述給藥即合適的途徑和治療方案。待給藥的量，根據(jù)治療的次數(shù)和單位劑量，取決于待治療的對(duì)象、對(duì)象的狀態(tài)和所需的保護(hù)。藥物組合物的精確量還取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷并且對(duì)各個(gè)體是獨(dú)特的。
本發(fā)明組合物的另一應(yīng)用是除草劑，其中該組合物另外包括有效除草的介質(zhì)。“有效除草的介質(zhì)”表示介質(zhì)，例如能對(duì)靶生物體遞送抑制劑以及組合物中其他任何活性試劑的溶劑。該介質(zhì)本身不需要具有任何除草活性。
對(duì)作物施用抗細(xì)菌組合物的指南提供如下由于所有的光合成真核生物都落入圖6的QSE象限，它們本身是本發(fā)明抑制劑的靶。然而，圖10顯示的腋窩抑制劑結(jié)合位點(diǎn)在植物和細(xì)菌之間具有顯著的系統(tǒng)發(fā)生的差異。
因此，作為作物抗細(xì)菌噴劑的試劑必須是那些結(jié)合到細(xì)菌PBGS的該位點(diǎn)上，而不結(jié)合到植物PBGS位點(diǎn)的試劑。
本發(fā)明的組合物包括準(zhǔn)備立即使用的稀釋組合物和需要在使用前通常用水稀釋的濃縮組合物。
固體組合物可以是顆粒，和粉末的形式，其中活性成分與磨碎的固體稀釋劑，例如高嶺土、斑脫土、硅藻土、白云石、碳酸鈣、云母、氧化鎂粉、Fuller氏土或石膏或其組合相混合。它們還可以采用可分散的粉末或顆粒的形式，包括濕潤(rùn)劑以促進(jìn)粉末或顆粒在液體中的分散。粉末形式的固體組合物可以作為粉塵施用。
液體組合物可以包括活性組分在水中的溶液、懸液和分散系，所述水任選含有表面活性劑，或可以包括活性組分在水可混溶的有機(jī)溶劑中的溶液或分散系，其以小滴分散在水中。除草劑組合物適合在罐中混合以制備準(zhǔn)備立即使用的稀釋組合物或用于形成濃縮物。
溶液或分散系的制備方法是使活性組分溶解在任選包括濕潤(rùn)劑或分散劑的水或有機(jī)溶劑中，然后當(dāng)使用有機(jī)溶劑時(shí)，將如上獲得的混合物加到任選包含濕潤(rùn)劑或分散劑的水中。合適當(dāng)有機(jī)溶劑包括，例如，二氯乙烯、異丙醇、丙二醇、雙丙酮醇、甲苯、煤油、甲基萘、二甲苯或三氯乙烯或其組合。
其他的添加劑和佐劑也可存在于本發(fā)明的組合物中。例子包括抗凍劑例如乙二醇和丙二醇；染料；分散劑；流變劑；止泡劑例如基于硅酮的試劑；和濕潤(rùn)劑例如乙二醇。
在此基礎(chǔ)上除草劑的開發(fā)允許開發(fā)除草劑抗性作物，其方法是使這些抗性作物對(duì)圖6的四個(gè)象限中的上部?jī)蓚€(gè)象限中的PBGS，例如人PBGS為轉(zhuǎn)基因(即，包含從另外的物種人工轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì))。
除草劑抗性植物還提供多聚體膽色素原合成酶轉(zhuǎn)基因的除草劑抗性植物，所述酶基本以擁抱二聚體的多聚體形式存在。在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶來(lái)自人。在某些實(shí)施方案中，多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。下面提供制備適應(yīng)于多聚體膽色素原合成酶轉(zhuǎn)基因的除草劑抗性植物的指南。
以雙鏈DNA形式存在的基因在植物中的表達(dá)包括信使RNA(mRNA)從DNA的一條鏈被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，和隨后mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞核內(nèi)的加工。該加工涉及到3′非翻譯區(qū)，在RNA的3’末端加上聚腺苷酸。DNA轉(zhuǎn)錄為RNA受到通常稱作啟動(dòng)子的DNA區(qū)域的調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子區(qū)域包含發(fā)信號(hào)給RNA聚合酶，使其與DNA連接并使用DNA的一條鏈作為模板啟動(dòng)mRNA轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)mRNA互補(bǔ)鏈的堿基序列。該mRNA然后被用作模板，通過(guò)細(xì)胞生物合成機(jī)器生產(chǎn)其中編碼的蛋白。
在本發(fā)明中，選擇的啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)具有所需的組織和發(fā)育的特異性。因此，啟動(dòng)子功能應(yīng)當(dāng)通過(guò)選擇具有所需的組織表達(dá)能力和啟動(dòng)力接近的啟動(dòng)子和選擇產(chǎn)生所需的PBGS活性的轉(zhuǎn)化子而被優(yōu)化。從轉(zhuǎn)化子池篩選的方法通常在植物的異源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)中采用，這是因?yàn)橹参锘蚪M內(nèi)的基因插入位點(diǎn)導(dǎo)致在含有相同異源基因的轉(zhuǎn)化子之間存在差異(通常稱為“位置效應(yīng)”)。除了已知導(dǎo)致植物細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄(組成型或組織特異)的啟動(dòng)子，其他的啟動(dòng)子可以通過(guò)篩選植物cDNA文庫(kù)查找選擇性地或優(yōu)選地在所需的時(shí)間內(nèi)表達(dá)的基因，然后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離啟動(dòng)子區(qū)域而被鑒定用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，PBGS轉(zhuǎn)基因?qū)㈨憫?yīng)光而在葉綠體中表達(dá)。更具體地，PBGS轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)錄成mRNA，而mRNA在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯為前體多肽(葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)/PBGS)。前體多肽然后備轉(zhuǎn)運(yùn)(引入)到葉綠體中。在植物細(xì)胞中具活性的數(shù)個(gè)葉綠體可光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。這樣的啟動(dòng)子的例子包括來(lái)自非常豐富的植物多肽核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亞基的可光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子和近來(lái)被用于光可控啟動(dòng)子系統(tǒng)的光敏色素啟動(dòng)子(Shimizu-Sato等，2002)。這些啟動(dòng)子中一些已經(jīng)被用于產(chǎn)生在植物中表達(dá)的各種類型的DNA構(gòu)建體；參見例如PCT公開WO 84/02913。
其他已知的或發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致DNA在植物細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)于光而轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明。這樣的啟動(dòng)子可以從各種來(lái)源獲得，例如植物和植物病毒，包括但不限于增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子和從植物基因例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亞基的基因分離到的啟動(dòng)子。如下文所述，優(yōu)選選擇的具體啟動(dòng)子應(yīng)該能夠?qū)е鲁浞值谋磉_(dá)以產(chǎn)生有效量的PBGS酶來(lái)生產(chǎn)足夠的四吡咯維持生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是滲漏的以提供植物中非光合成功能所必需的四吡咯。
PBGS活性的質(zhì)體指導(dǎo)的表達(dá)在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，PBGS基因融合到CTP上，以將PBGS蛋白靶向到質(zhì)體。如下文中使用的葉綠體和質(zhì)體將包括各種形式的質(zhì)體，包括造粉體。許多定位于質(zhì)體的蛋白從核基因表達(dá)為前體并通過(guò)CTP靶向到質(zhì)體，CTP在隨后的引入步驟中被除去。這樣的葉綠體蛋白的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，SSU)的小亞基，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白氧化還原酶，捕光復(fù)合體蛋白I和蛋白II，和硫氧還蛋白F。耐草甘膦的EPSP合成酶植物基因也編碼含CTP的多肽，其使得EPSP合成酶多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠體(U.S.專利5310667)。已經(jīng)顯示非質(zhì)體蛋白可以通過(guò)使用具有CTP的蛋白融合被靶向到葉綠體，而CTP序列足以將蛋白靶向到質(zhì)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到可以生產(chǎn)利用具體質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的功能將PBGS酶引入到植物細(xì)胞質(zhì)體中的各種其他嵌合構(gòu)建體。PBGS基因還可以通過(guò)將基因轉(zhuǎn)化到葉綠體基因組而被靶向到質(zhì)體(Daniell等，1998)。一般來(lái)說(shuō)，諸如CTP的葉綠體吸收信號(hào)富含Ser，Thr和小的疏水氨基酸殘基。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的RNA還可以包含5′非翻譯引導(dǎo)序列。該序列可以衍生自選擇用于表達(dá)基因地啟動(dòng)子并可以被特異性修飾以增強(qiáng)mRNA的翻譯。5′非翻譯區(qū)還可以從病毒RNAs，從合適的真核基因，或從合成的基因序列獲得。本發(fā)明不限于非翻譯區(qū)來(lái)自伴隨著啟動(dòng)子序列的5′非翻譯區(qū)的構(gòu)建體。相反，非翻譯的引導(dǎo)序列可以來(lái)自不相關(guān)的啟動(dòng)子或編碼序列。
在單子葉植物中，優(yōu)選在基因構(gòu)建體中包含內(nèi)含子以利于或增強(qiáng)編碼序列的表達(dá)。合適的內(nèi)含子的例子包括HSP70內(nèi)含子和水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，兩者都是本領(lǐng)域公知的。另一個(gè)合適的內(nèi)含子是蓖麻子過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子(Suzuki等，1994)。
多腺苷酸信號(hào)嵌合植物基因的3′非翻譯區(qū)包含在植物中向RNA的3’末端添加多腺苷酸的多腺苷酸化信號(hào)。合適的3′區(qū)的例子是(1)3′轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，含有農(nóng)桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；蚶珉僦瑝A合成酶(NOS)基因的多腺苷酸化信號(hào)，和(2)植物基因，如大豆儲(chǔ)存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，SSU)基因的小亞基。
植物轉(zhuǎn)化/再生在開發(fā)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體時(shí)，構(gòu)建體的各種組分或其片段將通常被插入到方便的克隆載體，例如能在細(xì)菌宿主如E.coli中復(fù)制的質(zhì)粒中。存在許多已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述的載體，其中許多可以從商業(yè)購(gòu)得。在各克隆之后，具有所需的插入物的克隆載體可以被分離，并進(jìn)一步操作，例如限制性酶消化，插入新的片段或核苷酸，連接，缺失，突變，切除等以適應(yīng)所需序列的組分。一旦構(gòu)建體已經(jīng)完成，其然后可以被轉(zhuǎn)移到合適的載體中，根據(jù)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方式用于進(jìn)一步操作。
本發(fā)明的重組DNA分子通常包括可選擇的標(biāo)記以便轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以被容易地鑒定并從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇出來(lái)。這樣的例子包括但不限于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因(Potrykus等，1985)，其賦予卡那霉素抗性。表達(dá)nptII基因的細(xì)胞可以使用合適的抗生素例如卡那霉素或G418選擇。其他常用的可選擇標(biāo)記物包括bar基因，其賦予雙丙氨膦抗性；突變的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，其賦予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予溴苯腈(bromoxynil)抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其賦予咪唑啉酮或磺脲抗性(歐洲專利申請(qǐng)154,204，1985)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
可以用于表達(dá)PBGS轉(zhuǎn)基因的植物包括但不限于，刺槐，紫花苜蓿，小茴香，蘋果，杏，朝鮮薊，芝麻菜，蘆筍，鱷梨，香蕉，大麥，豆，甜菜，黑莓，越桔，椰菜，球芽甘藍(lán)，卷心菜，油菜，羅馬甜瓜，胡蘿卜，木薯，花椰菜，芹菜，櫻桃，芫荽葉，柑橘屬，克萊門氏小柑橘，咖啡，玉米，棉花，黃瓜，花旗松，茄子，菊苣，茅菜(escarole)，桉樹，茴香，無(wú)花果，葫蘆，葡萄，葡萄柚，蜜瓜(honey dew)，豆薯，獼猴桃，生菜，青蒜，檸檬，酸橙，火炬松，芒果，甜瓜，蘑菇，堅(jiān)果，燕麥，油菜(oil seed rape)，秋葵，洋蔥，橙，觀賞植物，番木瓜，歐芹，豌豆，桃子，花生，梨，辣椒，柿子，松樹，菠蘿，車前草，李子，石榴，白楊，土豆，南瓜，溫柏，輻射松(radiata pine)，紅菊苣，蘿卜，懸鉤子，水稻，黑麥，高粱，南方松，大豆，菠菜，南瓜(squash)，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，甘薯，楓香，橘子(tangerine)，茶，煙草，番茄，黑小麥，草皮，藤，西瓜，小麥，山藥，和西葫蘆(zucchini)。
PBGS基因可以通過(guò)任何合適的方法插入到植物基因組中。合適的植物轉(zhuǎn)化載體包括來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，以及在例如由Herrera-Estrella等(1983)，Bevan(1984)，Klee等(1985)和EPO公開120,516中揭示的載體。除了來(lái)自農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；蚋T導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體，替代的方法也可以用于將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體插入到植物細(xì)胞中。這樣的方法可以包括，例如，利用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA吸收的化學(xué)品，利用微注射轟擊的游離DNA遞送，和使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化。DNA還可以被插入到葉綠體基因組(Daniell等，1998)。
適合使用微注射轟擊在單子葉植物中引入PBGS基因的質(zhì)粒表達(dá)載體包括如下CTP；光可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；PBGS基因；提供利于基因表達(dá)的剪切位點(diǎn)的內(nèi)含子例如Hsp70內(nèi)含子(PCT公開WO93/19189)；和3′多腺苷酸化序列例如胭脂堿合成酶3′序列(NOS 3′；Fraley等，1983)。這個(gè)表達(dá)盒可以在適合用于生產(chǎn)大量待注射到植物中的DNA的高拷貝復(fù)制子上組裝。
用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物特別有用的基于農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化載體是質(zhì)粒載體pMON530(Rogers等，1987)。質(zhì)粒pMON530是通過(guò)向pMON526中轉(zhuǎn)移pMON316 2.3kb StuI-HindIII的片段而制備的pMON505的衍生物(Rogers等，1987)。質(zhì)粒pMON526是pMON505的簡(jiǎn)單衍生物，其中SmaI位點(diǎn)通過(guò)用XmaI消化，Klenow聚合酶處理和連接而除去。質(zhì)粒pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表達(dá)盒的所有性質(zhì)，并且現(xiàn)在在啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)之間包含獨(dú)特的SmaI切割位點(diǎn)。
雙載體pMON505是pMON200(Rogers等，1987)的衍生物，其中Ti質(zhì)粒同源區(qū)域LIH被微型RK2質(zhì)粒pTJS75(Schmidhauser和Helinski，1985)的3.8kb HindIII-SmaI片段取代。該片段包含RK2復(fù)制起始點(diǎn)oriV，和轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)oriT，用于通過(guò)三親交配方法(tri-parental matingprocedure)(Horsch和Klee，1986)結(jié)合到農(nóng)桿菌中。質(zhì)粒pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需片段的合成的多接頭，植物細(xì)胞卡那霉素抗性的嵌合NOS/NPTII′/NOS基因，用于在E.coli和根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)中選擇的奇放線霉素/鏈霉素抗性決定簇，易于對(duì)轉(zhuǎn)化子及后代中的遺傳性進(jìn)行評(píng)估的完整胭脂堿合成酶基因，和便于在E.coli中制備大量載體的pBR322復(fù)制起始點(diǎn)。質(zhì)粒pMON505含有來(lái)自pTiT37胭脂堿-型T-DNA右端的的單個(gè)T-DNA邊界。Southern雜交分析顯示質(zhì)粒pMON505和其攜帶的任何DNA被整合到植物基因組中，即，整個(gè)質(zhì)粒是插入到植物基因組中的T-DNA。整合的DNA的一端位于右邊界序列和胭脂堿合成酶基因之間，而另一端位于邊界序列和pBR322序列之間。
另一個(gè)特別有用的Ti質(zhì)粒盒式載體是pMON17227。該載體描述在PCT公開WO 92/04449中并含有編碼賦予草甘膦抗性的酶的基因(命名為CP4)，其是對(duì)包括土豆和西紅柿的許多植物而言優(yōu)異的選擇性標(biāo)記基因。該基因被融合到擬南芥(Arabidopsis)EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP2)并通過(guò)此處描述的FMV啟動(dòng)子表達(dá)。
當(dāng)獲得了足夠數(shù)量的含有PBGS基因的細(xì)胞(或質(zhì)體)時(shí)，該細(xì)胞(或質(zhì)體)被再生到整個(gè)植物中。再生步驟的方法的選擇不是關(guān)鍵的，對(duì)下列宿主而言，合適的方案是可用的豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿，大豆，苜蓿等)，傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜，芹菜，歐洲防風(fēng)草)，十字花科(Cruciferae)(甘藍(lán)，蘿卜，油菜/油菜籽等)，葫蘆科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)，穎花科(Gramineae)(小麥，大麥，水稻，玉米等)，茄科(Solanaceae)(馬鈴薯，煙草，番茄，胡椒)，各種開花作物，比如向日葵，和結(jié)堅(jiān)果的樹，比如杏仁，腰果，胡桃，和美洲山核桃樹。參見例如Ammirato等(1984)；Shimamoto等(1989)；Fromm(1990)；Vasil等(1990)；Vasil等(1992)；Hayashimoto(1990)；和Datta等(1990)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PBGS基因來(lái)自不包含Mg2+而包含Zn2+的PBGS酶的物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該物種是酵母或人。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變的PBGS基因被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PBGS基因通過(guò)同源重組被引入到植物基因組中?？捎糜谏赊D(zhuǎn)基因植物的野生型人PBGS基因組DNA和全長(zhǎng)cDNA如下所示人PBGS基因(SEQ ID NO1)cttacgcggtctgtgggagaccggagcgggagacagcggtgacaggagcagcggccgggagcccttagggaggcagacagagcctgcagccaatgccccaggagccctcggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaatccatctgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagggtatcggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgtaccacgtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggagacagtgccaggcccaagaactagaactttaaaacgttcccggggcctcagacaagtgaaaaccaaagtaaatgctgcttttagaactgtgccctcatgccctcttcctgctcacatgctagcggggcccagcagccctgggtggttttgccagcatgctaactcttgtaactcgcagctgcatcctatgagctctcccaagcttccccgcccctcccctgggtcagccgtgaggcccacctttgccaccctcagctctttcctctggtgtggcttcagcttgaaagcaacctggagtcgggggcacagcctttggggcctggctgggagagggtcttggagcattaggggaagaagagagcagtgggatcttggggcctgagaagccttggaacgcttctggcagcagagctgggtgtgggaatgaggcctagatcgatatccctgggttagagttgaaatttgccgcaattccactggaaggcatttcccacgaggccagaggttgccaggctgcctgaggtctcctattctactctgaaccataaacccagagaagaattactcattaaccagcataaatactgcctgaggatcaaaactcagaggcaaagagggagttcctgactgctagaggtgccaccaccacaaacactttttattcaggagatactttttgagaatctctgctctgttcctaggttcagtgctgggtcctgggaatacagcaggacagacctcagcttatctcttcatagaaattatacaaagagaattggggagacagctaagaagaaaacaaagaaataaagcagttacaaattgtgataagtgctttgaaggaaagaaggggtctgagacaacaacagggaaggggcctctcttgaaacagtagttgggaaggaggcagacatgcaccagtgatgtggtgacaggtgctctgaaggaggtcaccaggacctgacctctttgaaggatcagaaaatacttccctgaaggactgacatttgagcctagacctgaagggtgagccatcaagctaagacaattggggaagagcattccagggagagggaggagttgtgcaaaggccctggggctccttctagctggaggaatgcaaggctagcttgtctggagcactgagaggatggcctgaactgagtggagagagacagaccaggaccaaaccatgcagaggtcaagggccacattcaccttttcagagtgactcaatcaaatttgtagtttgtaaaagtattttaacagctctgcggcaaagtgcaaatgaaaagtcttgatggcatggactggagcggggacagtggggatggagaaaggggaatggattgtggatgtgtttagaaggtagattcgatgtgaaggatgaatctggcttgaccttctgggtggctgatgggccatttactgagatggggcagcctggaagaggaacagaagcagggtcggggtggagggagaatactaaacttagcttgagacattttgcaataaggaagctatatctagagtgcttatgtgactcacctaaggccactcaacaagtttgtggcagaactggattagaactgcacagaaaacagccaagctgggatttgaacccatgtagtccaactccaaggcctctgcccctaaccactgtgccataccacctcccaataatcaacagcaaaattataggtctaacaatgttttatagacacccctccatttatgtgatgggtttgcatcctgataaacccatcataagttgaaaatatgatcataagttgaaaatatgatcataagtcaaaaatgtatttaatatacctaacctaccaaacatcatagcttagcctagcctgccttaaacatgctcagaacacttacattagcctacagtgggcaaaactatccaacacaaaatctatattgtaataaagttgtaaagaattttgaataaaaattcaatatttgaaaaaaaaaaaaaaaaa人PBGS cDNA(SEQ ID NO2)gcagccaaagccccaggagccctaggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaatccatctgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagggtatcggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgtaccacgtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggaggacagtgccaggcccaagaactagaactttcaaacgttcccggggcctcagacaagtgacaaccaaagtaaatgctgcttttagaactgt人PBGS氨基酸序列(SEQ ID NO3)MQPQSVLHSGYFHPLLRAWQTATTTLNASNLIYPIFVTDVPDDIQPITSLPGVARYGVKRLEEMLRPLVEEGLRCVLIFGVPSRVPKDERGSAADSEESPAIEAIHLLRKTFPNLLVACDVCLCPYTSHGHCGLLSENGAFRAEESRQRLAEVALAYAKAGCQVVAPSDMMDGRVEAIKEALMAHGLGNRVSVMSYSAKFASCFYGPFRDAAKSSPAFGDRRCYQLPPGARGLALRAVDRDVREGADMLMVKPGMPYLDIVREVKDKHPDLPLAVYHVSGEFAMLWHGAQAGAFDLKAAVLEAMTAFRRAGADIIITYYTPQLLQWLKEE本發(fā)明的組合物適合作為個(gè)人護(hù)理制品中的抗微生物活性成分，所述個(gè)人護(hù)理制品例如洗發(fā)水，沐浴添加劑，頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品，液體和固體肥皂(基于合成的表面活性劑和飽和的和/或不飽和的脂肪酸的鹽)，乳液和乳霜，除味劑，其他水性或醇的溶液，例如皮膚的清潔溶液，濕潤(rùn)清潔布，油或粉。因此本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明組合物的個(gè)人護(hù)理制品，和Holzl等的美國(guó)專利6,689,372描述的任選的美容可耐受的載體或佐劑。該組合物將以有效具有抗微生物效果，即抑制或防止微生物活性的量使用?？梢允褂闷渌慕M分，例如，螯合劑，著色劑，香料油，增稠或固化(稠度調(diào)節(jié))劑，潤(rùn)膚劑，UV吸收劑，皮膚保護(hù)劑，抗氧化劑，提高機(jī)械性質(zhì)的添加劑例如二羧酸和/或脂肪酸的Al，Zn，Ca和Mg鹽，和任選的防腐劑。此外，本發(fā)明提供皮膚、粘膜或毛發(fā)抗微生物治療的方法，包括將需要所述抗微生物治療的人的皮膚、粘膜或毛發(fā)與抗微生物有效量的本發(fā)明組合物接觸。
根據(jù)本發(fā)明的個(gè)人護(hù)理制品可以配制成油包水或水包油的乳液，醇或含醇的制品，離子或非離子的兩性脂的囊泡分散系，凝膠，固體棍或氣溶膠制品。
作為水包油或油包水的乳液，美容可耐受的佐劑包含例如5-50％的油相，5-20％乳化劑和30-90％的水。油相可以包含任何適合用于美容制品的油，例如一種或多種烴油，蠟，天然的油，硅酮油，脂肪酸酯或脂肪醇。優(yōu)選的一元醇或多元醇是乙醇，異丙醇，丙二醇、己二醇、甘油和山梨糖醇。
根據(jù)本發(fā)明的美容制品可以包含在Holzl等的U.S專利6,689,372所述的多種美容制品中。尤其考慮下列制品，例如皮膚護(hù)理制品，如采用片劑或液體肥皂形式的皮膚清洗和清潔制品，無(wú)皂的去污劑或洗滌軟膏；沐浴制品，例如液體(沐浴泡沫，乳液，淋浴制品)或固體沐浴制品，如洗浴香精塊和浴鹽；皮膚護(hù)理制品，如皮膚乳液，多乳液或皮膚油；美容個(gè)人護(hù)理制品，如采用日霜或粉霜形式的面部彩裝，面部粉底(散狀或壓縮)，腮紅(rouge)或粉底霜(cream make-up)，眼部護(hù)理制品，如眼影制品，睫毛膏，眼線，眼霜或固眼霜(eye-fix creams)；唇部護(hù)理制品，如唇膏，唇彩，唇線筆，指甲護(hù)理制品，例如指甲油，洗甲水，指甲強(qiáng)化劑或表皮去除器；私密衛(wèi)生制品，如私密洗液或私密噴劑；足部護(hù)理制品，如足浴液，足粉，足乳或足部香膏，特別的除味劑和止汗劑或除繭制品；防曬制品，例如防曬奶，防曬液，防曬霜，和防曬油，防曬乳或tropicals，曬黑前(pre-tanning)制品或曬后護(hù)理制品；皮膚曬黑制品，如自助曬黑霜；去除色素制品，如漂白皮膚的制品或皮膚發(fā)光制品；驅(qū)蟲劑，如驅(qū)蟲油，驅(qū)蟲液，驅(qū)蟲噴霧或驅(qū)蟲棒；除味劑，例如除味噴霧，泵作用的噴霧，除味凝膠，除味棒或除味滾珠；止汗劑，如止汗棒，止汗霜或止汗珠；清潔和護(hù)理皮膚斑的制品，如無(wú)皂去污劑(固體或液體)，磨砂制品或磨砂面膜；化學(xué)形式的脫毛制品，如脫毛粉，液體脫毛制品，霜或膏形式的脫毛制品，凝膠形式或氣溶膠泡沫的脫毛制品；剃須制品，如剃須皂，泡沫剃須霜，無(wú)泡剃須霜，泡沫和凝膠，干剃須的須前制品，須后水或須后液；香味制品，如香料(古龍水(eau de Cologne)，盥用水(eau de toilette)，淡香水，盥用香水(parfum de toilette)，香水)，香精油或膏體香氛；牙齒護(hù)理、假牙護(hù)理和口腔護(hù)理制品，如牙膏，凝膠牙膏，牙粉，濃縮漱口水，抗牙菌斑漱口水，假牙清潔劑或假牙固著劑；美容頭發(fā)處理制品，如洗發(fā)水或護(hù)發(fā)素形式的洗發(fā)制品，頭發(fā)護(hù)理制品，如預(yù)處理制品，頭發(fā)滋潤(rùn)劑，造型霜，造型凝膠，潤(rùn)發(fā)油，毛發(fā)漂洗劑，處理包(treatment packs)，加強(qiáng)型頭發(fā)處理，頭發(fā)構(gòu)造制品，如產(chǎn)生持久波浪的頭發(fā)波浪制品(熱燙，溫燙，冷燙)，頭發(fā)順直制品，液體頭發(fā)固定制品，泡沫，噴發(fā)劑，漂白制品；如過(guò)氧化氫溶液，發(fā)光洗發(fā)水，漂白霜，漂白粉，漂白膏或油，暫時(shí)的、半持久的或持久的頭發(fā)著色劑，含有自氧化染料的制品，或天然的頭發(fā)著色劑，例如指甲花(henna)或甘菊。
根據(jù)本發(fā)明的口用組合物可以是，例如，凝膠、膏、霜或水性制品(漱口水)形式。
根據(jù)本發(fā)明的口用組合物還可以包括釋放有效抵抗齲齒形成的氟離子的化合物，例如無(wú)機(jī)氟鹽，如氟化鈉、氟化鉀、氟化銨或氟化鈣，或有機(jī)氟鹽，如氟化胺，其以商品名Olafluor而公知。
本發(fā)明的組合物還適合用于處理紡織品纖維材料。這樣的材料是如絲，羊毛，聚酰胺或聚氨酯的未染色的和染色的或印花纖維材料，和尤其是各種纖維素纖維材料。這樣的纖維材料是，例如，天然纖維素纖維，例如棉、亞麻、黃麻和大麻，以及纖維素和再生的纖維素。優(yōu)選的合適的紡織纖維材料由棉制成。本發(fā)明的組合物還可以用于洗滌和清潔制品，如用于液體或固體洗滌劑或柔軟劑。
本發(fā)明的組合物還適合給予塑料以抗微生物性質(zhì)，所述塑料如聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、乳膠等。因此應(yīng)用的領(lǐng)域?yàn)?，例如，地板覆蓋物，塑料涂層，塑料容器和包裝材料，廚房和浴室用具(如，刷子、浴簾、海綿、防滑墊)，乳膠過(guò)濾器材料(空氣和水過(guò)濾器)，用于醫(yī)藥領(lǐng)域中的塑料物品，如敷料，注射器、導(dǎo)管等，所謂“醫(yī)療器械”，手套和墊子。
紙，例如用于衛(wèi)生目的的紙，還可以使用本發(fā)明的組合物使其具有抗微生物性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，使無(wú)紡布，如尿布，衛(wèi)生巾，緊身襯里(panty liners)和用于衛(wèi)生和家居的布具有抗微生物性質(zhì)也是可能的。
該組合物還可以尤其用于家居和全能的清潔劑以清潔和消毒硬表面。
除了對(duì)化妝品和家居產(chǎn)品防腐之外，技術(shù)產(chǎn)品例如紙?zhí)幚硪骸⒌矸刍蚶w維素衍生物的印花增稠劑，表面涂層和涂料也可以被防腐和具有抗微生物性質(zhì)。
本發(fā)明的組合物還適合于對(duì)木材的抗微生物處理和對(duì)皮革的抗微生物物處理并使皮革具有抗微生物性質(zhì)。
本發(fā)明的化合物還適合于保護(hù)化妝品產(chǎn)品和家居產(chǎn)品免受微生物損壞。
此外，本發(fā)明的組合物還可以用作口用組合物，例如White，Jr.等的U.S.專利6,740,311描述的與口腔可接受的載體結(jié)合的牙粉組合物。這種口用組合物的非限制性的例子是適用于人和動(dòng)物的牙膏、牙粉、預(yù)防性牙膏、糖錠、口香糖等。
此外，本發(fā)明的組合物可以用于制備抗微生物表面。此外提供制備抗微生物表面的方法，該方法包括(1)提供本發(fā)明的組合物，其中該組合物有效抑制或防止形成多聚體膽色素原合成酶的活性形式并從而抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假定多聚體膽色素原合成酶的活性形式包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物和除草劑中的至少一種；(2)提供表面形成基質(zhì)；和(3)將組合物與表面形成基質(zhì)組合并從而制備抗細(xì)菌表面。在本方法的一個(gè)變體中，抗細(xì)菌表面適應(yīng)于防止或抑制生物膜的形成。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“表面形成基質(zhì)”包括生物可降解和不可降解的聚合物、硅石、陶瓷及其組合，用于將組合物和基質(zhì)混合、分層或連接。該組合物還可以置于基質(zhì)的頂部或底部表面。
在本發(fā)明中，提供操縱植物生長(zhǎng)或增長(zhǎng)的方法，包括對(duì)植物施用作為除草劑的本發(fā)明的組合物，其中該植物是除草劑抗性的并適應(yīng)于對(duì)基本以擁抱二聚體的多聚體形式存在的多聚體膽色素原合成酶是轉(zhuǎn)基因的。在本方法的一個(gè)變體中，多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明將通過(guò)以下是實(shí)施例更詳細(xì)地解釋，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于此。
實(shí)施例作為例子的膽色素原合成酶或MORPHEINS下面的實(shí)施例揭示了PBGS可以以替代的四級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)存在以及在一些物種中這些狀態(tài)形式的相互轉(zhuǎn)換形成該P(yáng)BGS變構(gòu)調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。PBGS公知的四級(jí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)是八聚體，由擁抱二聚體構(gòu)成。還已知一些PBGS，尤其是圖6中QSE的那些，以對(duì)比活性的蛋白濃度依賴性所顯示的四級(jí)結(jié)構(gòu)形式的平衡存在。對(duì)比活性的蛋白濃度依賴性表明最大活性的寡聚體可以解離或重結(jié)合成為更小的活性較低的形式。之前認(rèn)為更小的活性較低的形式，也是擁抱二聚體的復(fù)數(shù)形式。處于QNW的PBGS不容易在四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型之間平衡的事實(shí)使得對(duì)分開的二聚體的穩(wěn)定寡聚體的觀察和表征成為可能。因此，人PBGS的F12L突變?cè)试S我們研究六聚體的穩(wěn)定形式并建立了正是其六聚體的性質(zhì)(而不是特定的F12L突變)決定了F12L相對(duì)于野生型人PBGS的強(qiáng)烈差異的功能性質(zhì)。F12L是人PBGS天然產(chǎn)生的罕見等位基因(3-5)。下面描述的是對(duì)人PBGS的研究(在E.coli中異源表達(dá)的野生型和F12L0并通過(guò)常規(guī)技術(shù)純化)。
蛋白表達(dá)親本人PBGS是充分表征的N59/C162A(6)。N59對(duì)應(yīng)于編碼PBGS蛋白的兩個(gè)共顯性等位基因中更可溶的那個(gè)。C162A是消除緩慢形成異常二硫鍵的可能性的良性突變。N59/C162A的人造基因以下稱作Wt。用于Wt QuikChange突變?yōu)镕12L變體的有義鏈引物是GGCTACCTCCACCCACTGCTTCGGGCC。數(shù)個(gè)構(gòu)建體為在E.coli中共表達(dá)Wt和F12L而制備?；虻捻樞蚝蛦?dòng)子的數(shù)目都是不同的，但這些變異不影響結(jié)果。描述了含有一個(gè)啟動(dòng)子控制下的Wt和F12L的構(gòu)建體。含有Wt的質(zhì)粒DNA(pET3aWt)用BamHI和NdeI消化以切割出Wt。pET17b載體DNA通過(guò)用BamHI和NdeI消化而線性化，并與Wt連接，從而Wt的ATG起始密碼子位于由載體編碼的核糖體結(jié)合位點(diǎn)下游6個(gè)堿基對(duì)處。得到的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到E.coli XL1blue中。制備質(zhì)粒DNA(pET17bWt)并用SpeI和Bpu1102I線性化。含有基因F12L的質(zhì)粒DNA(pET3aF12L)用XbaI和Bpu1102I消化以產(chǎn)生含有F12L的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和基因的片段。F12L基因和線性化的pET17Wt載體被連接使得F12L基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于Wt的終止密碼子下游35個(gè)堿基對(duì)，終止子位于F12L基因終止密碼子下游52堿基對(duì)。質(zhì)粒pET17bWtF12L被轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli XL1blue，制備質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BLR(DE3)以表達(dá)蛋白，如前所述(6)。
蛋白純化蛋白純化方法(細(xì)胞破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀、苯基-Sepharose疏水層析、離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠過(guò)濾層析)的大部遵循前述(6)的方法，除了使用70ml Q-Sepharose柱代替用于陰離子交換步驟的DEAE瓊脂糖柱。Q-Sepharose在室溫下使用30mM磷酸鉀，pH 7.0，10mM 2-巰基乙醇，10μM Zn(II)，并采用如圖3A所示的KCl梯度進(jìn)行。梯度以流速為3ml min-1由Rainin HPLC系統(tǒng)控制并收集10ml級(jí)分。
PBGS變體的動(dòng)力學(xué)特征被用于顯示wt和f12L具有不同的功能特征在0.1M bis-tris丙烷，10mM 2-巰基乙醇，10μM Zn中進(jìn)行所有的動(dòng)力學(xué)測(cè)定。對(duì)于pH變化圖(rate profile)而言，在添加10mMALA-HCl后報(bào)告的pH反映分析pH。對(duì)Km和Vmax測(cè)定而言，ALA的濃度是10μM，30μM，100μM，300μM，1mM，3mM，和10mM，并且各重復(fù)兩次。ALA-HCl濃度的變化不導(dǎo)致最終pH的變化，因?yàn)樵谔砑雍愣w積到分析混合物中之前，0.1M ALA-HCl儲(chǔ)液被稀釋到0.1M HCl中。所有的分析在37℃一段固定的時(shí)間，使用Ehrlich氏試劑測(cè)定形成的膽色素原。
分析超離心蛋白樣品僅在上樣至超離心之前對(duì)30mM磷酸鉀，pH 7.5，0.1mMDTT，和10μM ZnCl2透析。上樣濃度對(duì)野生型和F12L突變酶分別為10.6μM和12.8μM。在4℃使用配備有An60Ti轉(zhuǎn)子的Beckman OptimaXL-A分析超離心機(jī)并使用6通道，12-mm路徑，填充活性炭的Epon中心件以石英窗進(jìn)行全部沉降平衡實(shí)驗(yàn)。在三個(gè)轉(zhuǎn)子速度(8,000，11,000，和14,000rpm)收集數(shù)據(jù)并使用0.001cm掃描步長(zhǎng)顯示平均20個(gè)掃描。使用Sednterp程序(32)計(jì)算溫度校正的偏微比體積(partialspecific volume)和溶液密度；溶液濃度為1.00191gm/mL，野生型和突變蛋白的偏微比體積分別為0.7394和0.7397mL/gm。使用來(lái)自康涅狄格大學(xué)(University of Connecticut)(Storrs，CT)的分析超離心設(shè)施的HID程序分析數(shù)據(jù)。從擬合(fits)排除了單個(gè)物種作為殘數(shù)的數(shù)據(jù)模擬分析明顯是非隨機(jī)的。
F12晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定F12L對(duì)50mM bis-tris丙烷，10mM βME，和10μμM ZnCl2透析。使用沉滴(sitting drop)方法形成晶體等體積F12L(4.0mg ml-1)與沉淀劑(0.4M磷酸二氫銨)混合。向蛋白亞基濃縮液添加等摩爾ALA，在3-5天內(nèi)形成晶體。在連接有裝配了OSMIC光學(xué)件和在50kV及100ma下工作的RU-200轉(zhuǎn)動(dòng)陽(yáng)極發(fā)生器的MAR345成像板檢測(cè)器上以100K收集衍射數(shù)據(jù)。在冷凍之前通過(guò)將晶體轉(zhuǎn)移到在各溶液中含有12％，17％，23％和30％甘油的儲(chǔ)液中3分鐘而冷凍保護(hù)該晶體。收集的一些數(shù)據(jù)顯示高度無(wú)序并且在活性區(qū)域之間缺少任何配體。由于上述因素，F(xiàn)12L的晶體被浸泡在2mM ALA(其被添加到頭兩個(gè)冷凍保護(hù)溶液中)以及0.2mM ZnCl2(除了ALA外其也被添加到后兩個(gè)溶液中)。最終數(shù)據(jù)集合由對(duì)應(yīng)于0.5°振動(dòng)的525個(gè)框組成，每框暴露時(shí)間3.5分鐘。晶體屬于六邊形系統(tǒng)，空間組P63，單元晶胞參數(shù)a＝b＝89.6，c＝153.2。在非對(duì)稱單元中有兩種分子。衍射數(shù)據(jù)用程序包HKL2000，Rmerge(I)＝5.0％對(duì)33,615個(gè)反射在45-2.2分辨率范圍簡(jiǎn)化。
通過(guò)AmoRe程序包以人PBGS結(jié)構(gòu)的分子A(pdb編碼1E51)作為起始模型進(jìn)行分子置換而確定結(jié)構(gòu)。用CNS程序進(jìn)行改進(jìn)。最終模型包括F12L-分子A(殘基11-82，97-124，140-169，172-212，222-330)和B(殘基3-82，97-122，140-169，172-212，226-328)的一個(gè)二聚體，結(jié)合在分子A活性位點(diǎn)的催化反應(yīng)中間產(chǎn)物的一個(gè)分子，241個(gè)水分子和看起來(lái)具有低軌道占據(jù)的兩個(gè)鋅原子。對(duì)于2.2分辨變化數(shù)據(jù)而言，晶體成像的R-因子是19.9％，R(free)是28.6％，而鍵長(zhǎng)和鍵角的RMS偏離分別為0.18和2.0°。所有的殘基屬于Ramachandran圖上允許的構(gòu)型區(qū)域。
人PBGS變體F12L的性質(zhì)人PBGS變體F12L與野生型蛋白顯著不同。純化的F12L的特征證實(shí)在野生型人PBGS活性最高的條件下，其催化活性很低。然而，F(xiàn)12L顯示明顯改變的pH變化圖并顯示在堿性pH值時(shí)相當(dāng)高的活性(圖1A)。在野生型蛋白的最適值pH 7和F12L的最適值pH 9測(cè)定F12L和野生型人PBGS的Km和Vmax值；結(jié)果顯示于表1(下文)。F12L顯示正常的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)和異常高的Km值，遠(yuǎn)高于底物5-氨基酮戊酸(ALA)的生理濃度。然而，在pH 9時(shí)F12L的Vmax顯著高于野生型蛋白的Vmax。在最適pH和存在金屬離子的最適構(gòu)型的條件下，所有特征已知物種的野生型PBGS被報(bào)道其Km值在100μM(6，8-10)范圍內(nèi)，正如此處在pH 7下所見野生型人PBGS的值。野生型人PBGS在pH 9的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)沒(méi)有顯示標(biāo)準(zhǔn)的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)，其基礎(chǔ)在一開始并不明顯。根據(jù)粗略檢查，野生型蛋白看起來(lái)顯示以Hill系數(shù)0.35量級(jí)表現(xiàn)出極端的負(fù)協(xié)同性。事實(shí)上，對(duì)該數(shù)據(jù)的最佳擬合是雙雙曲線等式，其后來(lái)被認(rèn)為來(lái)自于四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型(morpheins，八聚體和六聚體)混合物的催化作用，其中兩種形式具有不同的Km值。該現(xiàn)象在下文中更詳細(xì)進(jìn)行描述。
F12L變體和野生型蛋白之間顯著差異的進(jìn)一步證據(jù)來(lái)自陰離子交換層析(圖1B)和非變性凝膠電泳(圖1C)運(yùn)動(dòng)性的變化，兩者都暗示寡聚體結(jié)構(gòu)的差異。在陰離子交換柱上的分離通常反映出不同的表面電荷，其不可能是由于中性亮氨酸被中性苯丙氨酸的替換。兩個(gè)具有相同荷/質(zhì)比的種類的電泳分離顯示或是大小不同或是形狀不同。總的來(lái)說(shuō)，這些差異顯示F12L和野生型人PBGS以不同的寡聚化狀態(tài)存在。
野生型和突變的蛋白使用分析超離心進(jìn)行沉淀平衡分析，野生型蛋白和F12L的分子量被發(fā)現(xiàn)分別為244,000±8,900和197,900±6,500道爾頓。前者是預(yù)期八聚體和六聚體的中途，而后者是預(yù)期六聚體和四聚體的中途。在數(shù)據(jù)的模型分析中，野生型蛋白分別以7.6％，51％，和42％最佳擬合到二聚體、六聚體和八聚體三個(gè)狀態(tài)的模型，而F12L以70％到30％的比率最佳擬合到四聚體和六聚體的兩個(gè)狀態(tài)的模型，而沒(méi)有八聚體。因此，本發(fā)明人測(cè)定了人PBGS變體F12L的晶體結(jié)構(gòu)。
人PBGS和F12L變體的晶體結(jié)構(gòu)顯示單體結(jié)構(gòu)的顯著差異，這決定新的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型并揭示了MORPHEINS的第一個(gè)例子17個(gè)以前測(cè)定的來(lái)自真菌、后生動(dòng)物和細(xì)菌的PBGS(11-20)的晶體結(jié)構(gòu)顯示共有的同型八聚體結(jié)構(gòu)，其中四個(gè)二聚體通過(guò)圍繞中央軸90°旋轉(zhuǎn)而相關(guān)(圖2A)。PBGS是TIM α/β桶狀蛋白(21)醛縮酶超家族的成員。在各亞基中催化核心完全位于桶內(nèi)，并且20+氨基酸N末端臂涉及廣泛的亞基相互作用。催化核心的序列是系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上保守的，但是N末端臂不保守。八聚體中所見的PBGS二聚體(圖2A，頂部)包括高度保守的桶對(duì)桶接觸并且一個(gè)亞基的N末端臂擁抱姐妹亞基的桶。因此，這被稱為擁抱二聚體(hugging dimer)(2)。氨基酸12的側(cè)鏈不參與擁抱相互作用。四聚體的集合，其通過(guò)加入繞中央軸(圖2A，中間)旋轉(zhuǎn)90°的第二個(gè)擁抱二聚體，而添加一個(gè)亞基的臂和相鄰二聚體的α/β桶底部之間的彼此相互作用。氨基酸12的側(cè)鏈參與該亞基相互作用。再添加兩個(gè)各自繞中央軸旋轉(zhuǎn)90°的二聚體產(chǎn)生八聚體(圖2A，底部)。該八聚體，相對(duì)于二聚體和四聚體的視圖朝向讀者旋轉(zhuǎn)90°，產(chǎn)生風(fēng)車的表示。在確定F12L的晶體結(jié)構(gòu)之前，假設(shè)所有的PBGS蛋白擁有相同的同型八聚體結(jié)構(gòu)(2)。然而，對(duì)于來(lái)自綠色植物和一些細(xì)菌的PBGS，動(dòng)力學(xué)證據(jù)暗示活性最大的八聚體可以解離成小的、活性較低的結(jié)構(gòu)單元(9，22)。該動(dòng)力學(xué)證據(jù)是如圖X中豌豆PBGS所示對(duì)比活性的蛋白濃度依賴性。
引人注目的是，F(xiàn)12L人PBGS等位基因新測(cè)定的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1PV8)顯示了包含N末端臂相對(duì)于α/β桶顯著重排的四級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2B)。在這種情況下，二聚體保留上述的桶對(duì)桶接觸但是N末端臂是分開的而不是擁抱的(圖2B，頂部)。四聚體的集合保留上述一個(gè)亞基的臂和相鄰二聚體的α/β桶底部的彼此相互作用。然而，由于臂是突出來(lái)的，該連接規(guī)定了繞中央軸120°旋轉(zhuǎn)。因此，在寡聚體結(jié)構(gòu)中有三個(gè)分開的二聚體，各自繞中央軸旋轉(zhuǎn)120°形成六聚體(圖2B，底部，以風(fēng)車表示觀察)。從觀察到的野生型人PBGS八聚體向觀察到的F12L的六聚體的空前的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是個(gè)極好的例子，說(shuō)明了小的突變?nèi)绾螌?duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有深刻的影響，以及表明這兩種四級(jí)結(jié)構(gòu)形式在能量上是多么接近。通過(guò)觀察這些結(jié)合還可以清楚在八聚體和六聚體之間的任何平衡必須通過(guò)擁抱二聚體和分離二聚體之間的相互轉(zhuǎn)換進(jìn)行。這種相互轉(zhuǎn)換過(guò)程顯示于圖5A。
F12L的新結(jié)構(gòu)(2.2分辨率)包含顯著的無(wú)序區(qū)域，其使得相對(duì)于前述野生型人PBGS結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1E51，2.83分辨率)的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)比較無(wú)法進(jìn)行。氨基酸12不直接與任一結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn)殘基相互作用。此外，對(duì)在兩個(gè)結(jié)構(gòu)中都觀察到的那些氨基酸而言，大多數(shù)是可重疊的。因此，為進(jìn)一步探測(cè)F12L不同尋常的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)(如，圖1，表1)，本發(fā)明人共表達(dá)了F12L和野生型人PBGS。
野生型人PBGS和F12L的共表達(dá)揭示四級(jí)結(jié)構(gòu)是動(dòng)力學(xué)差異的基礎(chǔ)制備共表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)以從相同的RNA信使產(chǎn)生1∶1的野生型人PBGS和F12L變體。共表達(dá)的蛋白WT+F12L的純化被發(fā)現(xiàn)在陰離子交換層析中產(chǎn)生兩個(gè)不同的PBGS蛋白峰(圖3A)。首先洗脫的峰(池I)與F12L在非變性凝膠上泳動(dòng)相當(dāng)，而第二個(gè)峰(池II)與野生型人PBGS泳動(dòng)相當(dāng)(圖3B)。池I顯示在pH 9活性增強(qiáng)以及池II顯示在pH 7活性增強(qiáng)(圖3C)。兩個(gè)池在胰蛋白酶消化后分別進(jìn)行質(zhì)譜分析并且各自被發(fā)現(xiàn)含有顯著量的N-末端2010.2道爾頓含Phe的肽和1976.2道爾頓含Leu的肽，證實(shí)了兩個(gè)池含有雜聚體種類。雜聚體池中各鏈的百分比通過(guò)N末端測(cè)序來(lái)定量，顯示池I含有48.5％Phe和51.5％Leu而池II含有71.1％Phe和28.3％Leu。這些比率沒(méi)有明顯顯示是什么主宰了雜聚體種類的四級(jí)結(jié)構(gòu)。池I和II通過(guò)在Sephacryl S300凝膠過(guò)濾而進(jìn)一步純化，這減少了雜聚體的交叉污染。S300純化的池I和II的pH變化圖分別與F12L和野生型人PBGS顯著類似(圖3C)。根據(jù)層析、質(zhì)譜和定量N末端測(cè)序數(shù)據(jù)，我們總結(jié)池I包括雜六聚體而池II包括雜八聚體。pH變化圖被發(fā)現(xiàn)更多由四級(jí)結(jié)構(gòu)控制而不是處于第12位的氨基酸組成來(lái)控制。
在pH 7和pH 9測(cè)定S300純化的池的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax(表2)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)不遵循簡(jiǎn)單的Michaelis-Menten關(guān)系(雙曲線擬合)，但是可以歸結(jié)于由具有不同的Km和Vmax值的兩種不同形式的酶的催化(雙雙曲線擬合)(23)。圖3D顯示作為底物濃度函數(shù)的活性；動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)均勻擬合模型，其中酶的六聚體和八聚體形式分別顯示高和低Km值。這個(gè)雙雙曲線擬合(深色線)遠(yuǎn)優(yōu)于單雙曲線擬合(淺色線)。所有的動(dòng)力學(xué)值都被精確測(cè)定，例外的是在pH 9檢測(cè)到池I存在痕量八聚體(參見表2)。pH 9時(shí)野生型人PBGS的數(shù)據(jù)也以比八聚體-六聚體模型更好的擬合被提供，該溶液也包括在表2。在分析條件下控制人PBGS雜聚體(heteromer)平衡的因素還有待闡明。
表2野生型人PBGS，F(xiàn)12L，和雜聚體Wt/F12L池的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
池I和池II是如圖3A所示，從Q-Sepharose柱洗脫后進(jìn)一步在Sephacryl S-300柱上純化的PBGS活性的兩個(gè)池。Km1和Km2(都是mM)被分別解釋為八聚體和六聚體的Km。報(bào)道的Vmax值(單位μmolesh-1mg-1)反映在分析條件下四級(jí)結(jié)構(gòu)種類有待測(cè)定的摩爾分?jǐn)?shù)。擬合的Km值對(duì)四級(jí)結(jié)構(gòu)種類的分配是獨(dú)立的。
野生型人PBGS，F(xiàn)12L變體，和WT+F12L異聚體呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)正式建立了野生型蛋白和F12L變體之間的動(dòng)力學(xué)差異主要由于四級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。對(duì)其他選擇人PBGS突變體(R240A，T23P，和T23P/F12L)的進(jìn)一步工作證實(shí)六聚體的動(dòng)力學(xué)類似于F12L的動(dòng)力學(xué)而八聚體的動(dòng)力學(xué)類似于野生型蛋白的動(dòng)力學(xué)。
基于八聚體對(duì)六聚體的人PBGS結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，可以構(gòu)思在對(duì)這兩種形式PBGS的最適pH下的顯著差異的假說(shuō)。PBGS催化的反應(yīng)的化學(xué)性質(zhì)需要形成至少兩個(gè)Schiff堿中間產(chǎn)物(2，12，16，17，20)。這些Schiff堿的甲醇胺(carbinolamine)前體的形成要求參與的氨基是不帶電荷的，或者局部pH高于氨基的pKa。六聚體和八聚體PBGS間的一個(gè)顯著結(jié)構(gòu)差異是在包括活性位點(diǎn)蓋子(lid)的氨基酸中發(fā)現(xiàn)的有序程度。六聚體PBGS F12L晶體結(jié)構(gòu)缺少構(gòu)成活性位點(diǎn)蓋子的大多數(shù)殘基的致密性，從而提示六聚體結(jié)構(gòu)使關(guān)閉的蓋子構(gòu)型去穩(wěn)定。在缺少關(guān)閉的蓋子的情況下從本體溶劑分離活性位點(diǎn)，PBGS催化的反應(yīng)不能進(jìn)行，直到外部pH高于參與形成Schiff堿的氨基的pKa。因此，六聚體結(jié)構(gòu)被認(rèn)為只有當(dāng)外部pH足夠堿性以便于形成Schiff堿時(shí)才顯示活性。高Km也可以歸結(jié)于活性位點(diǎn)蓋子的去穩(wěn)定，因?yàn)镻BGS八聚體的晶體結(jié)構(gòu)顯示在蓋子的殘基和決定Km值的底物分子之間的穩(wěn)定性相互作用。目前的結(jié)果提供理解調(diào)控PBGS功能的新的途徑。如下文所述，從鑒定PBGS六聚體獲得的知識(shí)對(duì)重新考慮非人種類PBGS活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)有著相當(dāng)重要的意義。
PBGS的變構(gòu)調(diào)節(jié)可以歸結(jié)于八聚體到六聚體的平衡PBGS八聚體和六聚體的比較揭示了PBGS變構(gòu)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。盡管事實(shí)上PBGS活性位點(diǎn)的明顯組分包含在單體中，大多數(shù)PBGS蛋白含有變構(gòu)的鎂的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于擁抱二聚體的臂對(duì)桶界面處(14，24)。變構(gòu)的鎂的位置在銅綠假單胞菌(14)和E.coli PBGS(16)的晶體結(jié)構(gòu)中都可見，圖4A后者顯示。圖4A顯示具有黑球所示的變構(gòu)的鎂的擁抱二聚體(淺色帶，深色鏈)，其中之一以大的黑白(white-on-black)箭頭顯示。酵母和人PBGS的結(jié)構(gòu)顯示，精氨酸的胍基位于變構(gòu)的鎂處，如前所述(2)。這是人PBGS的Arg240。如果假設(shè)所有的PBGS可以在合適的條件下以六聚體存在，那么變構(gòu)的鎂的位置與六聚體-八聚體轉(zhuǎn)換有關(guān)，因?yàn)樵摻饘俳Y(jié)合位點(diǎn)存在于八聚體(由擁抱二聚體構(gòu)成)而不存在于六聚體(由分離二聚體構(gòu)成)。圖4B顯示PBGS八聚體中的三個(gè)亞基對(duì)亞基之間的界面。黑白箭頭顯示桶對(duì)桶的界面，其是八聚體和六聚體PBGS集合所共有的。帶黑點(diǎn)(dot on black)的箭頭顯示臂對(duì)桶底的相互作用，其也是八聚體和六聚體PBGS集合所共有的。黑白箭頭，其類似于變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)，顯示存在于八聚體(擁抱二聚體)而不存在于六聚體(分離二聚體)的臂對(duì)桶相互作用。與變構(gòu)的鎂介導(dǎo)六聚體-八聚體平衡的觀點(diǎn)一致的是鎂對(duì)E.coli PBGS動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。在這種情況下，添加變構(gòu)的鎂導(dǎo)致Km值從～2mM降低到～200Mm(8)，這明顯提示六聚體和八聚體形式的人PBGS的Km值之間的差異(表1)。還值得注意的是我們之前的觀察，即均一的純E.coli PBGS在非變性凝膠電泳中顯示多個(gè)條帶，這些條帶的泳動(dòng)性與八聚體、六聚體和二聚體的分子大小一致，而添加鎂有利于形成最大的(八聚體)形式(8)。還值得注意的是最近發(fā)現(xiàn)人PBGS變體R240A純化～80％為六聚體和20％為八聚體，而后一寡聚體是不穩(wěn)定的并隨著時(shí)間重排為六聚體。
對(duì)蛋白濃度依賴的比活性的觀察是存在MORPHEINS的平衡的最直接的診斷工具PBGS在六聚體和八聚體之間的相互轉(zhuǎn)換被建議作為負(fù)責(zé)一些物種PBGS的蛋白濃度依賴的比活性的機(jī)制。迄今為止，我們已表征了含有變構(gòu)的鎂的四種不同的PBGS。所述酶來(lái)自物種大腸桿菌(γ-proteobacter)，日本慢生根瘤菌(α-proteobacter)，銅綠假單胞菌(γ-proteobacter)，和豌豆(Pisum sativum)(綠色植物)。后三種不同于人PBGS之處在于它們不使用活性位點(diǎn)催化的鋅(24)以及它們還共有不尋常的蛋白濃度依賴的比活性性質(zhì)(9，22，25)。后一性質(zhì)表明最大活性的寡聚體可以解離為較低活性或無(wú)活的較小形式。出版的數(shù)學(xué)模型已經(jīng)考慮最大活性的八聚體解離成較低活性或無(wú)活的四聚體和/或二聚體(9，22)。
人PBGS變體F12L的六聚體結(jié)構(gòu)使我們建議植物和某些細(xì)菌PBGS的蛋白濃度依賴性是由于較低活性六聚體形式和較高活性八聚體形式之間的平衡，如圖5A所示。這樣的平衡的存在得到豌豆PBGS沉降平衡研究的支持(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。由于鎂對(duì)擁抱二聚體和替代的分離二聚體之間的差異是必不可少的，該離子被建議有利于擁抱二聚體的形成，并且從而有利于形成八聚體。圖5B示例從豌豆PBGS除去鎂離子不利于最大形式而有利于較小的形式，其中兩種形式的泳動(dòng)性與八聚體和六聚體的一致。在該模型中，六聚體是PBGS蛋白潛在的儲(chǔ)存形式，因?yàn)槠湓谏韕H下活性較低，并且特征在于Km值，該值遠(yuǎn)高于ALA的生理濃度。與之對(duì)比，八聚體在生理pH是活性的并且其Km值在活性四吡咯生物合成過(guò)程中處于合適的ALA濃度范圍內(nèi)。
總之，這些研究支持的觀點(diǎn)是PBGS在葉綠素生物合成的復(fù)雜調(diào)控中起作用(26-28)。我們注意到有記錄表明在植物變綠的過(guò)程中發(fā)生葉綠體中鎂濃度急劇增加(29)?？梢韵胂鬅o(wú)活性的六聚體儲(chǔ)存形式允許PBGS的快速活化作為伴隨變綠過(guò)程中生物化學(xué)改變的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的部分。有趣的是注意到對(duì)植物和藻類PBGS四級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)個(gè)凝膠過(guò)濾研究總結(jié)寡聚體是六聚體(30和其中引用的文獻(xiàn))。支持存在通過(guò)陰離子交換層析可分離的可相互轉(zhuǎn)換的PBGS四級(jí)形式的文獻(xiàn)可以在早先對(duì)來(lái)自普通小球藻(Chlorella regularis)PBGS的報(bào)道(31)中找到。
六聚體人PBGS顯示變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白功能新的結(jié)構(gòu)范例并且是作為MORPHEINS存在的蛋白的第一個(gè)例子對(duì)人PBGS變體F12L的表征揭示點(diǎn)突變導(dǎo)致PBGS結(jié)構(gòu)和功能的巨大改變。該突變可以作為導(dǎo)致進(jìn)化中蛋白行為顯著改變的單個(gè)氨基酸改變的先例。F12L突變使PBGS八聚體去穩(wěn)定并導(dǎo)致形成六聚體。八聚體和六聚體之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換必須通過(guò)含有不同的二聚體結(jié)構(gòu)的沒(méi)有先例的平衡來(lái)進(jìn)行。出現(xiàn)在大多數(shù)PBGS的變構(gòu)的鎂在八聚體中有結(jié)合位點(diǎn)，而在六聚體中沒(méi)有。非變性凝膠數(shù)據(jù)表明除去變構(gòu)的鎂有利于形成六聚體，而不是八聚體。八聚體-六聚體轉(zhuǎn)換定義了金屬離子依賴性變構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白功能的新機(jī)制。
本發(fā)明描述了通過(guò)穩(wěn)定PBGS的無(wú)活性morphein和/或其他可以通過(guò)morphein的相互轉(zhuǎn)換而調(diào)控的蛋白而抑制蛋白功能。為譯解選擇性地結(jié)合到并穩(wěn)定PBGS的六聚體形式的分子，發(fā)明人采取如下方法。只有在QSE的那些PBGS目前被考慮作為靶，因?yàn)檫@些PBGS已經(jīng)顯示作為八聚體具有活性，但它們顯示蛋白濃度依賴的比活性現(xiàn)象。靶分子是一種選擇性結(jié)合到如圖10中的球所示的六聚體的“腋窩”的分子。發(fā)明人采用“計(jì)算機(jī)(in silico)”方法檢索分子庫(kù)尋找結(jié)合到靶生物PBGS六聚體形式的分子。
為靶六聚體PBGS建立同源性模型發(fā)明人所依據(jù)的建立靶六聚體PBGS模型的唯一存在的晶體結(jié)構(gòu)是人PBGS臨床變體F12L，PDB編號(hào)1PV8(Breinig等(2003)Nat.Struct.Biol 10，757-763)。不幸的是，F(xiàn)12L的晶體結(jié)構(gòu)顯示顯著的無(wú)序性，限制了其用作建立同源性模型的唯一基礎(chǔ)。然而，對(duì)人PBGS八聚體和六聚體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)1E51和1PV8)的比較顯示包括TIM樣α，β桶結(jié)構(gòu)域的～300氨基酸幾乎一致。對(duì)于人PBGS，八聚體和六聚體的差異在于24個(gè)氨基末端氨基酸的結(jié)構(gòu)和在六聚體中更無(wú)序的不同區(qū)域(參見Breinig等)。因此，可以使用更高質(zhì)量的PBGS八聚體晶體結(jié)構(gòu)來(lái)建立靶PBGS的α，β桶結(jié)構(gòu)域的同源性模型。選擇的結(jié)構(gòu)是PDB編號(hào)1GZG(Frere，F(xiàn).，Schubert，W.D.，Stauffer，F(xiàn).，F(xiàn)rankenberg，N.，Neier，R.，Jahn，D.，和Heinz，D.W.(2002)J Mol Biol 320，237-247)參考文獻(xiàn)(20)，其是銅綠假單胞菌PBGS高度有序的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，本身是“捕獲”PBGS六聚體的抑制劑的靶。使用不同容量的Swiss-PDB閱讀器(www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html)和其他程序建立銅綠假單胞菌PBGS的六聚體形式。為建立銅綠假單胞菌PBGS六聚體，從1GZG二聚體的結(jié)構(gòu)文件中除去N-末端臂。得到的α，β桶結(jié)構(gòu)域(殘基32-335)被連續(xù)地重疊在1PV8六聚體的三個(gè)二聚體上以產(chǎn)生銅綠假單胞菌PBGSα，β桶的六聚體集合。在人和銅綠假單胞菌的PBGS的N末端臂沒(méi)有顯著的序列同一性，但是在N末端臂結(jié)構(gòu)中有保守的α螺旋。因此，人PBGS和銅綠假單胞菌PBGS的八聚體形式的結(jié)構(gòu)比對(duì)被用來(lái)確定該α螺旋區(qū)段的合適的序列比對(duì)。這個(gè)信息被用于確定銅綠假單胞菌PBGS的第22-29位氨基酸在六聚體中的空間位置。程序Loopy(Xiang，Z.，Soto，C.S.，和Honig，B.(2002)Proc Natl Acad Sci U SA 99，7432-7437)被用于建立第29-32位氨基酸的模型，從而將N末端α螺旋與各亞基的α，β桶結(jié)構(gòu)域連接。最后，剩余的N-末端氨基酸，其顯示于1PV8文件中，通過(guò)使用人六聚體PBGS的對(duì)應(yīng)氨基酸的φ，，和ω角信息建立到銅綠假單胞菌PBGS結(jié)構(gòu)上。由于人PBGS六聚體(1PV8)的一些N末端的無(wú)序性，銅綠假單胞菌PBGS的六聚體模型缺少亞基A、C和E的第1-9位殘基和B、D和F的第1-11位殘基。六聚體銅綠假單胞菌PBGS是用我們之前已經(jīng)使用的公開的現(xiàn)成方法(Kundrat，L.，Martins，J.，Stith，L.，Dunbrack，R.L.，Jr.，and Jaffe，E.K.(2003)J Biol Chem 278，31325-31330)建立六聚體豌豆PBGS模型的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。
在尋找優(yōu)先結(jié)合到六聚體PBGS的分子時(shí)，有如下的發(fā)現(xiàn)。對(duì)六聚體PBGS的分析顯示假定的“抑制劑”結(jié)合位點(diǎn)(也稱為腋窩)含有三個(gè)亞基A、B、和E的元件。亞基A和B包括已經(jīng)定義的“分離的二聚體”，此處我們通常描述底部亞基(亞基A，圖15)使得讀者直接看到位于α，β-桶中央的活性位點(diǎn)。亞基B與亞基A共享桶對(duì)桶界面。亞基E與亞基B彼此相互作用，其中一個(gè)亞基的N末端臂套入另一個(gè)亞基α，β-桶的底部。圖15顯示已對(duì)接(docked)的抑制劑-下文描述的迷迭香酸。在這個(gè)對(duì)接結(jié)果中，迷迭香酸與圖中顯示的三個(gè)亞基都有直接的相互作用。
使用多種“小分子”分子庫(kù)，其已經(jīng)被我們的合作者GeorgeMarkham收集起來(lái)，而對(duì)接方法使用商業(yè)對(duì)接程序Glide試圖發(fā)現(xiàn)捕獲六聚體形式的PBGS的分子。假設(shè)自然的力量已經(jīng)使用morphein捕獲方法，初始庫(kù)篩選集中于代謝物和天然產(chǎn)物。至今，在～1,000,000個(gè)分子的分子庫(kù)中，～30,000已經(jīng)被篩選為能結(jié)合到豌豆PBGS的六聚體模型的“腋窩”的分子。至今，最好的結(jié)果來(lái)自天然產(chǎn)物迷迭香酸。
來(lái)自迷迭香酸的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)迷迭香酸(苯丙酸，□-[[(2E)-3-(3，4-二羥基苯基)-1-氧-2-丙烯基]氧]-3，4-二羥基-，(□R)-(9CI))的抑制數(shù)據(jù)與緩慢緊密結(jié)合抑制模型一致，其中迷迭香酸優(yōu)先結(jié)合到小于八聚體的豌豆PBGS四級(jí)結(jié)構(gòu)形式。圖16A，空心圖標(biāo)，顯示豌豆PBGS蛋白濃度依賴的比活性，其在3.5μg/mlPBGS時(shí)顯示半最大活性。這表明在分析條件下降3.5μg/ml處，四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型(morpheins)的平衡含有大約50％八聚體和大約50％較小的活性較低的同工型(如，六聚體)。如果抑制劑通過(guò)優(yōu)先結(jié)合到這些較小的形式而起作用，可以預(yù)期在morphein平衡含有這些較小形式的條件下有更完全的抑制。換句話說(shuō)，將預(yù)期抑制劑使蛋白濃度依賴性移動(dòng)到更高的蛋白濃度，這在圖16A中顯示為迷迭香酸(參見下文)。圖16B和16C顯示用于測(cè)定如何最佳證實(shí)蛋白濃度依賴性的移動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。圖16B顯示豌豆PBGS的劑量反應(yīng)曲線，其表明當(dāng)在添加底物前使迷迭香酸作用于蛋白30分鐘時(shí)，該抑制劑的IC50是～63μM。未顯示抑制對(duì)預(yù)孵育時(shí)間的依賴性，其中通過(guò)任一濃度的迷迭香酸的抑制隨著預(yù)孵育時(shí)間的增加而提高，顯示迷迭香酸作為緩慢結(jié)合抑制劑而起作用。圖16C顯示一旦抑制已經(jīng)發(fā)生，則蛋白在30分鐘分析時(shí)間內(nèi)不會(huì)恢復(fù)。圖16A，16B，和16C獲得的數(shù)據(jù)被用于選擇為顯示迷迭香酸對(duì)豌豆PBGS蛋白濃度依賴性所必須的合適條件，如下所示。圖16A的實(shí)心圈顯示在用30μM迷迭香酸處理30分鐘后豌豆PBGS比活性的蛋白濃度依賴性，在13.5μg/ml PBGS得到半最大活性。因此，在用迷迭香酸處理后，四級(jí)結(jié)構(gòu)形式的平衡從3.5μM移動(dòng)到13.5μM；在這些條件下，需要13.5μg/ml PBGS以獲得具有50％八聚體的平衡。這與如圖10中的球所示的迷迭香酸穩(wěn)定較小的較低活性形式的PBGS的解釋一致。圖17以非變性凝膠電泳數(shù)據(jù)支持該結(jié)論。第2道顯示豌豆PBGS將分離成至少兩個(gè)四級(jí)結(jié)構(gòu)形式。在凝膠上的泳動(dòng)性與作為八聚體和六聚體平衡的豌豆PBGS一致(還參見圖5B)。第1和3泳道顯示在用迷迭香酸處理后平衡移動(dòng)至較小的形式。第1泳道顯示250μM迷迭香酸對(duì)142μg/ml豌豆PBGS處理30分鐘的效果，第3泳道顯示添加10mM底物對(duì)該四級(jí)結(jié)構(gòu)平衡的效果。
根據(jù)我們的建模結(jié)果，該聯(lián)苯化合物與豌豆PBGS六聚體的“腋窩”的相互作用主要通過(guò)蛋白亞基A，B和E與迷迭香酸的極性基團(tuán)之間的氫鍵來(lái)完成。該蛋白含有迷迭香酸4.0埃范圍內(nèi)另外的氫鍵合電勢(shì)。因此，可以通過(guò)對(duì)迷迭香酸分子添加另外的氫鍵合電勢(shì)而制備具有改進(jìn)的結(jié)合性能的迷迭香酸衍生物。例如，可以在任一苯基的5位添加羥基以提高對(duì)蛋白的氫鍵合。與蛋白的另外的疏水作用可以通過(guò)取代該分子丙酸部分2位的苯基或芐基而獲得。
盡管本發(fā)明參考其具體實(shí)施例已經(jīng)詳細(xì)地進(jìn)行了描述，很明顯的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍而對(duì)其進(jìn)行各種改變和修飾。
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序列表<110>福克斯蔡斯癌癥中心(Fox Chase Cancer Center)<120>六聚體膽色素原合成酶作為開發(fā)抗生素和除草劑的靶(Hexameric Porphobilinogen Synthase as a Target for the Developmentof Antibiotics and Herbicides)<130>SCT060059-47<140>Not Yet Assigned<141>2004-07-07<150>60/485,253<151>2003-07-07<150>60/577,312<151>2004-06-04<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3142<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cttacgcggt ctgtgggaga ccggagcggg agacagcggt gacaggagca gcggccggga 60gcccttaggg aggcagacag agcctgcagc caatgcccca ggagccctcg gttccaacca120actgatgccc ctgtgcccac tggcccacgc catgcagccc cagtccgttc tgcacagcgg180ctacttccac ccactacttc gggcctggca gacagccacc accaccctca atgcctccaa240cctcatctac cccatctttg tcacggatgt tcctgatgac atacagccta tcaccagcct300cccaggagtg gccaggtatg gtgtgaagcg gctggaagag atgctgaggc ccttggtgga360agagggccta cgctgtgtct tgatctttgg cgtccccagc agagttccca aggacgagcg420gggttccgca gctgactccg aggagtcccc agctattgag gcaatccatc tgttgaggaa480gaccttcccc aacctcctgg tggcctgtga tgtctgcctg tgtccctaca cctcccatgg540tcactgcggg ctcctgagtg aaaacggagc attccgggct gaggagagcc gccagcggct600ggctgaggtg gcattggcgt atgccaaggc aggatgtcag gtggtagccc cgtcggacat660gatggatgga cgcgtggaag ccatcaaaga ggccctgatg gcacatggac ttggcaacag720ggtatcggtg atgagctaca gtgccaaatt tgcttcctgt ttctatggcc ctttccggga780tgcagctaag tcaagcccag cttttgggga ccgccgctgc taccagctgc cccctggagc840acgaggcctg gctctccgag ctgtggaccg ggatgtacgg gaaggagctg acatgctcat900ggtgaagccg ggaatgccct acctggacat cgtgcgggag gtaaaggaca agcaccctga960cctccctctc gccgtgtacc acgtctctgg agagtttgcc atgctgtggc atggagccca 1020ggccggggca tttgatctca aggctgccgt actggaggcc atgactgcct tccgcagagc 1080aggtgctgac atcatcatca cctactacac accgcagctg ctgcagtggc tgaaggagga 1140atgatggaga cagtgccagg cccaagaact agaactttaa aacgttcccg gggcctcaga 1200caagtgaaaa ccaaagtaaa tgctgctttt agaactgtgc cctcatgccc tcttcctgct 1260cacatgctag cggggcccag cagccctggg tggttttgcc agcatgctaa ctcttgtaac 1320
tcgcagctgc atcctatgag ctctcccaag cttccccgcc cctcccctgg gtcagccgtg 1380aggcccacct ttgccaccct cagctctttc ctctggtgtg gcttcagctt gaaagcaacc 1440tggagtcggg ggcacagcct ttggggcctg gctgggagag ggtcttggag cattagggga 1500agaagagagc agtgggatct tggggcctga gaagccttgg aacgcttctg gcagcagagc 1560tgggtgtggg aatgaggcct agatcgatat ccctgggtta gagttgaaat ttgccgcaat 1620tccactggaa ggcatttccc acgaggccag aggttgccag gctgcctgag gtctcctatt 1680ctactctgaa ccataaaccc agagaagaat tactcattaa ccagcataaa tactgcctga 1740ggatcaaaac tcagaggcaa agagggagtt cctgactgct agaggtgcca ccaccacaaa 1800cactttttat tcaggagata ctttttgaga atctctgctc tgttcctagg ttcagtgctg 1860ggtcctggga atacagcagg acagacctca gcttatctct tcatagaaat tatacaaaga 1920gaattgggga gacagctaag aagaaaacaa agaaataaag cagttacaaa ttgtgataag 1980tgctttgaag gaaagaaggg gtctgagaca acaacaggga aggggcctct cttgaaacag 2040tagttgggaa ggaggcagac atgcaccagt gatgtggtga caggtgctct gaaggaggtc 2100accaggacct gacctctttg aaggatcaga aaatacttcc ctgaaggact gacatttgag 2160cctagacctg aagggtgagc catcaagcta agacaattgg ggaagagcat tccagggaga 2220gggaggagtt gtgcaaaggc cctggggctc cttctagctg gaggaatgca aggctagctt 2280gtctggagca ctgagaggat ggcctgaact gagtggagag agacagacca ggaccaaacc 2340atgcagaggt caagggccac attcaccttt tcagagtgac tcaatcaaat ttgtagtttg 2400taaaagtatt ttaacagctc tgcggcaaag tgcaaatgaa aagtcttgat ggcatggact 2460ggagcgggga cagtggggat ggagaaaggg gaatggattg tggatgtgtt tagaaggtag 2520attcgatgtg aaggatgaat ctggcttgac cttctgggtg gctgatgggc catttactga 2580gatggggcag cctggaagag gaacagaagc agggtcgggg tggagggaga atactaaact 2640tagcttgaga cattttgcaa taaggaagct atatctagag tgcttatgtg actcacctaa 2700ggccactcaa caagtttgtg gcagaactgg attagaactg cacagaaaac agccaagctg 2760ggatttgaac ccatgtagtc caactccaag gcctctgccc ctaaccactg tgccatacca 2820cctcccaata atcaacagca aaattatagg tctaacaatg ttttatagac acccctccat 2880ttatgtgatg ggtttgcatc ctgataaacc catcataagt tgaaaatatg atcataagtt 2940gaaaatatga tcataagtca aaaatgtatt taatatacct aacctaccaa acatcatagc 3000ttagcctagc ctgccttaaa catgctcaga acacttacat tagcctacag tgggcaaaac 3060tatccaacac aaaatctata ttgtaataaa gttgtaaaga attttgaata aaaattcaat 3120atttgaaaaa aaaaaaaaaa aa3142<210>2<211>1154<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2gcagccaaag ccccaggagc cctaggttcc aaccaactga tgcccctgtg cccactggcc 60cacgccatgc agccccagtc cgttctgcac agcggctact tccacccact acttcgggcc120tggcagacag ccaccaccac cctcaatgcc tccaacctca tctaccccat ctttgtcacg180gatgttcctg atgacataca gcctatcacc agcctcccag gagtggccag gtatggtgtg240aagcggctgg aagagatgct gaggcccttg gtggaagagg gcctacgctg tgtcttgatc300tttggcgtcc ccagcagagt tcccaaggac gagcggggtt ccgcagctga ctccgaggag360tccccagcta ttgaggcaat ccatctgttg aggaagacct tccccaacct cctggtggcc420tgtgatgtct gcctgtgtcc ctacacctcc catggtcact gcgggctcct gagtgaaaac480ggagcattcc gggctgagga gagccgccag cggctggctg aggtggcatt ggcgtatgcc540aaggcaggat gtcaggtggt agccccgtcg gacatgatgg atggacgcgt ggaagccatc600aaagaggccc tgatggcaca tggacttggc aacagggtat cggtgatgag ctacagtgcc660aaatttgctt cctgtttcta tggccctttc cgggatgcag ctaagtcaag cccagctttt720
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Leu Ala Val Tyr His Val Ser Gly Glu Phe Ala Met Leu Trp His Gly275 280 285Ala Gln Ala Gly Ala Phe Asp Leu Lys Ala Ala Val Leu Glu Ala Met290 295 300Thr Ala Phe Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Ile Thr Tyr Tyr Thr305 310 315 320Pro Gln Leu Leu Gln Trp Leu Lys Glu Glu325 330
權(quán)利要求
1.包含一種試劑的組合物，該試劑通過(guò)結(jié)合到多聚體蛋白的結(jié)合位點(diǎn)并由此影響單元的平衡而影響所述多聚體蛋白，其中所述多聚體蛋白包括具有多個(gè)所述單元的集合，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面，以及其中一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相聯(lián)系，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是在所述多聚體蛋白中(1)各所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡和(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響多聚體蛋白的功能。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中影響所述多聚體蛋白包括影響所述多聚體蛋白的功能。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述多聚體蛋白的功能是活性并且影響是抑制或活化中的至少一種。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中該試劑結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型或具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中各所述單元選自單體、二聚體，三聚體、四聚體、六聚體和八聚體。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多聚體蛋白選自膽素原合成酶和Ia型核糖核苷酸還原酶.
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述多聚體蛋白是包含八個(gè)膽色素原合成酶單體的膽色素原合成酶。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中該試劑是結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的抑制劑，并且其中四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型包含少于八個(gè)膽色素原合成酶單體。
10.權(quán)利要求7的組合物，其中所述多聚體蛋白是Ia型核糖核苷酸還原酶，以及該試劑通過(guò)選擇性結(jié)合到對(duì)具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)而抑制Ia型核糖核苷酸還原酶。
11.一種組合物，包含通過(guò)結(jié)合到具有第二數(shù)量單體的較低活性形式的多聚體膽色素原合成酶而抑制具有第一數(shù)量單體的多聚體膽色素原合成酶的活性形式形成的抑制劑，其中單體的第一數(shù)量多于單體的第二數(shù)量。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中多聚體膽色素原合成酶來(lái)自細(xì)菌、古細(xì)菌、或真核生物，假設(shè)八聚體膽色素原合成酶包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中多聚體膽色素原合成酶包含催化的鋅結(jié)合位點(diǎn)。
14.權(quán)利要求11的組合物，其中多聚體膽色素原合成酶不包含變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和催化的鋅結(jié)合位點(diǎn)。
15.權(quán)利要求11的組合物，其中所述較低活性形式是六聚體。
16.權(quán)利要求11的組合物，其中所述較低活性形式是二聚體。
17.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑取代金屬離子并從而結(jié)合在金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中金屬離子是鋅和/或鎂。
19.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑結(jié)合在活性位點(diǎn)。
20.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑不是金屬陽(yáng)離子。
21.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑通過(guò)結(jié)合到含有少于八個(gè)單體的多聚體膽色素原合成酶的較低活性形式的不能實(shí)施擁抱的結(jié)構(gòu)域而抑制多聚體膽色素原合成酶的活性形式的形成，所述活性形式是八聚體膽色素原合成酶。
22.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑通過(guò)結(jié)合在除活性位點(diǎn)和/或金屬離子結(jié)合位點(diǎn)外的位點(diǎn)而抑制多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成。
23.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑通過(guò)去除金屬離子之外的機(jī)制而抑制多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成。
24.權(quán)利要求11的組合物，還包括遞送介質(zhì)，所述遞送介質(zhì)選自藥物可接受的介質(zhì)，口服可接受的介質(zhì)，抗細(xì)菌介質(zhì)，和有效除草的介質(zhì)。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中該組合物有效抑制或防止多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成并從而抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假設(shè)多聚體膽色素原合成酶的活性形式含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
26.權(quán)利要求25組合物，有效治療或預(yù)防由接觸細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物導(dǎo)致的疾病。
27.權(quán)利要求25組合物，其中該組合物是藥物、牙膏、肥皂、消毒劑、抗生物膜組合物，和除草劑中的至少一種。
28.權(quán)利要求24的組合物，其中該組合物有效抑制或防止多聚體膽色素原合成酶活性形式的形成并從而抑制或防止細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物的增長(zhǎng)或生長(zhǎng)，假設(shè)多聚體膽色素原合成酶的活性形式不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)和催化鋅。
29.權(quán)利要求28的組合物，有效治療或預(yù)防由接觸細(xì)菌、古細(xì)菌和/或真核生物導(dǎo)致的疾病。
30.權(quán)利要求28組合物，其中該組合物是藥物、牙膏、肥皂、和消毒劑中的至少一種。
31.一種對(duì)基本以擁抱二聚體的多聚體存在的多聚體膽色素原合成酶是轉(zhuǎn)基因的除草劑抗性植物。
32.權(quán)利要求31的除草劑抗性植物，其中多聚體膽色素原合成酶來(lái)自人。
33.權(quán)利要求31的除草劑抗性植物，其中多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
34.一種組合物，含有結(jié)合到不需要鋅實(shí)現(xiàn)催化功能的多聚體膽色素原合成酶的抑制劑。
35.一種影響多聚體蛋白的方法，該方法包括提供包括具有多個(gè)單元集合的多聚體蛋白，其中各所述單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及其中一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是(1)所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能；提供包含試劑的權(quán)利要求1的組合物，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到該集合上的結(jié)合位點(diǎn)而影響平衡；并且將該集合與試劑接觸，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到結(jié)合位點(diǎn)并由此影響所述多聚體蛋白而影響平衡。
36.權(quán)利要求35的方法，其中影響所述多聚體蛋白包括影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成。
37.權(quán)利要求35的方法，其中影響所述多聚體蛋白包括影響所述多聚體蛋白的功能。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述單元選自單體、二聚體，三聚體、四聚體、六聚體和八聚體。
39.權(quán)利要求35的方法，其中該試劑影響所述多聚體蛋白的功能。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述多聚體蛋白的功能是活性并且影響是抑制或活化中的至少一種。
41.權(quán)利要求40的方法，其中該試劑結(jié)合到具有較低活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型或具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種。
42.權(quán)利要求41的方法，其中試劑結(jié)合到具有較高活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型。
43.權(quán)利要求35的方法，其中所述多聚體蛋白選自膽色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸還原酶。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述多聚體蛋白是包含八個(gè)膽色素原合成酶單體的膽色素原合成酶。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述多聚體蛋白是Ia型核糖核苷酸還原酶并且該試劑通過(guò)選擇性結(jié)合到對(duì)具有較低活性四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)而抑制Ia型核糖核苷酸還原酶。
46.調(diào)整細(xì)胞、組織、或生物體內(nèi)生理活性的方法，該方法包括提供細(xì)胞、組織和生物體，其中細(xì)胞、組織或生物體包括含有具有多個(gè)單元集合的多聚體蛋白，其中各單元包括第一互補(bǔ)表面和第二互補(bǔ)表面以及一個(gè)單元的第一互補(bǔ)表面與另一個(gè)單元的第二互補(bǔ)表面相關(guān)，假設(shè)該集合是不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型中的至少一種，條件是(1)所述單元的結(jié)構(gòu)決定所述不同的四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)，(2)所述單元處于平衡中以及(3)所述不同四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的結(jié)構(gòu)影響該多聚體蛋白的功能；以及向細(xì)胞、組織或生物體提供包含該試劑的權(quán)利要求1的組合物，其中該試劑通過(guò)結(jié)合到單元上的結(jié)合位點(diǎn)并由此影響四級(jí)結(jié)構(gòu)同工型的形成和調(diào)整生理活性而影響平衡。
47.抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式的方法，該方法包括將權(quán)利要求11的組合物施用于多聚體膽色素原合成酶；將組合物與較低活性形式聯(lián)系；抑制較低活性形式集合形成活性形式并從而抑制多聚體膽色素原合成酶形成活性形式。
48.操縱植物生長(zhǎng)或發(fā)育的方法，包括將權(quán)利要求27的組合物施用到植物，其中該植物是除草劑抗性的，并且對(duì)基本以擁抱二聚體的多聚體形式存在的多聚體膽色素原合成酶是轉(zhuǎn)基因的。
49.權(quán)利要求48的方法，其中多聚體膽色素原合成酶不含有變構(gòu)的鎂結(jié)合位點(diǎn)。
50.制備抗細(xì)菌表面的方法，該方法包括提供權(quán)利要求27的組合物；提供表面形成基質(zhì)；將組合物與表面形成基質(zhì)結(jié)合，并從而制備抗細(xì)菌表面。
51.權(quán)利要求50的方法，其中抗細(xì)菌表面防止或抑制生物膜的形成。
52.權(quán)利要求11的組合物，其中抑制劑是迷迭香酸或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制多聚體蛋白膽色素原合成酶和Ⅰa類核糖核苷酸還原酶的組合物，公開了對(duì)于多聚體蛋白膽色素原合成酶而言是轉(zhuǎn)基因的除草劑抗性植物及其使用方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1835739SQ200480023403
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者艾琳·K·賈菲 申請(qǐng)人:?？怂共趟拱┌Y中心