專利名稱：：生產(chǎn)多肽的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于多肽生產(chǎn)的領(lǐng)域。其描述了含有選擇性剪接核酸的核酸、包含此核酸的細(xì)胞、分離表達(dá)異源多肽細(xì)胞的方法、以及生產(chǎn)異源多肽的方法，在所述分離表達(dá)異源多肽細(xì)胞的方法中所利用的核酸包含編碼異源多肽的第一核酸、包含選擇性剪接核酸的第二核酸、以及編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段或GPI-錨定物的信號(hào)肽的第三核酸。
背景技術(shù)：
：生產(chǎn)重組多肽的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)中眾所周知的并且由下述文章描述，例如，Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V.等人，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm,F.和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-160。制藥應(yīng)用所用多肽和蛋白的生產(chǎn)優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)月包，如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、？虹1^:6@細(xì)胞等。編碼多肽的核酸優(yōu)選包含在核酸，例如表達(dá)載體中引入宿主細(xì)胞。表達(dá)載體的基本元件是原核質(zhì)粒增殖單位，例如包括復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、真核選擇標(biāo)記、和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)感興趣的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)盒的大腸桿菌，所述表達(dá)盒各自包含啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因、和包含多聚腺苷酸化信號(hào)的轉(zhuǎn)錄終止子。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，可以包含哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)，如SV40Ori或來自EBV的OriP。啟動(dòng)子可以選擇組成型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。為了使轉(zhuǎn)錄最優(yōu)化可以在5，非翻譯區(qū)包含一段Kozak序列。為了mRNA加工，特別是轉(zhuǎn)錄終止和前體mRNA的剪接，依賴于結(jié)構(gòu)基因的構(gòu)造(外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)形式)，可以包括mRNA剪接信號(hào)以及多聚腺苷酸化信號(hào)?；虻谋磉_(dá)表現(xiàn)為瞬時(shí)或永久的表達(dá)。感興趣的多肽可以是分泌型多肽或者胞質(zhì)多肽，所述分泌型多肽包含N末端延伸(也稱為信號(hào)序列)，此延伸對(duì)多肽通過細(xì)胞和進(jìn)入胞外媒介的運(yùn)輸/分泌是必需的。為了多肽的大規(guī)模生產(chǎn)需要建立高生產(chǎn)型細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞林如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、BHK細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER.C6⑧細(xì)胞或HEK細(xì)胞之后，一般而言大多數(shù)具有不同特征的克隆的獲得是由于例如，從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定整合質(zhì)粒表達(dá)的多肽的廣泛不同。為了選擇的目的，引入細(xì)胞的核酸有額外的選擇性標(biāo)記，例如帶有對(duì)另一致死性物質(zhì)抗性的基因。轉(zhuǎn)染后通過在適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，可以分離高生產(chǎn)型克隆。這個(gè)過程是費(fèi)時(shí)的因而需要大筆開支。發(fā)展出幾個(gè)方法來處理這個(gè)問題。這些辦法其一是基因擴(kuò)增。其中用載體/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶缺陷(DHFR)的細(xì)胞，所述載體/質(zhì)粒包含表達(dá)DHFR蛋白的第一表達(dá)盒和表達(dá)感興趣的異源多肽的第二表達(dá)盒。通過利用去除甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)液建立了選擇性生長(zhǎng)條件。加入曱氨喋呤(MTX)以擴(kuò)增DHFR的抑制物。(Kaufman,R.J.等人，JMol.Biol.159(1982)601-621;US4,656,134)或者可以將才艮告分子融合入異源多肽，如氯霉素-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白、或p-半乳糖苷酶，因?yàn)樗霾鹏薷娣肿邮歉呱a(chǎn)型細(xì)胞株所需要的而且還作為間接的選擇標(biāo)記。選擇發(fā)生在添加的外源物質(zhì)或輔因子存在的情況下。鑒定高生產(chǎn)型克隆的另一個(gè)方法是，經(jīng)由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的選擇性標(biāo)記基因和編碼異源多肽的結(jié)構(gòu)基因的連鎖轉(zhuǎn)錄。通過這一設(shè)計(jì)異源多肽的表達(dá)可以與選擇性標(biāo)記的表達(dá)關(guān)聯(lián)起來。人源免疫球蛋白由特化的淋巴細(xì)胞B細(xì)胞產(chǎn)生。這些細(xì)胞不只分泌免疫球蛋白(slg)它們還使免疫球蛋白作為質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白(mlg)呈現(xiàn)在它們的細(xì)胞外膜。這些mlg在免疫應(yīng)答起始時(shí)起重要作用。呈現(xiàn)的質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白具有它們相應(yīng)抗原的細(xì)胞受體的功能。從1980年開始，有關(guān)分泌型和質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白的起源的文章發(fā)表面世。Early等人(Early，P.等人，Cell20(1980)313-319)報(bào)道，在小鼠中有兩種編碼免疫球蛋白重鏈的mRNA，所述mRNA源自單一免疫球蛋白—基因的相同原始轉(zhuǎn)錄本。分泌形式(slg)和質(zhì)膜-結(jié)合形式(mlg)的形成由重鏈前體mRNA的選擇剪接所產(chǎn)生。對(duì)于slg亞型，所有編碼免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的外顯子和編碼C末端結(jié)構(gòu)域外顯子之后的內(nèi)含子都保留在mRNA中，而位于內(nèi)含子中終止密碼子下游的多聚腺苷酸化信號(hào)用來剪切和多聚腺苷酸化原始轉(zhuǎn)錄本。對(duì)于mlg亞型，在編碼分泌型形式C末端結(jié)構(gòu)域(即分別為CH3或CH4)之后的選擇剪接5，供體位點(diǎn)連接恒定區(qū)與編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的下游外顯子Ml和M2。在這種情況下，分泌型形式的編碼末端氨基酸的序列和終止密碼子、及其鄰近內(nèi)含子區(qū)的slg形式的多聚腺苷酸化信號(hào)隨同內(nèi)含子的剪接一起被移除。例如，編碼分泌型免疫球蛋白重鏈形式的mRNA與編碼質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白重鏈形式的mRNA的比例為10:1到100:1之間。這個(gè)比例主要是在前體mRNA剪接過程中確定的。翻譯和翻譯后控制機(jī)制只起次要的作用(參見，例如Xiang，S.D.等人，Immun.CellBiol.79(2001)472-481)。酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的是，slg重鏈C末端的延伸包含跨膜結(jié)構(gòu)域。這個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度一般在約40和約75個(gè)氨基酸殘基之間。對(duì)于鼠和人的免疫球蛋白，所述跨膜結(jié)構(gòu)域能被再分為三個(gè)截然不同的結(jié)構(gòu)區(qū)13-67個(gè)氛基酸殘基的N末端胞外區(qū)、25個(gè)氨基酸殘基的中心保守的跨膜伸展區(qū)、以及3-28個(gè)氨基酸殘基的C末端胞質(zhì)區(qū)(Major，J.G.等人，Mol.Immunol.33(1996)179-187)。表達(dá)載體包含可擴(kuò)增的選擇性基因、熒光蛋白基因和編碼所需產(chǎn)物的基因，它們以WO01/04306中已報(bào)道方式連接使轉(zhuǎn)錄和翻譯最優(yōu)化。在WO01/38557中報(bào)道了用于篩選多重轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以鑒定表達(dá)至少兩個(gè)感興趣的肽或蛋白質(zhì)的細(xì)^^包的方法。這兩個(gè)肽/蛋白質(zhì)通過IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))連接于熒光標(biāo)記基因。美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0033616報(bào)道了包含成像標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)申請(qǐng)2005/0032127報(bào)道了在溫和條件下從細(xì)胞混合物或細(xì)胞培養(yǎng)物中非侵入的選擇單個(gè)活細(xì)胞的方法，所述方法與通過焚光顯微鏡檢測(cè)法檢測(cè)的特異生產(chǎn)性能有關(guān)。鑒定和分離生產(chǎn)分泌型蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法在美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0168702有所報(bào)道。在美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0148647中報(bào)道了表達(dá)載體，所述載體由功能性連接于倉(cāng)鼠啟動(dòng)子的編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因、編碼熒光蛋白的基因、和優(yōu)選可擴(kuò)增的選擇基因組成。發(fā)明概述本發(fā)明包含核酸，所述核酸從5，到3，的方向包含a)編碼異源多肽不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，b)起始于5'剪接供體位點(diǎn)并且終止于3'剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和c)第三核酸其編碼i)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或ii)GPI-錨定物信號(hào)肽。本發(fā)明另外的方面是適合于真核細(xì)胞的包含本發(fā)明的核酸的載體，以及包含根據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)核酸的真核細(xì)胞。本發(fā)明還包括選擇表達(dá)異源多肽的真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所迷轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包括適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA，適于所述前體mRNA加工，以及適于所述加工后mRNA翻譯成多肽，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性的異源多肽和質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽的細(xì)胞作為所述表達(dá)異源多肽的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中發(fā)明的方法是選擇表達(dá)免疫球蛋白真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸從5，到3'的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈不具有符合讀碼框的翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包括適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體mRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性的免疫球蛋白重鏈和質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白重鏈，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白重鏈的細(xì)胞作為所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞。另外本發(fā)明還包含生產(chǎn)由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的多肽的方法，通過a)提供真核細(xì)胞，b)用4艮據(jù)本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞，c)在適合所述細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，d)從所述細(xì)胞的培養(yǎng)液或胞質(zhì)中回收所述多肽。另外，本發(fā)明還包含核酸，所述核酸從5，到3，的方向包含a)第一多克隆位點(diǎn)，b)起始于5，剪接供體位點(diǎn)并且終止于3，剪接受體位點(diǎn)的核酸，其中i)所述核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會(huì)被組成性移除，c)第二多克隆位點(diǎn)。該發(fā)明此外包含未被組成性移除的根據(jù)本發(fā)明的核酸的栽體。發(fā)明詳述本發(fā)明包含選擇表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽或蛋白質(zhì)不具有翻譯終止密碼子的第一核酸，ii)起始于5，剪接供體位點(diǎn)和終止于3，剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包括適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體mRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成多肽或蛋白質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性的異源多肽或蛋白質(zhì)以及質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽或蛋白質(zhì)，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為所述表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的方法和技術(shù)在下列文獻(xiàn)中做了描述，例如，Ausubel，F(xiàn).M.(編專尋)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，巻I至!]III(1997);Glover,N.D"和Hames，B.D.編豐尋，DNACloning:APracticalApproach,巻I和II(1985)，牛津大學(xué)出版社；Freshney，R.I.(編輯)，AnimalCellCulture-apracticalapproach,IRLPressLimited(1986);Watson,J.D.等人，RecombinantDNA，第二版，CHSLPress(1992);Winnacker，E丄.，F(xiàn)romGenestoClones;N.Y"VCHPublishers(1987);Celis，J.編輯，CellBiology,第二版，AcademicPress(1998);Freshney，R.I.，CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,笫二版,AlanR.Liss，Inc.,N.Y.(1987)。重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使能夠生產(chǎn)多肽的多種衍生物。舉例來說，能夠在其單個(gè)或幾個(gè)氨基酸位置通過置換、改造、交換、刪除或插入來修飾這樣的衍生物。例如，可以通過定點(diǎn)誘變來進(jìn)行修飾或衍生。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不費(fèi)力的做到這種修飾(參見例如，Sambrook，J.等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(1999)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)；Hames，B.D.，和Higgins,S.G"Nucleicacidhybridization-apracticalapproach(1985)IRL出版社，牛津，英國(guó))。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用的一些術(shù)語定義如下此處所用的"核酸"是指多聚核苷酸分子，例如DNA和/RNA之類。這分子^4是一個(gè)或;個(gè)天然;在的多聚^普酸分子或i片段與一V或多個(gè)合成的多聚核苷酸分子的組合。此定義還包含，天然存在的多聚核苷酸分子中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被改變(例如通過突變刪除或添加)的情況?？梢詫⒑怂岱蛛x，或者將其整合入另一個(gè)核酸，如在表達(dá)載體或真核宿主細(xì)胞的染色體中。核酸的特征也在于其核酸序列由單個(gè)核苷酸組成。從對(duì)應(yīng)的的核酸是本領(lǐng)域公知的。因此氨基*列同樣由其核酸表征。同樣由對(duì)應(yīng)的氨基*列給出核酸。本申請(qǐng)中可互換使用的表達(dá)"質(zhì)粒"或"載體，，包含，例如穿梭和表達(dá)質(zhì)粒還有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。通常，質(zhì)粒也將包含復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl和oriP復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記(例如氨芐青審素或四環(huán)素抗性基因)以分別用于在細(xì)菌中復(fù)制和選擇質(zhì)粒。"表達(dá)盒"是指這樣的構(gòu)建體，其包含的必需調(diào)控元件在細(xì)胞中至少表達(dá)所含有結(jié)構(gòu)基因。可選的，也包含能使表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)分泌的附加元件。"基因"是指如在染色體或質(zhì)粒上的片段，其為多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的。除編碼區(qū)外，基因還包含其它功能元件，所述功能元件包含啟動(dòng)子、一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子和/或外顯子，以及一個(gè)或多個(gè)終止子。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語"結(jié)構(gòu)基因"是指基因的編碼區(qū)，即外顯子，沒有信號(hào)序列但是有插入的內(nèi)含子。"選擇標(biāo)記"是指在存在或沒有對(duì)應(yīng)的選擇物質(zhì)時(shí)，該基因4吏得帶有這個(gè)基因的細(xì)胞能被特異的選擇留下或者相反的基因。有用的正選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。這種選擇標(biāo)記允許被該基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在對(duì)應(yīng)抗生素存在時(shí)被正選擇留下來；未轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在選擇培養(yǎng)條件下(即選擇物質(zhì)存在時(shí)，在選擇培養(yǎng)液中)將不能生長(zhǎng)或存活。選擇性標(biāo)記可以是正向的、負(fù)向的或雙功能的。正選擇標(biāo)記使得帶有標(biāo)記的細(xì)胞選擇留下，而負(fù)選擇標(biāo)記使得帶有標(biāo)記的細(xì)胞被選擇消除。通常，選擇標(biāo)記會(huì)帶有對(duì)藥物的抗性或?qū)λ拗骷?xì)胞代謝或分解代謝缺陷的補(bǔ)償性。真核細(xì)胞有用的選擇標(biāo)記包含，例如氨基糖甙磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因，如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)、新霉素和G418APH、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(選擇物質(zhì)為吲哚)、組氨醇脫氫酶(選擇物質(zhì)為組氨醇D)以及編碼嘌呤霉素、博來霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。在WO92/08796和WO94/28143中描述了更多的標(biāo)記基因。此處所用的"調(diào)控元件，，是指以順式和/或反式存在的核苷酸序列，其為包含感興趣的結(jié)構(gòu)基因的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所必需的。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常包含位于要表達(dá)的基因序列上游的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)、以及多聚腺苷酸化信號(hào)序列。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)"指在基因中的核苷酸，對(duì)應(yīng)于將被整合入原始轉(zhuǎn)錄本(即前體mRNA)的第一核酸；轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能與啟動(dòng)子序列重疊。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)"是指通常存在于將要轉(zhuǎn)錄的感興趣的基因3'端的核苷酸序列，它引起RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄。多聚腺苷酸化信號(hào)序列，或多聚腺苷酸(poly-A)附加信號(hào)為在真核mRNA3'端的特異位點(diǎn)的剪切提供了信號(hào)，并且轉(zhuǎn)錄后在細(xì)胞核內(nèi)為剪切過的3，端加上約100-200個(gè)腺苷酸核苷酸(多聚腺苷酸尾)序列。多聚腺苷酸化信號(hào)序列可能在剪切位點(diǎn)上游約10-30個(gè)核苷酸的位置含有共有序列AATAAA。翻譯調(diào)控元件包含翻譯起始(AUG)和終止密碼子(TAA、TAG或TGA)。在某些構(gòu)建體中還可以包含內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。"啟動(dòng)子"是指控制基因或核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的多聚核苷酸序列，其可操縱的連接在所述基因或核苷酸序列上。啟動(dòng)子含有RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)?？紤]在其中選擇/可操縱的連接序列的表達(dá)，所用的啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中是有功能的。包括各種不同來源的組成型、誘導(dǎo)型和抑制型的大量啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的(并在數(shù)據(jù)庫(kù)如基因庫(kù)中確定的)，也是可作為或在克隆的多聚核苷酸中得到的(從例如，ATCC等儲(chǔ)藏庫(kù)以及其他商業(yè)或個(gè)人來源)。"啟動(dòng)子"包含指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常情況下，啟動(dòng)子位于基因的5'端非編碼或非翻譯區(qū)，接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始站點(diǎn)。啟動(dòng)子中在啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起作用的序列元件，其常常表征為共有核苷酸序列。這些啟動(dòng)子元件包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序列、CAAT序列、分化-特異性元件(DSE;McGehee，R.E.Jr.等人，Mol.Endocrinol.7(1993)551-60)、cAMP響應(yīng)元件(CRE)、血清相應(yīng)元件(SRE;Treisman，R.，SeminarsinCancerBiol.1(1990)47-58)、糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件(GRE)、以及其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等人，J.Biol.Chem.267(1992)19938-43)、AP2(Ye，J.等人，J.Biol.Chem.269(1994)25728-34)、SPl、cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB;Loeken，M.R.,GeneExpr.3(1993)253-64)和八聚體因子(總體參見，Watson等人編輯，MolecularBiologyoftheGene,第4版,TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.(1987),和Lemaigre，F(xiàn).P.和Rousseau,G.G"Biochem.J.303(1994)1-14)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄比率將響應(yīng)誘導(dǎo)物質(zhì)而升高。相反的，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄比率不受誘導(dǎo)物質(zhì)調(diào)控。抑制型啟動(dòng)子也廣為人知。例如，c-fos啟動(dòng)子只在生長(zhǎng)激素結(jié)合到其細(xì)胞表面受體時(shí)被特異激活。四環(huán)素(Tet)調(diào)控的表達(dá)可以通過人工雜合啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)，所述人工雜合啟動(dòng)子由例如，在CMV啟動(dòng)子后面接著兩個(gè)Tet-操縱基因位點(diǎn)所組成。Tet-阻遏蛋白結(jié)合到兩個(gè)Tet-操縱基因位點(diǎn)上并阻止轉(zhuǎn)錄。通過加入誘導(dǎo)物四環(huán)素，Tet-阻遏蛋白從Tet-操縱基因位點(diǎn)釋放而轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行(Gossen，M.和Bujard，H.PNAS89(1992)5547-5551)。對(duì)于其它的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子包含金屬疏蛋白和熱休克啟動(dòng)子，參見例如，Sambrook等人(見上文)和Gossen等人，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。在真核啟動(dòng)子中，已被證明具有高表達(dá)水平的強(qiáng)啟動(dòng)子是SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子、肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列、中國(guó)倉(cāng)鼠延伸因子la(CHEF-l，參見如美國(guó)5,888,809)，人EF-la、泛素、以及人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(CMVIE)。"啟動(dòng)子"可以是組成型的或誘導(dǎo)型的?？赡苄枰鰪?qiáng)子(即作用在啟動(dòng)子上以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件)與啟動(dòng)子結(jié)合起作用，以提高啟動(dòng)子單獨(dú)作用獲得的表達(dá)水平，而且其可能被包括作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。包含啟動(dòng)子的多聚核苷酸段通常也會(huì)包含增強(qiáng)子序列(如CMV或SV40)。"可操縱的連接，，是指兩個(gè)或多個(gè)組分位置接近，其中如此描述的組分間有一種聯(lián)系，所述聯(lián)系允許它們以之預(yù)期的方式起作用。舉例來說，如果啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子順式控制或調(diào)節(jié)其所連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄，它就是可操縱的連接到編碼序列上的。通常但非必需的，"可操縱的連接"的DNA序列是連續(xù)的，其中需要連續(xù)的在讀碼框中向兩個(gè)蛋白編碼區(qū)加入諸如分泌前導(dǎo)肽和多肽、或多肽和跨膜結(jié)構(gòu)域、或多肽和GPI-錨定物信號(hào)肽、或多肽和翻譯終止密碼子。然而，盡管可操縱連接的啟動(dòng)子一般位于編碼序列上游，它也不是必須與之相連續(xù)。增強(qiáng)子不需要與之相連。如果增強(qiáng)子能提高編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它就是可操縱的連接到編碼序列上的?？蓳吙v連接的增強(qiáng)子可以在編碼序列的上游、中間或者下游，并且與啟動(dòng)子之間有相當(dāng)大的距離。如果多聚腺苷酸化位點(diǎn)位于編碼序列末端的下游，因而轉(zhuǎn)錄得以通過編碼序列進(jìn)入多聚腺苷酸化序列進(jìn)行，那它就是可操縱的連接到編碼序列的。通過本領(lǐng)域周知的重組方法來完成連接，例如使用PCR方法和/或在方便的限制性位點(diǎn)用連接法。如果沒有方便的限制性位點(diǎn)，那就根據(jù)常規(guī)的操作利用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。此處所用的術(shù)語"前體mRNA的產(chǎn)生"是指DNA轉(zhuǎn)錄成為其互補(bǔ)前體mRNA的過程。真核DNA由被稱為外顯子(編碼)和內(nèi)含子(非編碼)的編碼和非編碼區(qū)組成。在DNA轉(zhuǎn)錄成為其互補(bǔ)前體mRNA的過程中，外顯子和內(nèi)含子的基因組結(jié)構(gòu)維持不變。此處所用的術(shù)語"前體mRNA的加工，，是指轉(zhuǎn)錄后修飾的過程。在此步驟中，前體mRNA的內(nèi)含子部分被剪接掉，即從前體mRNA上移除，加工后的mRNA其5'端加帽而其3，端進(jìn)行了多聚腺苷酸化。在此步驟中，最后得到了核mRNA，即成熟的mRNA。本申請(qǐng)所用的術(shù)語"跨膜結(jié)構(gòu)域"是指多肽或蛋白質(zhì)，所述多肽或蛋白質(zhì)在DNA水平上由至少一個(gè)包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的外顯子編碼?？缒そY(jié)構(gòu)域一般包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)區(qū)N末端胞外區(qū)、中間保守的跨膜伸展區(qū)、以及C末端胞質(zhì)區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域從N末端到C末端的方向包含胞外區(qū)和跨膜區(qū)。跨膜結(jié)構(gòu)域可能還包含胞內(nèi)區(qū)或胞質(zhì)區(qū)。本申請(qǐng)所用的術(shù)語"跨膜結(jié)構(gòu)域的片段"是指跨膜結(jié)構(gòu)域橫跨細(xì)胞膜的部分，即位于細(xì)胞膜中的部分，即跨膜伸展區(qū)。術(shù)語"選擇性剪接核酸，，是指起始于5，剪接供體位點(diǎn)并且終止于3，剪接受體位點(diǎn)的核酸。此核酸含有翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)。這個(gè)選擇性剪接核酸包含不會(huì)從對(duì)應(yīng)前體mRNA被組成性剪接掉的非編碼區(qū)，諸如，舉例來說，在編碼免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結(jié)構(gòu)域的外顯子之后的內(nèi)含子。發(fā)生在選擇性剪接核酸的5，剪接供體位點(diǎn)的"選擇性剪接事件"是決定性事件，決定選擇性剪接核酸是否從前體mRNA剪接掉或者是否至少留下部分并包含在成熟的(加工后的)mRNA中。此處所用的術(shù)語"選擇剪接，，及其語法等同成分是指在真核細(xì)胞中，從單一的前體mRNA開始，由于對(duì)一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子進(jìn)行不同的加工，可以得到不同的成熟mRNA，從而表達(dá)出不同亞型的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的前體mRNA的單個(gè)的(即只有一個(gè))內(nèi)含子可被選擇性剪接。在另一個(gè)實(shí)施方案里，第二核酸可以被選擇性剪接。在此外另一個(gè)實(shí)施方案里，第二核酸作為選擇性剪接內(nèi)含子包含其內(nèi)。不同的加工過程就是"是或不是"的決定，即在選擇性剪接過程中要處理的內(nèi)含子(即"選擇性剪接核酸")將會(huì)或者至少部分保留或者被剪接掉。這不需要被理解為導(dǎo)致不同的外顯子跟隨其后的分支點(diǎn)機(jī)制。它實(shí)際上是其中選擇性剪接核酸或者被剪接掉或者至少部分存留在成熟的mRNA中的機(jī)制。通過這種機(jī)制，選擇性剪接核酸以及其中包含的符合讀碼框的翻譯終止密碼子都會(huì)或者凈皮保留或者被移除。選擇性剪接是真核細(xì)胞的重要調(diào)控機(jī)制。通過選擇性剪接，可以從相同前體mRNA得到成熟mRNA中外顯子的不同組合，產(chǎn)生由相同DNA編碼的多種不同蛋白質(zhì)。此處所用的術(shù)語"表達(dá)"是指在細(xì)胞中發(fā)生進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。所需產(chǎn)物在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平可以基于細(xì)胞內(nèi)存在的相應(yīng)mRNA數(shù)量來確定。舉例來說，所選序列轉(zhuǎn)錄來的mRNA可以由PCR或由RNA雜交定量(參見Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))?？梢酝ㄟ^多種方式定量多肽，如通過ELISA、通過多肽生物活性的測(cè)定、或者使用獨(dú)立于這類活性之外的測(cè)定如免疫印跡、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核磁共振(NMR)或放射免疫法，例如使用識(shí)別并結(jié)合多肽的抗體(見Sambrook等人，1989年，見上文)。"宿主細(xì)胞，，指編碼多肽或蛋白質(zhì)的異源核酸引入的細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括用于質(zhì)粒增殖的原核細(xì)胞，和用于表達(dá)異源核酸的真核細(xì)胞。真核細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、PER,C6⑧細(xì)胞。"多肽，，是由肽鍵相連的氨基酸組成的聚合物，無論是天然產(chǎn)生的或人工合成的。少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可稱為"肽"，而由多于100個(gè)氨基酸殘基組成的多肽或由兩個(gè)或更多多肽鏈組成的多肽可稱為"蛋白質(zhì)，，。"蛋白質(zhì)"是大分子，所述大分子包含至少一個(gè)長(zhǎng)度為ioo個(gè)氨基酸或以上的多肽鏈，或包含兩個(gè)或更多的多肽鏈。多肽和蛋白質(zhì)可能還包含非肽的組分，如糖類基團(tuán)、金屬離子、脂質(zhì)、羧酸酯或其組合。非肽取代物可能由其中引入該多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞加入，并可能隨細(xì)胞類型變化。多肽和蛋白質(zhì)在此處是根據(jù)其氨基酸的骨架結(jié)構(gòu)而定義的；附加物諸如糖類一般不會(huì)詳細(xì)說明，但仍然可能存在。"異源DNA"或"異源核酸"指并非天然存在于特定宿主細(xì)胞的DNA分子或核酸，或一組DNA分子或一組核酸。特定宿主細(xì)胞的異源DNA分子可能含有來自宿主細(xì)胞種類的DNA(即內(nèi)源性DNA)，只要該宿主DNA與非宿主DNA(即異源DNA)組合。例如，DNA分子含有編碼多肽的非宿主DNA部分，其可操縱的連接到包含啟動(dòng)子的宿主DNA部分，則所述DNA分子被認(rèn)為是異源DNA分子。反過來說，異源DNA可能包含內(nèi)源性結(jié)構(gòu)基因可操縱的連接到異源啟動(dòng)子上。由非宿主(即異源)核酸編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。此處所用的術(shù)語"生物活性多肽，，是指有機(jī)分子，如諸如多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質(zhì)的生物大分子，所述分子在處于或進(jìn)入人造生物系統(tǒng)控制時(shí)會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)，例如使用細(xì)胞林和病毒、或在動(dòng)物體內(nèi)的(包含但不限于鳥類和哺乳動(dòng)物，也包含人在內(nèi))的生物測(cè)定。該生物學(xué)效應(yīng)可以是但不局限于，酶抑制或活化、結(jié)合到受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)或周邊、信號(hào)觸發(fā)或信號(hào)調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案里，所述生物活性多肽是從包含免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白綴合物和抗融合肽(antifusogenicpeptide)的一組多肽中選定的。生物活性的分子不限于，例如激素、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、免疫球蛋白、抗融合肽、生長(zhǎng)因子、受體的配體、其激動(dòng)劑或拮抗劑、細(xì)胞毒性試劑、抗病毒試劑、顯象劑、酶抑制劑、酶的激活劑或酶活性調(diào)節(jié)劑，如變構(gòu)物，以及這些的綴合物。本申請(qǐng)所用的術(shù)語"氨基酸"是指羧基oc-氨基酸，它可以直接或作為前體被核酸編碼，包含丙氨酸(三字母密碼Ala，單字母密碼A)，精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天門冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、蛋氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、脯氨酸(Pro,P)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和纈氨酸(Val，V)。"克隆載體"是諸如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒或細(xì)菌人工染色體(BAC)的核酸，其在宿主細(xì)^^中有自主復(fù)制的能力?？寺≥d體通常包含一個(gè)或少量限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)允許載體在不喪失基本生物學(xué)功能的前提下，用可確定的方式插入核酸，以及編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列，所述選擇標(biāo)記適用于鑒別和選擇用克隆載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞。選擇標(biāo)記通常包括提供四環(huán)素、新霉素、G418或氨爺青霉素抗性的基因。"表達(dá)載體"是編碼要在宿主細(xì)胞中表達(dá)的異源多肽或蛋白質(zhì)的核酸。通常情況下，表達(dá)載體包含原核質(zhì)粒的增殖單位(如對(duì)于大腸桿菌，包含原核復(fù)制起點(diǎn)和原核選擇標(biāo)記)、真核篩選標(biāo)記、和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)感興趣的核酸的表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、核酸、和轉(zhuǎn)錄終止子(包括多聚腺苷酸化信號(hào))?；虮磉_(dá)通常位于啟動(dòng)子控制下，而這樣的結(jié)構(gòu)基因就是所述的"可操縱的連接"到啟動(dòng)子。同樣，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性。調(diào)控元件和核心啟動(dòng)子就是可操縱連接的。"多順反子轉(zhuǎn)錄單元，，是其中一個(gè)以上的結(jié)構(gòu)基因位于相同啟動(dòng)子的控制下的轉(zhuǎn)錄單元。"分離的多肽，，或"分離的蛋白，，是基本上沒有細(xì)胞成分污染的多肽或蛋白質(zhì)，諸如沒有共價(jià)連接的糖類、脂類、或其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，以及天然狀態(tài)下與多肽或蛋白一起的非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。通常，分離的多肽/蛋白質(zhì)的制備含有高度純化形式的多肽/蛋白質(zhì)，即至少約80%的純度、至少約90%的純度、至少約95%的純度、大于95%純度、或大于99%的純度。顯示某個(gè)特定的制備含有分離的多肽或蛋白質(zhì)的方法之一是，通過制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色之后的單一條帶的外觀來顯示。但是，術(shù)語"分離的"并不排除同樣的多肽或蛋白質(zhì)以另外的物理形式，如二聚體或選擇性糖基化或衍生形式存在。此處所用的術(shù)語"免疫球蛋白"是指實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因編碼的一個(gè)或多個(gè)多肽組成的蛋白質(zhì)。這個(gè)定義包含變種，所述變種如突變形式(即替換、刪除和插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的形式)、截短的形式、以及融合形式。公認(rèn)的免疫球蛋白基因，包含不同的恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可能以多種形式存在，包含例如Fv、Fab、和F(ab)2以及單鏈(scFv)(如Huston，J.S.等人，PNASUSA85(1988)5879-5883;Bird,R.E.等人，Science242(1988)423-426;以及總體來說，Hood等人，Immunology,BenjaminN.Y"第二版(1984)和Hunkapiller,T.和Hood,L.,Nature323(1986)15-16)。每個(gè)免疫球蛋白重型和輕型多肽鏈，如果存在，可能包含恒定區(qū)(一般在羧基末端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)了抗體的結(jié)合i)結(jié)合到有Fc受體的細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞，或ii)結(jié)合到有初生Fc受體(FcRn)也稱為Brambell受體的細(xì)胞。它也介導(dǎo)了一些因子的結(jié)合，包含經(jīng)典的補(bǔ)體系統(tǒng)因子如Clq組分。此外跨膜結(jié)構(gòu)域可以在免疫球蛋白重鏈C末端恒定域的后面，即CH3或CH4域。這個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域允許形成質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白-融合多肽。每個(gè)免疫球蛋白重型和輕型多肽鏈，如果出現(xiàn)，可能包含可變結(jié)構(gòu)域(一般在羧基末端部分)。免疫球蛋白的輕或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含不同部分，即四框架區(qū)域(FR)和三超變量區(qū)域(CDR)。術(shù)語"至少片段"是指完整的核酸或完整的多肽的一小部分，即至少20%、至少40%、至少60%、或至少80。/。完整的核酸、多肽、或域。舉例來說，"核酸編碼免疫球蛋白CH3或CH4結(jié)構(gòu)域的至少片段"是指編碼完整的免疫球蛋白CH3或Ch4結(jié)枸域的核酸的一小部分，即至少20%、至少40%、至少60%、或至少80%的編碼完整的免疫球蛋白CH3或CH4域的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案里，免疫球蛋白重鏈的片段是免疫球蛋白重鏈的C末端片段。術(shù)語"符合讀碼框的翻譯終止密碼子，，是指接在閱讀框無移碼的核酸編碼區(qū)之后的翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)，所述閱讀框是對(duì)前面的核酸編碼區(qū)而言的，該密碼子即是終止編碼區(qū)翻譯過程的。符合讀碼框的翻譯終止密碼子是可操縱的連接到前面的核酸編碼區(qū)的。術(shù)語"沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，，是指在指定的核酸里缺少翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)和/或可以在核酸內(nèi)部或其編碼區(qū)末端找到翻譯終止密碼子的存在，但是由于一個(gè)或兩個(gè)堿基對(duì)的移動(dòng)，在加工后的mRNA翻譯過程中不能被識(shí)別(即不符合讀碼框，不是可操縱的連接)，因此在翻譯過程中不能終止編碼區(qū)。本申請(qǐng)中指的"轉(zhuǎn)錄終止子"是50-750個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的DNA序列，它賦予RNA聚合酶終止mRNA合成的信號(hào)。非常有效的(強(qiáng))終止子在表達(dá)盒的3'端能可行的阻止RNA聚合酶從此讀過，尤其是當(dāng)使用強(qiáng)啟動(dòng)子的時(shí)候。無效的轉(zhuǎn)錄終止子，可導(dǎo)致形成操縱子樣的mRNA，其可能是不希望的(如質(zhì)粒編碼)的基因表達(dá)的原因。本申請(qǐng)中的"在前體mRNA加工過程中沒有組成性的移除"和"沒有組成性的從(對(duì)應(yīng))前體mRNA剪接掉，，是指在前體mRNA加工過程中沒有普遍發(fā)生的剪接加工，即核酸的特異內(nèi)含子只是有時(shí)在前體mRNA加工過程中被移除。結(jié)果是，得到兩個(gè)不同的成熟mRNA，其一有這個(gè)內(nèi)含子的至少部份而另一個(gè)沒有這個(gè)內(nèi)含子。該申請(qǐng)中所用的術(shù)語"GPI-錨定物"是指連接到多肽或蛋白質(zhì)C末端的翻譯后修飾。"GPI-錨定物，，有核心結(jié)構(gòu)，其包含至少一個(gè)磷酸乙醇胺殘基、三甘露糖苷(trimaimoside)、氨基葡萄糖殘基以及肌醇磷脂。盡管這樣核心結(jié)構(gòu)的GPI-錨定物通常擁有某微觀不均一性(microheterogeniety)，因而具有GPI-錨定物的蛋白質(zhì)通常是帶有相同核心結(jié)構(gòu)不同側(cè)鏈修飾的同源GPI-錨定物的蛋白質(zhì)混合物。術(shù)語"GPI-錨定物的信號(hào)肽"是指多肽或蛋白質(zhì)的C末端氨基酸序列，所述多肽或蛋白質(zhì)由GPI-錨定物連上的氨基酸、可選的間隔肽和疏水肽組成。幾乎所有的這種信號(hào)肽(即可選的間隔肽和疏水肽)都是由GPI-轉(zhuǎn)氨酶在翻譯后移除的，而且在GPI-錨定物的核心磷酸乙醇胺的氨基基團(tuán)與GPI-錨定物連接的氨基酸之間形成鍵。用異源核酸轉(zhuǎn)染后，表達(dá)異源核酸編碼的異源多肽的細(xì)胞被選出。為了選擇使用標(biāo)記。該標(biāo)記顯示了總體細(xì)胞中已成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并有利于選擇和分離這些細(xì)胞。可以使用不同的標(biāo)記，諸如，例如可選擇標(biāo)記，或如綠色焚光蛋白(GFP)的可檢測(cè)標(biāo)記。細(xì)胞的選擇可以單步執(zhí)行或通過多個(gè)步驟進(jìn)行。在單一/多重步驟的程序中，第一選擇可以基于如選擇標(biāo)記，例如可檢測(cè)標(biāo)記的閾值水平進(jìn)行。例如，對(duì)于通過流式細(xì)胞儀的選擇(如由流式細(xì)胞儀-熒光激活細(xì)胞分選)，設(shè)定熒光闞值水平，而細(xì)胞熒光超過這一閾值水平都被選中。或者，可以收集樣品總體細(xì)胞中熒光強(qiáng)度前1-15%的細(xì)胞(即具有最強(qiáng)檢測(cè)標(biāo)記的15。/。的細(xì)胞)、或前1-10%、或前1-5%、或前5-10%、或5-6%的細(xì)胞。另一種選擇細(xì)胞的方法是免疫結(jié)合，例如結(jié)合到以蛋白A或特定的免疫球蛋白包被的磁珠。所選欄的細(xì)胞可作為基本的總體進(jìn)行進(jìn)一步的選擇步驟，例如通過單細(xì)胞接種、培養(yǎng)和ELISA分析(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))，或通過有限稀釋克隆，或通過在選擇培養(yǎng)液的選擇性培養(yǎng)條件下培養(yǎng)數(shù)天以擴(kuò)大數(shù)量，并進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀選擇，或通過另外的具有更高閾值水平的流式細(xì)胞儀選擇，這可以例如，基于前述的流式細(xì)胞儀選擇中檢測(cè)的熒光強(qiáng)度，或通過免疫沉淀法(又見例如，WO2005/020924)。才艮據(jù)本發(fā)明選擇細(xì)胞，可以通過從以下方法集合中選取一種方法來進(jìn)行，包括流式細(xì)胞儀、ELISA法、免疫沉淀、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基于顯微鏡的分離方法或免疫結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案里，根據(jù)本發(fā)明選擇細(xì)胞，可以通過從以下方法集合中選取一種方法來進(jìn)行，包括流式細(xì)胞儀、ELISA法、免疫沉淀、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基于顯微鏡的分離方法或免疫結(jié)合，繼之以從以下集合中選取的方法，包括單細(xì)胞接種和培養(yǎng)、有限稀釋、或通過培養(yǎng)擴(kuò)大數(shù)量，繼之以從以下集合中選取的方法，包括流式細(xì)胞儀、免疫沉淀、免疫親和柱色譜法、磁珠免疫親和分選、基于顯微鏡的分離方法或ELISA。本領(lǐng)域/^知的轉(zhuǎn)染方法和載體的效率非常高，因此將得到很多轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，標(biāo)記是優(yōu)選的，其也允許將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)量與檢測(cè)的標(biāo)記"強(qiáng)度"相關(guān)聯(lián)。因此，它具有連接感興趣異源多肽的表達(dá)和標(biāo)記的表達(dá)的功能。本發(fā)明使用剪接(即選擇性剪接)的方法從相同核酸(即從相同表達(dá)盒)表達(dá)異源多肽和標(biāo)記，藉此例如沒有使用IRES。本發(fā)明的標(biāo)記是表達(dá)的異源多肽的質(zhì)膜結(jié)合的形式。本發(fā)明的可選擇標(biāo)記包含作為異源多肽的N末端部分和作為至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段或GPI-錨定物的C末端部分。因記)是同樣的。本發(fā)明包含選擇表達(dá)異源多肽的真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸從5，到3'的方向包含i)編碼異源多肽的笫一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包含適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體mRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成異源多肽，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA產(chǎn)生可溶的異源多肽和質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽的細(xì)胞使之成為所述表達(dá)異源多肽的細(xì)胞。在DNA轉(zhuǎn)錄過程中，得到了DNA的拷貝，稱之為前信使RNA(前體mRNA)。這個(gè)前體mRNA具有與模板DNA相同的構(gòu)造，即它有基因組的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。只有外顯子包含編碼多肽的氨基酸序列信息。因此，內(nèi)含子在翻譯之前需要從前體mRNA移除。此過程稱為RNA-剪接。"可剪接的核酸"其特征在于至少有5'剪接供體位點(diǎn)、3，剪接受體的位點(diǎn)、以及通常位于受體上游20-50個(gè)堿基所謂的分支點(diǎn)。這種結(jié)構(gòu)影響了RNA剪接過程中，從前體mRNA上的5'剪接供體位點(diǎn)到3'剪接受體位點(diǎn)的識(shí)別和切除核酸。在剪接步驟中，產(chǎn)生成熟的mRNA,多肽或蛋白質(zhì)是從其翻譯的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案里，至少有一個(gè)核酸，優(yōu)選第二核酸，是含有附加調(diào)控元件的可剪接核酸，所述附加調(diào)控元件例如符合讀碼框的終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)。但是剪接的過程不是唯一的。這是例如，可能內(nèi)含子在由前體mRNA開始的前體mRNA加工過程中未被移除，并且因此至少部分嵌入了成熟mRNA。如果符合讀碼框的終止密碼子在這個(gè)"可選的"包括在內(nèi)的內(nèi)含子中存在，翻譯將停止在這個(gè)終止密碼子，而且產(chǎn)生編碼多肽的變體。識(shí)別和切除內(nèi)含子往往由附加在前體mRNA的順式作用元件調(diào)控。由于他們的功能和位置，這些元件分別^f皮稱為外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ISE)或內(nèi)含子剪接沉默子(Black，D.L,，AnnuRevBiochem72(2003)291-336)。大多數(shù)真核基因的基因組DNA有內(nèi)含子-夕卜顯子結(jié)構(gòu)。舉例來說，編碼分泌形式的免疫球蛋白重鏈C末端結(jié)構(gòu)域的外顯子內(nèi)部(即分別為CH3或Ch4)是5'剪接供體位點(diǎn)。如果這個(gè)剪接供體位點(diǎn)在該重鏈前體mRNA加工過程中無效，在此外顯子之后的、其中包含終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)的內(nèi)含子，將至少有部分保留在成熟的mRNA里。然后mRNA翻譯為以CH3或CH4結(jié)構(gòu)域?yàn)槟┒说拿庖咔虻鞍字劓湥憩F(xiàn)為可溶免疫球蛋白。這是免疫球蛋白重鏈的基因在免疫球蛋白分泌細(xì)胞的主要加工途徑。如果這個(gè)剪接供體位點(diǎn)在該重鏈前體mRNA加工過程中有效，因此相連的內(nèi)含子和終止密碼子被移除。因而翻譯不會(huì)在免疫球蛋白重鏈C末端結(jié)構(gòu)域之后停止。此外，翻譯繼續(xù)進(jìn)行隨后的對(duì)編碼跨膜結(jié)構(gòu)域外顯子的剪接。這種對(duì)免疫球蛋白重鏈基因次要的加工途徑，產(chǎn)生在免疫球蛋白生產(chǎn)細(xì)胞表面出現(xiàn)質(zhì)膜-結(jié)合的免疫球蛋白形式。這一過程被稱為"選擇性剪接"，而在此過程中可選地移除掉的核酸(即內(nèi)含子)被稱為"選擇性剪接核酸"。如果編碼異源多肽或蛋白質(zhì)的核酸由/通過可選擇性剪接的核酸連接于編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段的核酸，或連接于編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸，即可選擇性剪接核酸位于這兩個(gè)核酸之間，并且藉此這三個(gè)核酸被可操縱連接，則表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)的兩個(gè)變體可溶性變體，即只包含多肽或蛋白質(zhì)的變體；質(zhì)膜-結(jié)合型變體，即包含多肽或蛋白質(zhì)以及跨膜結(jié)構(gòu)域或GPI-錨定物的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的核酸包含在表達(dá)盒內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案里，第一核酸在其3，末端沒有符合讀碼框的終止密碼子。在另一實(shí)施方案中，第一、第二和第三核酸是可操縱連接的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段。在另一實(shí)施方案中，第三核酸編碼GPI-錨定物信號(hào)肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案里，第一核酸編碼的多肽選自一組蛋白質(zhì)，其包含免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、生物活性多肽、它們的片段以及它們的融合多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸編碼至少免疫球蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的片段。更具體而言，本發(fā)明包含選擇表達(dá)免疫球蛋白重鏈的真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包含a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸從5，到3，的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的笫二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包含適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體mRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性免疫球蛋白重鏈和質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白重鏈，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白重鏈的細(xì)胞作為所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含選擇表達(dá)免疫球蛋白真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包括a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，該核酸包含免疫球蛋白輕鏈的第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒，所述第二表達(dá)盒從5，到3，的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包括適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體inRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈,其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性免疫球蛋白和質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白的細(xì)胞使之成為所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的選擇表達(dá)免疫球蛋白真核細(xì)胞的方法，藉此該方法包含a)用兩個(gè)核酸同時(shí)或相繼地轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，藉此一個(gè)核酸包含免疫球蛋白輕鏈的表達(dá)盒，而另一個(gè)核酸含有的表達(dá)盒從5，到3'的方向包含i)編碼免疫球蛋白重鏈的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，所述條件包含適于從所述核酸生產(chǎn)前體mRNA、適于所述前體mRNA加工、以及適于所述加工后mRNA翻譯成免疫球蛋白重鏈，其中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過選擇剪接所述前體mRNA，產(chǎn)生可溶性免疫球蛋白和質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白的細(xì)胞使之成為所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸編碼的跨膜結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案里，第二核酸包含僅一個(gè)5，剪接供體位點(diǎn)和僅一個(gè)3'剪接受體位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案里，第二核酸是天然存在的免疫球蛋白重鏈內(nèi)含子，繼之以編碼免疫球蛋白重鏈CH3或CH4域的外顯子，其中在所述內(nèi)含子中至少有50個(gè)連續(xù)的核苷酸被缺失。例如，對(duì)于在真核細(xì)胞中免疫球蛋白重鏈的重組表達(dá)，運(yùn)用了有基因組的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的核酸或僅含有編碼區(qū)(即cDNA)的核酸。在兩種情況下，編碼免疫球蛋白重鏈C末端結(jié)構(gòu)域的外顯子后面的核酸末端都有終止密碼子。此后，在基因組結(jié)構(gòu)中包含可選擇性剪接核酸和跨膜結(jié)構(gòu)域的隨后的內(nèi)含子和外顯子都被省略。因此，這樣的核酸只能得到可溶性免疫球蛋白重鏈。如果為了重組表達(dá)免疫球蛋白或其片段，至少部分保留免疫球蛋白重鏈基因的基因組結(jié)構(gòu)，即如果保留編碼C末端結(jié)構(gòu)域的外顯子之后的內(nèi)含子(即可選擇的可剪接核酸)和隨后的編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子，可能進(jìn)行選擇性剪接。在選擇性剪接事件中，3'端密碼子和編碼CH3或CH4結(jié)構(gòu)域外顯子的終止密碼子，將分別作為或隨同內(nèi)含子序列被移除，而替代產(chǎn)生不同的成熟mRNA,其中編碼區(qū)(即閱讀框)由附加保留的外顯子在其3，端延伸。這種mRNA被翻譯成C末端延長(zhǎng)的免疫球蛋白重鏈，其中包含由額外的3'外顯子編碼的額外跨膜結(jié)構(gòu)域或其片段。這種延長(zhǎng)的免疫球蛋白重鏈在免疫球蛋白組裝時(shí)摻入其中，產(chǎn)生了質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，用根據(jù)本發(fā)明的這種核酸，可以選擇轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生異源多肽的細(xì)胞。這種方法是普遍適用的，而且并不限于免疫球蛋白。為了實(shí)踐這種方法，將重組表達(dá)異源蛋白質(zhì)的核酸可操縱的連接到可選擇性剪接核酸，并且這種連接符合讀碼框，所述核酸沒有符合讀碼框的終止密碼子，化位點(diǎn)的免疫球蛋白。隨后的第三核酸也是可變的，并且可以從編碼跨膜結(jié)構(gòu)域或其片段的任何核酸以及編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的任何核酸中選擇。這些元件(即編碼多肽的核酸、可選擇性剪接核酸、核酸編碼跨膜結(jié)構(gòu)域或GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸)可以從不同的基因以及不同的生物體來選擇和組合。唯一的前提是，這三個(gè)核酸以這樣的方式相結(jié)合，使可選擇性可以被核糖體識(shí)別并且終止翻譯。一般而言，通過選擇性剪接，可選的，異源多肽可溶性形式C末端的小部分將或可能會(huì)^皮作為內(nèi)含子的部分由前體mRNA上移除。這個(gè)部分可選的包含了3，端密碼子、3，非編碼區(qū)、終止密碼子和分泌形式的多聚腺苷酸化信號(hào)。因此，起始于5，剪接供體位點(diǎn)和終止于3'剪接受體位點(diǎn)(其任選的被移除)的核酸與非選擇性加工變體的C末端重疊或可能重疊。因此，使用免疫球蛋白重鏈基因的基因組結(jié)構(gòu)至少部分保留的根據(jù)本發(fā)明的核酸，可以得到異源多肽的兩個(gè)變體，短的可溶性變體和長(zhǎng)的質(zhì)膜-結(jié)合型變體。在一個(gè)實(shí)施方案里，其中第一核酸編碼免疫球蛋白重鏈，包含第一核酸的所有外顯子、以及除一個(gè)之外全部的基因組結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白重鏈基因的內(nèi)含子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的片段或GPI-錨定物信號(hào)肽，藉此跨膜結(jié)構(gòu)域的片段是由單一的外顯子編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案里，該跨膜結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，由Ml-M2-外顯子融合編碼，即由沒有基因組的間隔內(nèi)含子的單一外顯子編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域由cDNA所編碼。通過往宿主細(xì)胞中引入免疫球蛋白重鏈基因的整體基因組結(jié)構(gòu)至少部分保留的核酸，得到一方面表達(dá)可溶性異源多肽，另一方面表達(dá)質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽的細(xì)胞。例如，為了取得兩種免疫球蛋白的變體，即實(shí)現(xiàn)選擇性剪接，不需要保留免疫球蛋白重鏈基因的整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)，即所有外顯子和內(nèi)含子。這只需要保持選擇剪接位點(diǎn)以功能性形式存在。"功能性剪接位點(diǎn)"是包含5'剪接供體位點(diǎn)和3'剪接受體位點(diǎn)的核酸序列，從而使居中的核酸序列由前體mRNA上切除。內(nèi)含子的識(shí)別和切除往往是由附加的順式作用元件在前體mRNA進(jìn)行調(diào)控的。由于功能和位置，這些元件分別被稱為外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ISE)或內(nèi)含子剪接沉默子(Black，D.L.，AnnuRevBiochem72(2003)291-336，并入以供參考)。為了選擇轉(zhuǎn)染后表達(dá)異源多肽的細(xì)胞可以使用不同的方法，例如但不限于，通過檢測(cè)生物學(xué)活性的光譜方法如，熒光、ELISA法和其衍生的方法，或通過使用獨(dú)立于這些活性的測(cè)定如，免疫印跡、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、或放射免疫法(使用識(shí)別并結(jié)合到異源多肽的抗體)。由于質(zhì)膜-結(jié)合型異源多肽除其C末端外，具有與可溶性異源多肽相同的氨基#列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此它可以用例如，與可溶性變體相同的抗體來測(cè)定。多肽的質(zhì)膜-結(jié)合型變體牢固的連接到表達(dá)它的細(xì)胞上。因此，質(zhì)膜-結(jié)合型變體可被作為標(biāo)記來分離已成功轉(zhuǎn)染表達(dá)異源多肽或蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白)的核酸的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白選自IgG、IgE和IgA組成的組。異源多肽的可溶性變體和異源多肽的質(zhì)膜-結(jié)合型變體的分子比例是從高于50:50至低于100:0，優(yōu)選從高于75:25至低于100:0。例如，如果真核細(xì)胞由根據(jù)本發(fā)明編碼免疫球蛋白的核酸轉(zhuǎn)染，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過外表出現(xiàn)質(zhì)膜-結(jié)合型免疫球蛋白來選擇。根據(jù)該發(fā)明的核酸是從5，到3，的方向包含異源多肽編碼區(qū)、選擇性剪接核酸和跨膜結(jié)構(gòu)域或其片段的編碼區(qū)或GPI-錨定物信號(hào)肽編碼區(qū)的核酸。更具體而言，本發(fā)明包含的核酸包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，b)起始于5，剪接供體位點(diǎn)并且終止于3，剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和c)第三核酸，其編碼i)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或ii)GPI-錨定物信號(hào)肽。在另外的實(shí)施方案中，i)選擇性剪接內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)的是位于編碼異源多肽的核酸正常終止密碼子的5，端，ii)第二核酸是選擇性剪接核酸，和iii)5'剪接位點(diǎn)并不是組成型的而只是在有時(shí)候使用，產(chǎn)生的正常加工后的異源多肽的分子比例，即可溶性多肽相對(duì)于選擇性加工的異源多肽(即質(zhì)膜-結(jié)合型多肽)的比例，從高于50:50至低于100:0。在一個(gè)實(shí)施方案里，第一核酸和第二核酸是可操縱的連接的，即第二核酸的翻譯終止密碼子與編碼多肽或其片段的第一核酸的閱讀框是在相同讀碼框的。可以通過選擇性剪接移除掉的核酸，是在編碼多肽至少一個(gè)片段的核酸之后，在編碼跨膜結(jié)構(gòu)域至少一個(gè)片段或編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸之前。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源多肽是融合多肽，其包含感興趣多肽的N末端和免疫球蛋白重鏈的CH3或CH4域或其變種的至少一個(gè)片段的C-末端。在一個(gè)實(shí)施方案里，核酸包含位于第一核酸和第二核酸和/或第二核酸和第三核酸之間的笫四核酸。就是說，第四核酸是位于例如笫二核酸之后(即3，剪接受體位點(diǎn)后)和第三核酸5，端之前。具有位于編碼異源多肽的核酸和編碼跨膜結(jié)構(gòu)域或編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸之間的選擇性剪接核酸，能夠表達(dá)異源多肽的兩種變體沒有跨膜結(jié)構(gòu)域或GPI-錨定物的異源多肽和有跨膜結(jié)構(gòu)域或GPI-錨定物的異源多肽。此異源多肽可以選自而不限于，例如激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、受體配體、受體的配體、其激動(dòng)劑或拮抗劑、細(xì)胞毒性試劑、抗病毒試劑、顯象劑、酶抑制劑、酶的激活劑或酶活性調(diào)節(jié)劑，如變構(gòu)物、免疫球蛋白、或其融合物或片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈多肽、或免疫球蛋白融合物。本發(fā)明可實(shí)踐于任何多肽、任何跨膜結(jié)構(gòu)域和任何GPI-錨定物信號(hào)肽，只要藉此嵌入了可選擇性剪接的核酸。更具體而言，起始于5'剪接供體位點(diǎn)和終止于3'剪接受體位點(diǎn)的核酸片段需要被適當(dāng)選擇。前面的多肽和隨后的跨膜結(jié)構(gòu)域或GPI-錨定物則可以自由選擇。本發(fā)明還包含核酸，該核酸包含a)第一多克隆位點(diǎn)，b)起始于5，剪接供體位點(diǎn)并且終止于3，剪接受體位點(diǎn)的可剪接核酸，其中i)所述可剪接核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和ii)所述可剪接核酸在前體mRNA加工過程中不會(huì)被組成性的移除，c)第二多克隆位點(diǎn)。能夠?qū)嵺`本發(fā)明，例如，但不限于，使用的第二核酸(即選擇性剪接核酸)，來自編碼以下基因的核酸C3b/C4b受體(l型補(bǔ)體受體)(Hourcade，D.等人，J.Exp.Med.168(1988)1255-1270)、人、雞、大鼠表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)(Callaghan，T.等人，Oncogene8(1993)2939-2948;Reiter，J,L.和Maihle，N.J.，Nuc.AcidsRes.24(1996)4050-4056;Petch，L.等人，Mol.CellBiol.10(1990)2973-2982)、免疫球蛋白(Ig)ous、y、ji重鏈(Zhang，K.等人，J.Exp.Med.176(1992)233-243;Rogers,J.E.等人，Cell20(1980)303-312;Milcarek,C.和Hall,B.，Mol.CellBiol.5(1985)2514-2520;Kobrin，B.J.等人，Mol.CellBiol.6(1986)1687-1697;Cushley,W.等人，Nature298(1982)77;Alt,F.W.等人，Cell20(1980)293-301;Peterson,M丄"GeneExp.2(1992)319-327)、人PLA2受體(Ancian，P.等人，J.Biol.Chem.270(1995)8963-8970)、雞Cek5(Con證，R.J.和Pasquale，E.B"Oncogene11(1995)2429-2438)、人FGFR(Johnson,D.E.等人，Mol.CellBiol.11(1991)4627-4634)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二核酸是免疫球蛋白的內(nèi)含子，其位于編碼CH3/CH4結(jié)構(gòu)域的外顯子和編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域片段的外顯子之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二核酸是來自編碼以下基因的核酸人(hu)免疫球蛋白(Ig)a(alpha)重鏈、人免疫球蛋白3(delta)重鏈、人免疫球蛋白s(epsilon)重鏈、人免疫球蛋白yl、y2、和y4(gamma)重鏈、人免疫球蛋白n(miu)重鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈a型、小鼠免疫球蛋白重鏈S型、小鼠免疫球蛋白重鏈s型、小鼠免疫球蛋白重鏈Yl型、小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)2A型、小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)2B型、小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)3型、和小鼠免疫球蛋白重鏈H型。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二核酸選自編碼以下基因的核酸組成的組人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白y3重鏈、人免疫球蛋白y4重鏈、人免疫球蛋白s重鏈(l)和人免疫球蛋白s重鏈(2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二核酸來自/選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白5重鏈、人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白n重鏈、小鼠重鏈a型、小鼠重鏈y(cè)l型、小鼠重鏈丫2B型、小鼠重鏈Y3型以及小鼠重鏈H型。可以實(shí)踐本發(fā)明，例如但不限于，在編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域片段的情形下，使用的第三核酸來自編碼以下基因的核酸C3b/C4b受體(l型補(bǔ)體受體)(Hourcade，D.等人，J.Exp.Med.168(1988)1255-1270)、人、雞、大鼠EGFR(Callaghan，T.等人，Oncogene8(1993)2939-2948;Reiter，J.L.和Maihle，N.J.，Nuc.AcidsRes.24(1996)4050-4056;Petch，L.等人，Mol.CellBiol.10(1990)2973-2982)、免疫球蛋白(Ig)a、￡、y、ji重鏈(Zhang，K.等人，J.Exp.Med.176(1992)233-243;Rogers,J.E.等人，Cell20(1980)303-312;Milcarek,C.和Hall，B.，Mol.CellBiol.5(1985)2514-2520;KobrinB.J.等人，Mol.CellBiol.6(1986)1687-1697;Cushley，W.等人，Nature298(1982)77;Alt,F.W.等人，Cell20(1980)293-301;Peterson,M丄"GeneExp.2(1992)319-327)、人PLA2受體(Ancian，P.等人，J.Biol,Chem.270(1995)8963-8970)、雞Cek5(Connor,R.J.和Pasquale，E.B"Oncogene11(1995)2429-2438)、人FGFR(Johnson,D.E.等人，Mol.CellBiol.11(1991)4627-4634)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人(hu)免疫球蛋白(Ig)a(alpha)重鏈、人免疫球蛋白8(delta)重鏈、人免疫球蛋白s(epsilon)重鏈、人免疫J求蛋白yl、y2、和y4(gamma)重鏈、人免疫球蛋白n(miu)重鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈a型、小鼠免疫球蛋白重鏈3型、小鼠免疫球蛋白重鏈s型、小鼠免疫球蛋白重鏈Yl型、小鼠免疫球蛋白重鏈Y2A型、小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)2B型、小鼠免疫球蛋白重鏈^型、和小鼠免疫球蛋白重鏈H型。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白y2重鏈、人免疫球蛋白y3重鏈、人免疫球蛋白y4重鏈、人免疫球蛋白s重鏈(l)和人免疫球蛋白s重鏈(2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三核酸選自編碼以下基因的核酸人免疫球蛋白5重鏈、人免疫球蛋白yl重鏈、人免疫球蛋白丫2重鏈、人免疫球蛋白p重鏈、小鼠重鏈a型、小鼠重鏈Yl型、小鼠重鏈y(cè)2B型、小鼠重鏈y(cè)3型以及小鼠重鏈p型。第三核酸除了可以選自編碼至少跨膜結(jié)構(gòu)域片段的核酸組，還可以選自編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸組。編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸組包含來自以下基因的編碼GPI-錨定物信號(hào)肽的核酸組人堿性二酯酶、乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶(腸道、肝及胎盤的)、CAMPATH-1抗原、癌胚抗原、CD55、CD59、CD90、接觸蛋白-1、E48抗原、葉酸受體A和B、GPI-錨定的蛋白p137、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3、mDIA相互作用蛋白、5'-核苦酸酶、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子；鼠的LY-6C抗原、LY-6抗原、5'-核苷酸酶、OX45抗原、干細(xì)胞抗原-2、血管細(xì)胞粘附分子-1、Qa淋巴細(xì)胞抗原2(Qa2);兔的海藻糖酶；大鼠來源的短蛋白聚糖蛋白、CD卯、磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、MRCOX-45抗原、5，-核普酸酶、胰腺分泌顆粒膜主要糖蛋白(pancreaticsecretorygranulemembranemajorglycoprotein)、T細(xì)胞表面蛋白R(shí)T6.2;酵母的DNA修復(fù)蛋白PHR1、糖磷脂錨定表面蛋白1;豬的淀粉樣前體蛋白、二肽酶；布氏錐蟲(ro;/w"仍o附"6mce/)不同的變體的表面蛋白質(zhì)、多環(huán)酸性重復(fù)蛋白(polycyclicacidicrepetitiveprotein);岡'J果錐蟲(7Vj^fl"os0/wflcowgo/ewse)變體來源的表面蛋白YNat1.1;雞來源的黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(melanotransferrin)、中性細(xì)胞粘附分子；來自石紋電鰩(7br/^^w"r附omto)的乙酰膽堿酯酶；倉(cāng)鼠來源的朊蛋白；牛來源的5，-核苷酸酶；粘液菌來源的膜蛋白GP64、前孢子特異性抗原；和魷魚來源的Sgpl、Sgp2。在表l中給出了根據(jù)本發(fā)明第二核酸的核酸序列的實(shí)例。在表2中給出的實(shí)例是，根據(jù)本發(fā)明第三核酸的核酸序列和根據(jù)本發(fā)明第三核酸核酸序列相應(yīng)的氨基酸序列的實(shí)例。在表3中列出的實(shí)例是，可選的第四核酸的核酸序列和根據(jù)本發(fā)明的第四可選核酸對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。表1列出了5'剪接供體位點(diǎn)、第二(可選擇性剪接)核酸和3'剪接受體位點(diǎn)。由于第二核酸的序列通常超過lkb，列在表l的序列被縮短，顯示第二核酸的約前100個(gè)和后100個(gè)核苷酸，其間由表示完整第二核酸總體大小的數(shù)字來分開。第二核酸的完全序列包含于序列列表給出的SEQIDNO。終止密碼子有下劃線。以包含前面的剪接供體位點(diǎn)的共有序列和由垂直線分開的第二核酸的最前6個(gè)核苷酸的格式給出剪接供體位點(diǎn)(又見例如，Zhang,M.Q.，HumanMol.Gen.7(1998)919-932)。同樣地，通過列出第二核酸的最后6個(gè)核苷酸和隨后的由垂直線分開的剪接受體位點(diǎn)共有序列給出剪接受體位點(diǎn)。緊隨垂直線之后(5，剪接供體位點(diǎn))和正好在垂直線之前(3，剪接受體位點(diǎn))的核苷酸是第二(可剪接)核酸的第一個(gè)和最后一個(gè)核苷酸。第二核酸的終止密碼子在表l中有下劃線。第二核酸可以是直接連接到編碼異源多肽的核酸，即第一核酸，或是有可選的小(9到21個(gè)堿基)間隔核酸序列。在一實(shí)施方案中，可選的間隔(第五)核酸是來自第二核酸在基因組上靠前的核酸，由此得到所述第二核酸。在表2中列出了編碼跨膜結(jié)構(gòu)域片段的核酸序列和GPI-錨定物信號(hào)肽的氨基酸序列的實(shí)例。這個(gè)序列可以直接在3'剪接受體位點(diǎn)之后或在其間有可選的間隔序列，即第四核酸。在表3中列出了第四核酸序列和第四核酸相應(yīng)的氨基*列的實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸包含在所述第二核酸和所述第三核酸之間的第四核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸包含在所述第一核酸和所述第二核酸之間的第五核酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三核酸得自與第二核酸i)相同的，或ii)不同的基因或生物體，即所述第三核酸不必要與所述第二核酸編組在同一基因組之中。序列是來自公開可獲得的基因組或數(shù)據(jù)庫(kù)(如人類基因組計(jì)劃，http:〃www.gdb.org/;小鼠基因纟且數(shù)據(jù)庫(kù)，http:〃www.informatics.jax.org/;SwissProt(http:〃www.expasy.org/sprot/)。其中沒有可獲得的注解，序列已由軟件ALOM預(yù)測(cè)或完成(見例如，Klein，P.等人，Biochim.Biophys.Acta787(1984)221-226)。在完整的跨膜結(jié)構(gòu)域的情況下，除了SwissProt給出的序列，括號(hào)內(nèi)的序列是通過ALOM預(yù)測(cè)的。在一個(gè)實(shí)施方案里，第二核酸是選自包含SEQIDNO:001、002、003、004、005、006、007、008、009、151、152、153、154、155、156、157、158、159、169、170、171、172、173的核酸組。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的笫二核酸是選自從SEQIDNO:001到SEQIDNO:009的核酸序列組。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二核酸選自包含SEQIDNO:002、003、156、157、170、171的核酸組。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的第三核酸或者該核酸的片段選自SEQIDNO:OIO到SEQIDNO:018的核酸序列組，和其編碼氨基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:069的核酸序列的核酸序列組。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的第三核酸或者其核酸片段選自SEQIDNO:010、011、012、013、014、015、016、017、018、160、161、163、164、165、166、167、168、174、175、176的核酸序列組，和其編碼氨基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:069和162的核酸序列的核酸序列組。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的第三核酸選自，或者其核酸片段選自SEQIDNO:011、012、165、166、175的核酸序列組，和其編碼氨基酸序列是SEQIDNO:019到SEQIDNO:036的核酸序列的核酸序列組。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的第三核酸選自，或者其核酸片段選自SEQIDNO:011、012、165、166、175的核酸序列組。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的第四核酸選自SEQIDNO:070到SEQIDNO:078的核^列組和其編碼氨基酸序列是SEQIDNO:079到129的核酸序列的核酸序列組，或所述第四核酸包含選自所述核酸序列組的核酸。蛋白質(zhì)剪接供體位點(diǎn)第二核酸(^T剪接核酸)'剪接受體位點(diǎn)人免疫球蛋白S重鏈<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表2:第三核酸和對(duì)應(yīng)第三核酸的氨基酸的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3:第四核酸和對(duì)應(yīng)第四核酸的氨基酸的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白重鏈而跨膜結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白重鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了表達(dá)免疫球蛋白，本發(fā)明的核酸與編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸一起被引入真核宿主細(xì)胞。這些核酸可以位于同一核酸或不同的核酸。本發(fā)明涵蓋包含本發(fā)明的核酸的載體以及包含本發(fā)明載體的真核細(xì)胞。#>據(jù)本發(fā)明的核酸所編碼的異源多肽的可溶性變體，可以由以下步驟來生產(chǎn)，包含用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞、在適合表達(dá)所述核酸所編碼多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞、以及從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或培養(yǎng)液中回收多肽。提供試劑盒用于根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞的制備。該試劑盒包含含有至少兩個(gè)多克隆位點(diǎn)和起始于5'剪接供體位點(diǎn)并終止于3'剪接受體位點(diǎn)的可剪接核酸的載體，其中i)所述核酸包含翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會(huì)被組成性移除。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是選自下面組成的組的細(xì)胞，包含CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、K652細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞和HEK細(xì)胞。接下來提供實(shí)例、序列表和圖以幫助對(duì)本發(fā)明的理解，其真正的范圍在所附權(quán)利要求書中闡明。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以對(duì)提出的過程進(jìn)行某些修改而不背離本發(fā)明的精神。圖1:slgG/mlgG表達(dá)載體(A)、slgG/mlgG表達(dá)載體pmlgGA-A(B)、和slgG表達(dá)載體plgG-A(C)的質(zhì)粒圖懵。所描繪載體元件在正文中有詳細(xì)說明。圖2:y鏈表達(dá)盒的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的示意圖。A:在表達(dá)載體pmlgG-A中yl鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)。約7.2kb的DNA片段顯示為一條黑線。用空方框和上文指明的名稱代表外顯子。用于IgG分泌形式p(A)sI和膜結(jié)合形式[p(A)mI的的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的位置用黑色條形顯示。內(nèi)含子的編號(hào)方式和3'UTR在下圖顯示。顯示了內(nèi)含子6中的I限制性位點(diǎn)和3，UTR內(nèi)突變的^/iI位點(diǎn)(在括號(hào)內(nèi))的相對(duì)位置。B:如A所描述的表達(dá)載體pmlgGA-A中約4.8kb雜合y1~t3~^4鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)。此外，圖表還顯示來自三個(gè)免疫球蛋白重鏈恒定y基因位點(diǎn)(IGHG1、IGHG3和IGHG4)的區(qū)域。圖3:在表達(dá)mlgG的克隆中，IgG的分泌和細(xì)胞表面信號(hào)的相關(guān)性。轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pmlgG-A(左)、pmlgGA-A(中)或作為對(duì)照的plgG-A(右)的六個(gè)獨(dú)立的Sp2/0-Ag14細(xì)胞克隆，在限定條件下培養(yǎng)48小時(shí)。流式細(xì)胞儀熒光強(qiáng)度的中值作為結(jié)合到質(zhì)膜的IgG的數(shù)量的測(cè)量，通過灰色的條形表示。在相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的分泌型IgG的濃度用黑色菱形代表。圖4:典型的FL1/FSC散點(diǎn)圖用于在FACS優(yōu)勢(shì)流式細(xì)胞儀上分選細(xì)胞(BD)。通道R1包含描述的在之前已通過FL1/FSC散點(diǎn)圖門控的活細(xì)胞群體的5.70/。。在分選過程中收集落入R1的細(xì)胞。圖5:比生產(chǎn)率的確定?？寺?B11、9B3和J5-H3在轉(zhuǎn)瓶里92個(gè)小時(shí)培養(yǎng)。A:細(xì)胞生長(zhǎng)。在開始轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)后的指定時(shí)間點(diǎn)，用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定每個(gè)克隆的細(xì)胞計(jì)數(shù)。B:IgG的生產(chǎn)。在指定時(shí)間點(diǎn)(如A中的)，通過蛋白A親和層析法在細(xì)胞培養(yǎng)上清中測(cè)定IgG的濃度。C:比生產(chǎn)率。條形圖表顯示了每個(gè)克隆平均的比生產(chǎn)率，這是從前六十九小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞計(jì)數(shù)和IgG測(cè)定計(jì)算出來的(參見表2和參見正文以了解更多詳情)。標(biāo)準(zhǔn)偏差用誤差棒指示。圖6:免疫熒光顯微鏡。表達(dá)分泌型slgG和膜結(jié)合型mlgG的克隆5B11(圖像l、4)、僅表達(dá)分泌型slgG的克隆J5-H3(圖像2、5)或未轉(zhuǎn)染的Sp2/0-Ag14細(xì)胞(圖像3、6)用細(xì)胞表面的IgG(圖像l-3)或胞內(nèi)IgG(圖像4-6)標(biāo)記，并且圖像記錄在Axiophot熒光顯微鏡。圖7:RNA印跡分析mRNA。A:用[a-"PI標(biāo)記的探針A(泳道l-3)或探針B(泳道4-6)雜交的RNA印跡的放射自顯影。在每個(gè)泳道里有分離自克隆5B11(泳道1、4)、克隆J5-H3(泳道2、5)或未轉(zhuǎn)染的Sp2/0-Ag14細(xì)胞(泳道3、6)的10pg總RNA，所述總RNA通過變性瓊脂糖凝膠電泳分離開并且轉(zhuǎn)移至尼龍膜。B:編碼膜結(jié)合型mlgG或分泌型slgG的重鏈的兩個(gè)mRNA亞型的示意圖。外顯子用方框表示。與探針A和B互補(bǔ)的區(qū)域用黑色條塊標(biāo)記。圖8:IgG的重鏈亞型的免疫印跡分析?？寺?B11(泳道1、4)、克隆J5-H3(泳道2、5)或未轉(zhuǎn)染的Sp2/0-Ag14細(xì)胞(泳道3、6)是根據(jù)堿性碳酸鹽提取法分別提取的(見正文)。免疫球蛋白來自包含膜整合蛋白的膜組分(泳道l-3)、或來自主要包含細(xì)胞可溶性內(nèi)容物的SN級(jí)份(泳道4-6)，所述免疫球蛋白通過蛋白A的下拉測(cè)定(pulldownassay)被純化，并且通過變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳被分離。在印跡(blotting)和用辣根過氧化物酶二抗標(biāo)記之后，重鏈可以由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯現(xiàn)出來。從而顯示出分泌型slgG重鏈(sIgGHC)和膜結(jié)合型mlgG重鏈(mlgGHC)。較低的欄顯示了上欄的印跡部分短膝光的情形。圖9:RNA印跡法印跡法分析mRNA。如圖7B所示的，[a-32P標(biāo)記的探針A(左欄)或探針B(右欄)雜交的RNA印跡法印跡的放射自顯影。在每個(gè)泳道里有分離自克隆1A1、1B6、1C5或1D1(泳道l-4)和克隆1D6、2D6、K02或K06(泳道6-9)的10ng總RNA，所述總RNA通過變性瓊脂糖凝膠電泳分離開來并且轉(zhuǎn)移至尼龍膜?？寺?27，，只表達(dá)slgG從而加入作為對(duì)照(泳道5、10)?？娠@示mlgG和sIgG亞型的重鏈mRNA。圖10:slgG/IgG-GPI表達(dá)載體plgG-GPI-B的質(zhì)粒圖i普。表格說明表l第二核酸的實(shí)例。表2第三核酸和對(duì)應(yīng)于第三核酸的氨基酸的實(shí)例。表3第四核酸和對(duì)應(yīng)于第四核酸的氨基酸的實(shí)例。表4在slgG/mlgG表達(dá)載體'pmlgG-A，的構(gòu)建體中，用于克隆和誘變的寡核苷酸引物表5基于在指數(shù)增長(zhǎng)階段的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算的四個(gè)不同的SPRs所確定的每個(gè)選定克隆的平均SPR。表6表4顯示，單細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板3周后，不同IgG濃度水平的克隆的分布，和通過ELISA對(duì)515mlgG-分選克隆和550對(duì)照克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清的分析。表7表5顯示，在第二輪篩選中，不同IgG濃度水平的克隆的分布。表8用CASYTT細(xì)胞計(jì)數(shù)器(SchSrfeSystems)確定每個(gè)克隆在搖瓶振蕩培養(yǎng)O、1、2、3、4和7天的細(xì)胞數(shù)。表9通過ELISA進(jìn)行的搖瓶振蕩培養(yǎng)10天的生產(chǎn)力測(cè)定。序列說明SEQIDNO:001第二核酸來自人免疫球蛋白5重鏈SEQIDNO:002第二核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:003第二核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:004第二核酸來自人免疫球蛋白n重鏈SEQIDNO:005第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈a型SEQIDNO:006第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:007第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈丫2B型SEQIDNO:008第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y3型SEQIDNO:009第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈p型SEQIDNO:010第三核酸來自人免疫球蛋白S重鏈SEQIDNO:Oil第三核酸來自人免疫球蛋白<yl重鏈SEQIDNO:012第三核酸來自人免疫球蛋白Y2重鏈SEQIDNO:013第三核酸來自人免疫球蛋白n重鏈SEQIDNO:014第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈oc型SEQIDNO:015第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:016第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y2B型SEQIDNO:017第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y3型SEQIDNO:018第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:019第三核酸來自人類的乙酰膽堿酯酶(AChE)SEQIDNO:020第三核酸來自人體腸道堿性磷酸酶SEQIDNO:021第三核酸來自人類肝臟堿性磷酸酶SEQIDNO:022第三核酸來源于人胎盤堿性磷酸酶SEQIDNO:023笫三核酸來自人CAMPATH-1抗原SEQIDNO:024第三核酸來自人癌胚抗原SEQIDNO:025第三核酸來自人CD55SEQIDNO:026第三核酸來自人CD59SEQIDNO:027第三核酸來自人CD卯SEQIDNO:028第三核酸來自人接觸蛋白-1SEQIDNO:029第三核酸來自人E48抗原SEQIDNO:030第三核酸來自人葉酸受體ASEQIDNO:031第三核酸來自人葉酸受體BSEQIDNO:032第三核酸來自人GPI錨定蛋白pl37SEQIDNO:033第三核酸來自人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3SEQIDNO:034第三核酸來自人MDIA作用蛋白SEQIDNO:035第三核酸來自人5'-核苷酸酶SEQIDNO:036第三核酸來自人尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子SEQIDNO:037第三核酸來自小鼠細(xì)胞表面蛋白LY-6C抗原SEQIDNO:038第三核酸來自小鼠LY-6抗原ThBSEQIDNO:039第三核酸來自小鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:040第三核酸來自小鼠OX45抗原SEQIDNO:041第三核酸來自小鼠干細(xì)胞抗原2SEQIDNO:042第三核酸來自小鼠血管細(xì)胞粘附分子1SEQIDNO:043第三核酸來自大鼠短蛋白聚糖SEQIDNO:044第三核酸來自大鼠CD90抗原SEQIDNO:045第三核酸來自大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖SEQIDNO:046第三核酸來自大鼠MRCOX45抗原SEQIDNO:047第三核酸來自大鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:048第三核酸來自大鼠胰腺分泌顆粒膜的主要糖蛋白GP2SEQIDNO:049第三核酸來自大鼠T細(xì)胞表面蛋白R(shí)T6.2SEQIDNO:050第三核酸來自酵母DNA損傷修復(fù)蛋白PHR1SEQIDNO:051第三核酸來自酵母糖磷脂錨定表面蛋白-lSEQIDNO:052第三核酸來自豬淀粉樣前體蛋白SEQIDNO:053第三核酸來自豬二肽酶SEQIDNO:054第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白ILTat1.1SEQIDNO:055第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT117aSEQIDNO:056第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT118aSEQIDNO:057第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT221SEQIDNO:058第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.1000BCSEQIDNO:059第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.5bSEQIDNO:060第三核酸來自布氏錐蟲布氏多環(huán)酸性重復(fù)蛋白SEQIDNO:061第三核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白TxTat1SEQIDNO:062第三核酸來自剛果錐蟲變體表面蛋白YNat1.1SEQIDNO:063第三核酸來自雞黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白SEQIDNO:064第三核酸來自雞神經(jīng)細(xì)胞粘附分子SEQIDNO:065第三核酸石紋電鰩乙酰膽堿酯酶SEQIDNO:066第三核酸來自倉(cāng)鼠朊蛋白SEQIDNO:067第三核酸來自牛5'-核苷酸酶SEQIDNO:068第三核酸來自粘液菌膜蛋白Gp64SEQIDNO:069第三核酸來自粘液菌前孢子特異性抗原SEQIDNO:070第四核酸來自人免疫球蛋白6重鏈SEQIDNO:071第四核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:072第四核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:073第四核酸來自人免疫球蛋白fi重鏈SEQIDNO:074第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈a型SEQIDNO:075第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈型SEQIDNO:076第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)2B型SEQIDNO:077第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)3型SEQIDNO:078第四核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈fi型SEQIDNO:079第四核酸來自人AChESEQIDNO:080第四核酸來自人腸道堿性磷酸酶SEQIDNO:081第四核酸來自人肝臟堿性磷酸酶SEQIDNO:082第四核酸來自人胎盤堿性磷酸酶SEQIDNO:083第四核酸來自人CAMPATH-1抗原SEQIDNO:084第四核酸來自人癌胚抗原SEQIDNO:085第四核酸來自人CD55SEQIDNO:086第四核酸來自人CD59SEQIDNO:087第四核酸來自人CD卯SEQIDNO:088第四核酸來自人接觸蛋白-lSEQIDNO:089第四核酸來自人E48抗原SEQIDNO:0卯第四核酸來自人葉酸受體ASEQIDNO:091第四核酸來自人葉酸受體BSEQIDNO:092第四核酸來自人GPI錨定蛋白pl37SEQIDNO:093第四核酸來自人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3SEQIDNO:094第四核酸來自人MDIA作用蛋白SEQIDNO:095第四核酸來自人S，-核苷酸酶SEQIDNO:096第四核酸來自人尿激酶纖維蛋白溶酶原激活因子SEQIDNO:097第四核酸來自小鼠細(xì)胞表面蛋白LY-6C抗原SEQIDNO:098第四核酸來自小鼠Ly-6抗原ThBSEQIDNO:099第四核酸來自小鼠5'-核苷酸酶SEQIDNO:100第四核酸來自小鼠OX45抗原SEQIDNO:101第四核酸來自小鼠干細(xì)胞抗原2SEQIDNO:102第四核酸來自小鼠血管細(xì)胞粘附分子1SEQIDNO:103第四核酸來自大鼠短蛋白聚糖SEQIDNO:104第四核酸來自大鼠CD90抗原SEQIDNO:105第四核酸來自大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖SEQIDNO:106第四核酸來自大鼠MRCOX45抗原SEQIDNO:107第四核酸來自大鼠5，-核苷酸酶SEQIDNO:108第四核酸來自大鼠胰腺分泌顆粒膜的主要糖蛋白的GP2SEQIDNO:109第四核酸來自大鼠T細(xì)胞表面蛋白R(shí)T6.2SEQIDNO:110第四核酸來自酵母DNA損傷修復(fù)蛋白PHR1SEQIDNO:111第四核酸來自酵母糖磷脂錨定表面蛋白-lSEQIDNO:112第四核酸來自豬淀粉樣前體蛋白SEQIDNO:113第四核酸來自豬二肽酶SEQIDNO:114第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白ILTatl.lSEQIDNO:115第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT117aSEQIDNO:116第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT118aSEQIDNO:117第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MIT221SEQIDNO:118第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.1000BCSEQIDNO:119第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白MITat1.5bSEQIDNO:120第四核酸來自布氏錐蟲多環(huán)酸性重復(fù)蛋白SEQIDNO:121第四核酸來自布氏錐蟲變體表面蛋白TxTat1SEQIDNO:122第四核酸來自剛果錐蟲變體表面蛋白YNat1.1SEQIDNO:123第四核酸來自雞黑素轉(zhuǎn)牽失蛋白SEQIDNO:124第四核酸來自雞神經(jīng)細(xì)胞粘附分子SEQIDNO:125第四核酸來自石紋電鰩乙酰膽堿酯酶SEQIDNO:126第四核酸來自倉(cāng)鼠朊蛋白SEQIDNO:127第四核酸來自牛5，-核苷酸酶SEQIDNO:128第四核酸來自粘液菌膜蛋白Gp64SEQIDNO:129第四核酸來自煤粘液菌前孢子特異性抗原SEQIDNO:130人免疫球蛋白重鏈恒定yl(IGHGl)基因，包含從CHI到CH3的外顯子，連同所有間隔的內(nèi)含子和鄰近的3'非編碼區(qū)。SEQIDNO:131由質(zhì)粒plgG-A編碼的恒定區(qū)，鏈的氨基酸序列。SEQIDNO:132寡核苷酸引物TM-fwlSEQIDNO:133寡核苷酸引物TM-rvlSEQIDNO:134寡核苷酸引物Ml-rvSEQIDNO:135寡核苷酸引物M2-fwSEQIDNO:136寡核苷酸引物TM-fw2SEQIDNO:137寡核苷酸引物TM-rv2SEQIDNO:138寡核苷酸引物mutSphl-lSEQIDNO:139寡核苷酸引物SphI-2seqIDNO:140人免疫球蛋白重鏈恒定y1(IGHG1)基因，包括帶有所有插入的內(nèi)含子的從CH1到M2的外顯子、在內(nèi)含子6中用于IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)、和含有用于IgGl質(zhì)膜結(jié)合形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3'UTR。SEQIDNO:141質(zhì)粒pmlgG-A編碼的短(sIgG)亞型的氨基酸序列。SEQIDNO:142質(zhì)粒pmlgG-A編碼的y-鏈恒定區(qū)的長(zhǎng)(mlgG)亞型的氛基^列SEQIDNO:143人IGHG1基因包括帶有所有插入的內(nèi)含子的從CH1到CH3的外顯子、內(nèi)含子6鄰近5'端的部分，所述部分包括用于免疫球蛋白分泌性形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。SEQIDNO:144質(zhì)粒pmlgGA-A編碼的？鏈恒定區(qū)的短(sIgG)亞型的氨基酸序列。SEQIDNO:145質(zhì)粒pmlgGA-A編碼的"鏈恒定區(qū)的長(zhǎng)(mIgG)亞型的氨基i^列。SEQIDNO:146從質(zhì)粒pmlgGA-B中移除的編碼序列。SEQIDNO:147質(zhì)粒plgG-GPI-B生成時(shí)插入的編碼序歹'J(人胎盤堿性磷酸酶的羧基端信號(hào)肽的氨基酸序列(NCBI登錄號(hào)M13077;核苷酸:1542—1643))。SEQIDNO:148，鏈表達(dá)盒恒定區(qū)的DNA序列，表達(dá)質(zhì)粒plgG-GPIB從CHI到3'UTR。SEQIDNO:149質(zhì)粒plgG-GPI-B編碼的，鏈恒定區(qū)slgG亞型的氨基酸序列。SEQIDNO:150，鏈恒定區(qū)的長(zhǎng)亞型的氨基酸序列，所述恒定區(qū)包含由質(zhì)粒plgG-GPI-B編碼的人胎盤堿性磷酸酶的羧基端信號(hào)肽。SEQIDNO:151第二核酸來自人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1SEQIDNO:152第二核酸來自小鼠表皮生長(zhǎng)因子受體SEQIDNO:153第二核酸來自人補(bǔ)體受體l(C3b/C4b)SEQIDNO:154第二核酸來自小鼠白細(xì)胞介素4受體SEQIDNO:155第二核酸來自人免疫球蛋白o(hù)t重鏈SEQIDNO:156第二核酸來自人免疫球蛋白￡重鏈(l)SEQIDNO:157第二核酸來自人免疫球蛋白Y3重鏈SEQIDNO:158第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈s型SEQIDNO:159第二核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈y(cè)2A型SEQIDNO:160第三核酸來自人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1SEQIDNO:161第三核酸來自小鼠表皮生長(zhǎng)因子受體SEQIDNO:162第三核酸來自人補(bǔ)體受體l(C3b/C4b)SEQIDNO:163第三核酸來自小鼠白細(xì)胞介素4受體SEQIDNO:164第三核酸來自人免疫球蛋白o(hù)t重鏈SEQIDNO:165第三核酸來自人免疫球蛋白e重鏈SEQIDNO:166第三核酸來自人免疫球蛋白重鏈SEQIDNO:167第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈s型SEQIDNO:168笫三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈Y2A型SEQIDNO:169第二核酸來自人白細(xì)胞介素4受體SEQIDNO:170第二核酸來自人免疫球蛋白s重鏈(2)SEQIDNO:m第二核酸來自人免疫球蛋白Y4重鏈SEQIDNO:172第二核酸來自鼠免疫球蛋白S重鏈SEQIDNO:m第.二核酸來自人免疫球蛋白￡重鏈(2)SEQIDNO:174第三核酸來自人白細(xì)胞介素4受體SEQIDNO:175第三核酸來自人免疫球蛋白y4重鏈SEQIDNO:176第三核酸來自小鼠免疫球蛋白重鏈S型實(shí)施例實(shí)施例1基因片段的克隆和真核slgG/mlgG表達(dá)載體的構(gòu)建a)slgG表達(dá)載體'pIgG-A，的構(gòu)建為表達(dá)對(duì)蛋白"A"有特異性的免疫球蛋白，構(gòu)建'pIgG-A，載體。其編碼免疫球蛋白的分泌形式并包含下列元件(見圖1C):1.人yl重鏈的轉(zhuǎn)錄單元，包含陽來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，畫合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序歹ij(Kozak，M.，NucleicAcidsRes.15(1987)8125-48)，-包含信號(hào)序列內(nèi)含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的可變的重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內(nèi)含子2，包括小鼠Ign增強(qiáng)子(JH3-JH4切換區(qū))與人免疫球蛋白重鏈恒定yl(IGHG1)基因相連，所述IGHG1基因包含從CH1到CH3帶有所有插入內(nèi)含子的外顯子、和含有IgGl分泌形式重鏈的多聚腺普酸化位點(diǎn)的毗鄰的3'非編碼區(qū)。重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列報(bào)道在SEQIDNO:130里。由質(zhì)粒plgG-A編碼的Y-鏈恒定區(qū)的氨基酸序列報(bào)道在SEQIDNO:131。2.人k輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元，包含-來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序列，-鼠免疫球蛋白輕鏈信號(hào)序列包含信號(hào)序列內(nèi)含子，誦對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的可變k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白k恒定(IGKC))基因相連的小鼠內(nèi)含子2Igk增強(qiáng)子，和-人IGKC基因3'非編碼區(qū)，包含多聚腺苷酸化位點(diǎn)。3.作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞選擇標(biāo)記的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄單元。4.來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，用于在大腸桿菌中質(zhì)粒的復(fù)制。5.在大腸桿菌賦予氨節(jié)青霉素抗性的p-內(nèi)酰胺酶基因。b)slgG/mlgG表達(dá)載體'pmlgG-A，的構(gòu)建人免疫球蛋白重鏈恒定yl(IGHG1)位點(diǎn)的5.2kb基因組片段包含外顯子CH3下游內(nèi)含子(內(nèi)含子6)的主要部分、外顯子Ml、外顯子Ml下游的內(nèi)含子(內(nèi)含子7)、外顯子M2、以及鄰近的包含膜結(jié)合形式的Yl鏈的多聚腺苷酸化信號(hào)的3'非編碼區(qū)(3'UTR)，所述片段可以使用PCR從人基因組DNA(羅氏診斷有限公司，Mannheim,德國(guó))擴(kuò)增，所述PCR使用擴(kuò)展長(zhǎng)模板PCR系統(tǒng)(ExpandLongTemplatePCRSystem)(羅氏診斷有限公司，德國(guó))和表4中指定的寡核苷酸引物。表4:用于克隆和誘變的寡核苷酸引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>*I位點(diǎn)的誘變所改變的核苷酸用小寫字體標(biāo)出。該擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)"人14號(hào)染色體的基因組重疊群(contig)"(NCBI登錄號(hào)NT_026437，反向互補(bǔ))的87203513-87208691核普酸。亞克隆PCR產(chǎn)物的測(cè)序與相應(yīng)的14號(hào)染色體序列比較，顯示了98%的同一性，所有的不同之處都在內(nèi)含子或3'非編碼區(qū)(3，UTR)。通過基于位點(diǎn)定向誘變的PCR、使用表2中指定的寡核苷酸引物，毀壞外顯子M2終止密碼子下游219bp的I限制性位點(diǎn)。此片段接著通過經(jīng)由I限制性位點(diǎn)克隆入免疫球蛋白yl鏈表達(dá)載體plgG-A，與內(nèi)含子6的5'側(cè)面部分相連接，從而得到完整基因組結(jié)構(gòu)的Yl鏈轉(zhuǎn)錄單元。通過亞克隆構(gòu)建真核表達(dá)載體'pmlgG-A，，所述載體編碼對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的分泌形式(sIgG)和膜結(jié)合形式(mlgG)。該質(zhì)粒包含以下組分(又見圖1A):1.前述提到的人y1重鏈的轉(zhuǎn)錄單元，組成為畫來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序列，-包含信號(hào)序列內(nèi)含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的可變重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內(nèi)含子2,其包含來自JH3-JH4切換區(qū)的小鼠Ign增強(qiáng)子(Banerji，J.等人，Cell33(1983)729-740;Gillies，S.D.等人，Cell,33(1983)717-728)，與人免疫球蛋白重鏈恒定yl(IGHG1)基因相連，所述IGHG1基因包含從CH1到M2的帶有所有插入的內(nèi)含子的外顯子、在內(nèi)含子6中用于IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)、和包含用于IgGl膜結(jié)合形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3'UTR。重鏈恒定區(qū)的基因組結(jié)構(gòu)在圖2A中有描繪，核苷酸序列報(bào)道在SEQIDNO:140中。由質(zhì)粒pmlgG-A編碼的，鏈恒定區(qū)的短(sIgG)亞型或長(zhǎng)(mlgG)亞型的氨基酸序列分別報(bào)道在SEQIDNO:141或SEQIDNO:142。2.人k輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元，包含-來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，國(guó)合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序列，-包含信號(hào)序列內(nèi)含子的鼠免疫球蛋白輕鏈信號(hào)序列，-對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的可變的k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白包含信號(hào)序列內(nèi)含子恒定(IGKC))基因相連的小鼠內(nèi)含子2Igk增強(qiáng)子(Emorine,L.等人，Nature304(1983)447-449;Picard，D.和Schaffner，W"Nature(1984)307，80-82)，和-人IGKC基因3'非編碼區(qū)，包含多聚腺苷酸化位點(diǎn)。3.新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄單元作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選擇標(biāo)記。4.來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，用于在大腸桿菌中質(zhì)粒的復(fù)制。5.在大腸桿菌賦予氨千青霉素抗性的p-內(nèi)酰胺酶基因。c)slgG/mlgG表達(dá)載體'pmlgGA-A，和'pmlgGA-B，的構(gòu)建人免疫球蛋白重鏈恒定y3(IGHG3)位點(diǎn)的l.lkb基因組片段包含外顯子CH3下游內(nèi)含子(內(nèi)含子6)的主要部分和外顯子Ml,用類似實(shí)施例lb)描述的方式，通過PCR擴(kuò)增所述片段(寡核苷酸見表2)。該擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)"人14號(hào)染色體的基因組重疊群"(NCBI登錄號(hào)NT—026437，反向互補(bǔ))的87235195-87236300核苷酸，序列同一性達(dá)到98%。除了外顯子M1里的一個(gè)沉默的單核苷酸變換，所有的不同之處都在內(nèi)含子中，因此并不改變編碼氨基酸序列。同樣，人免疫球蛋白重鏈恒定"(IGHG4)位點(diǎn)的1.6kb基因組片段可以由PCR擴(kuò)增出來(寡核普酸見表2),其包含外顯子M2和含有膜結(jié)合形式Y(jié)4鏈的多聚腺苷酸化信號(hào)的毗鄰的3，非翻譯區(qū)。該片段對(duì)應(yīng)著"人14號(hào)染色體的基因組重疊群"(NCBI登錄號(hào)NT—026437，反向互補(bǔ))的87087786-87089377核苷酸，序列同一性達(dá)到98%,并且所有的不同之處都在3，UTR。通過基于位點(diǎn)定向誘變的PCR，損壞外顯子M2終止密碼子下游212bp的I限制性位點(diǎn)。這兩個(gè)片段都通過PCR擴(kuò)增(寡核苷酸參見表2)加入在Ml和M2之間，并且接著通過在內(nèi)含子6中的S/;/iI位點(diǎn)克隆進(jìn)入免疫球蛋白yl鏈表達(dá)載體，因而得到具有缺少在Ml和M2之間的內(nèi)含子(內(nèi)含子7)的基因組結(jié)構(gòu)的雜合y1-y3-y4鏈表達(dá)盒。通過亞克隆構(gòu)建真核表達(dá)載體'pmlgGA-A，，所述載體編碼對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的分泌型slgG和膜結(jié)合型mlgG。質(zhì)粒包含以下組分(又見圖1B):1.前述的雜合Yl-y3l4重鏈轉(zhuǎn)錄單元，包含-來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序列，-包含信號(hào)序列內(nèi)含子的鼠免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-對(duì)蛋白質(zhì)"A，，有特異性的抗體的可變的重鏈的cDNA，-小鼠/人重鏈雜交內(nèi)含子2，包含與人IGHG1基因相連的小鼠Igp增強(qiáng)子(Jh3-Jh4切換區(qū))，所述IGHG1包含從CH1到CH3的帶有全部插入的內(nèi)含子的外顯子、用于IgGl分泌形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)、以及包含免疫球蛋白分泌形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的毗鄰的內(nèi)含子6的5'部分，-來自人IGHG3基因的內(nèi)含子6的3，部分和外顯子M1，和-外顯子M2和含有來自人IGHG4基因的免疫球蛋白膜結(jié)合形式的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3，非翻譯區(qū)。重鏈恒定區(qū)的基因組結(jié)構(gòu)在圖2B中有描繪，在SEQIDNO:143中報(bào)道核苷酸序列。由質(zhì)粒pmlgGA-A編碼的，鏈恒定區(qū)的短(sIgG)亞型或長(zhǎng)(mlgG)亞型的氨基酸序列分別報(bào)道在SEQIDNO:144或SEQIDNO:145。2.人K輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元，包含-來自人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即刻早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-合成的5'端非翻譯區(qū)，包含Kozak共有序列，-包含信號(hào)序列內(nèi)含子的小鼠免疫球蛋白輕鏈信號(hào)序列，-對(duì)蛋白"A"有特異性的抗體的可變的k鏈的cDNA，-與人免疫球蛋白k恒定(IGKC))基因相連的小鼠內(nèi)含子2IgK增強(qiáng)子，和畫人IGKC基因3'非編碼區(qū)，包含多聚腺苷酸化位點(diǎn)。3.新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄單元，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞選擇標(biāo)記。4.來自栽體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，用于在大腸桿菌中質(zhì)粒的復(fù)制。5.在大腸桿菌賦予氨千青霉素抗性的p-內(nèi)酰胺酶基因。通過交換編碼y和K鏈的可變區(qū)的cDNA序列，構(gòu)建出slgG/mlgG表達(dá)栽體'pmlgGA-B，。它具有與上面對(duì)pmlgGA-B所描述的相同構(gòu)造，但是加以替代的編碼對(duì)蛋白"B，，有特異性的抗體。實(shí)施例2Sp2/0-Ag14細(xì)l包的轉(zhuǎn)染和分析a)Sp2/0-Agl4細(xì)胞的培養(yǎng)和電穿孔Sp2/0-Ag14雜交瘤細(xì)胞(ATCCNo.CRL-1581,Shulman，M.等人，Nature276(1978)269-270)培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)液中(英杰公司(InvitrogenCorp.),美國(guó))，其中補(bǔ)充10。/。超低IgG胎牛血清(FCS)(英杰公司，美國(guó))和2mM谷氨酰胺(英杰公司，美國(guó))，在37。C、5%C02和95%的濕度下培養(yǎng)。在20mM的HEPES緩沖液(N-(2-羥乙基)-哌嚷-N'-2-乙烷磺酸)，pH7.0，包含137mMNaCl、5mMKC1、0.7mMNa2HP04和6mM葡萄糖，4。C的條件下，每106個(gè)細(xì)胞用IO網(wǎng)質(zhì)粒DNA電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。電穿孔在220V和960F條件下，用Genepulser電穿孔設(shè)備(Bio-RadLaboratories公司，美國(guó))進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞以每孔100jil培養(yǎng)液中5000個(gè)細(xì)胞的密度被分到96孔板中。為選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在電穿孔一天后往培養(yǎng)液里添加500ng/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國(guó))。每?jī)芍寥旄鼡Q一次培養(yǎng)液以維持選擇壓力。轉(zhuǎn)染后約兩個(gè)星期，從96孔板分出轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma)克隆，并且進(jìn)一步在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器里增殖。在含100/o二甲基亞砜(Sigma-Aldrich公司，德國(guó))的低IgG胎牛血清中(英杰公司，美國(guó))中對(duì)一個(gè)克隆約凍結(jié)106個(gè)細(xì)胞，并儲(chǔ)存在液氮中。每一組1()6個(gè)細(xì)胞，用質(zhì)粒pmlgG-A、pmlgGA-A和plgG-A轉(zhuǎn)染分別得到15、19和12個(gè)獨(dú)立的克隆。從每個(gè)轉(zhuǎn)染中隨機(jī)挑選了6個(gè)克隆作進(jìn)一步的分析。b)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行IgG定量和分析實(shí)施例2a)的每個(gè)克隆接種105個(gè)細(xì)胞于六孔板的2ml含有G418(如上文所述)的培養(yǎng)液中，并培育48小時(shí)。此后，收集上清并且通過按照廠商說明書使用'人Fc檢測(cè)試劑盒'(CIS國(guó)際生物)，通過均相時(shí)間分辨焚光(HTRF)免疫測(cè)定對(duì)分泌型IgG定量。為了用流式細(xì)胞儀分析質(zhì)膜-結(jié)合型抗體，每個(gè)克隆取105個(gè)細(xì)胞，在4。C用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗2次，然后重懸在50nlFITC-連接的鼠抗人IgG(Dianova,德國(guó))的F(ab，)2片段，按1:50稀釋在含有1%牛血清白蛋白(羅氏診斷有限公司，德國(guó))的PBS中，并在4。C黑暗條件下孵育一小時(shí)。在PBS洗2次后，細(xì)胞重懸在PBS中并且用BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)，美國(guó))進(jìn)行分析。對(duì)于每個(gè)克隆測(cè)定熒光強(qiáng)度的中值，作為對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面IgG數(shù)量的測(cè)量。圖3中，將每個(gè)克隆在流式細(xì)胞儀中熒光強(qiáng)度的中值，與其在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG濃度一起顯示。觀察到，對(duì)轉(zhuǎn)染pmlgG-A或pmlgGA-A的克隆(即編碼sIgG和mlgG兩種形式的質(zhì)粒)分泌型IgG數(shù)量的增加與升高的細(xì)胞表面信號(hào)相對(duì)應(yīng)。這種相關(guān)性在轉(zhuǎn)染pIgG-A(即只編碼sIgG、抗體分泌形式的質(zhì)粒)的克隆中觀察不到。實(shí)施例3用流式細(xì)胞儀分選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為了產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)IgG的克隆，將>106個(gè)Sp2/0-Ag14細(xì)胞用質(zhì)粒pmlgG-B由電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后一天，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到500ng/ml的G418選擇培養(yǎng)液并且作為庫(kù)培養(yǎng)約兩個(gè)星期。選擇后，結(jié)合到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表面的IgG被標(biāo)記并且通過流式細(xì)胞儀分選信號(hào)最強(qiáng)的細(xì)胞。因此，將來自庫(kù)的4xl(^個(gè)細(xì)胞在4。C用培養(yǎng)液洗2遍，然后與FITC-連接的鼠抗人IgG(Dianova，德國(guó))的F(ab，)2片段共同孵育，在培養(yǎng)液中1:50稀釋，冰上放置20分鐘。經(jīng)過兩步培養(yǎng)液的洗滌后，將細(xì)胞重懸在培養(yǎng)液中并轉(zhuǎn)移至BDFACSVantage流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)，美國(guó))。設(shè)定包含著樣本細(xì)胞群中焚光強(qiáng)度在前5-6%的細(xì)胞的門通道(圖4)，并且收集通過這個(gè)通道分選的細(xì)胞。在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)所收集的細(xì)胞數(shù)天以擴(kuò)增。用這些細(xì)胞進(jìn)行如上所述的第二和繼而第三分選循環(huán)。替代將分選細(xì)胞作為庫(kù)來收集的是，使用第四和最后一個(gè)分選步驟使單個(gè)細(xì)胞沉積在96孔板內(nèi)。該過程得到了141個(gè)獨(dú)立的克隆，從其中選出了21林克隆用于如實(shí)施例2b)所述通過HTRF免疫測(cè)定進(jìn)行的IgG抗體表達(dá)分析。從這些中選出的兩個(gè)克隆5B11和9B3顯示出最高的IgG分泌率和相應(yīng)最強(qiáng)的細(xì)胞表面信號(hào)，使該克隆適應(yīng)于轉(zhuǎn)瓶無血清生長(zhǎng)，以對(duì)其生產(chǎn)力進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。實(shí)施例4克隆的比生產(chǎn)率的測(cè)定為確定其比生產(chǎn)率，在確定的條件下培養(yǎng)克隆5B11和9B3，所述條件為在ProCH06k培養(yǎng)液(Cambrex公司，美國(guó))中，補(bǔ)充lx膽固醇/脂類濃縮物(英杰^^司，美國(guó))、4mM谷氨酰胺(英杰^^司，美國(guó))和250ng/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國(guó))、在100ml轉(zhuǎn)瓶(Belco，美國(guó))培養(yǎng)。細(xì)胞在37。C、5%(:02和95%的濕度下生長(zhǎng)，直到靜止的生長(zhǎng)期。在指數(shù)增長(zhǎng)階段的數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定每個(gè)克隆的細(xì)胞數(shù)，并且用蛋白A親和層析法測(cè)定上清中IgG的濃度(見下文)。作為參考，在同等條件下培養(yǎng)和分析克隆J5-H3。這個(gè)克隆也來自Sp2/0-Agl4轉(zhuǎn)染細(xì)胞，和穩(wěn)定表達(dá)與克隆5B11和9B3相同的抗體，雖然只有其分泌形式?？寺5-H3是通過常規(guī)的數(shù)次限制稀釋及亞克隆步驟所產(chǎn)生的，并從1000多個(gè)克隆篩選出來，以滿足工業(yè)制造過程的生產(chǎn)率的要求。細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG濃度是由使用AktaTMexplorer色傳單位(GE健康保健，formerAmersham生物科學(xué)，瑞典)的分析親和層析法來測(cè)定。將限定體積的細(xì)胞培養(yǎng)上清加入蛋白A凝膠柱，以促進(jìn)IgG結(jié)合到親和基質(zhì)上。所述柱用100mM，pH5.0的檸檬酸清洗兩遍，然后100mM，pH3.0的檸檬酸洗脫結(jié)合的抗體。用連續(xù)記錄的洗脫液在280nm的紫外吸收光諳監(jiān)控洗脫過程。在用含有確定抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品系統(tǒng)校準(zhǔn)后，從整合的紫外吸光值計(jì)算樣本的抗體濃度。通過下列公式從細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)上清的IgG濃度計(jì)算每一克隆的比生產(chǎn)率(SPR):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>崎G)其中-"/^(/^)"是指時(shí)間間隔開始和結(jié)束之間，在上清中IgG濃度的差異，以pg/ml沐示，-""T^T"是指時(shí)間間隔開始和結(jié)束時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)的算術(shù)平均數(shù)，以[細(xì)胞/mll表示，-""是指時(shí)間間隔的長(zhǎng)度[d，以[天l表示。每個(gè)克隆的平均SPR是基于在指數(shù)生長(zhǎng)階段的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算的四個(gè)不同的SPR來確定的(圖5和表5)。表5:比生產(chǎn)率的確定(SPR)。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>由膜結(jié)合型mlgG分選的5B11和9B3這兩個(gè)克隆，顯示出平均SPR在15和20pg.細(xì)胞".天"之間，這是在適合工業(yè)規(guī)模制造克隆的范圍內(nèi)。這些克隆的SPR可以與能夠從通過實(shí)驗(yàn)室常規(guī)策略在相同細(xì)胞系獲得的和表達(dá)相同抗體的克隆(克隆J5-H3)的SPR相比。實(shí)施例5用免疫熒光顯微鏡檢測(cè)slgG和mlgG通過免疫熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。為了進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，將附著于多聚賴氨酸涂層顯微鏡玻片的細(xì)胞用溶于PBS的2%(V/V)的甲醛固定10分鐘，用溶于PBS的2%(V/V)的TritonX-100通透IO分鐘，并且用PBS洗兩次。非特異性結(jié)合位點(diǎn)用溶于PBS的3。/。(w/V)的BSA(牛血清白蛋白)封閉30分鐘。用洗滌緩沖液(WB:0.2%(w/v)BSA、0.1%(v/v)Tween20溶于PBS)洗細(xì)胞兩次，然后與R-藻紅蛋白綴合的山羊抗人IgG(Dianova，德國(guó))的F(ab，)2片段孵育一小時(shí)，所述IgG是1:50稀釋在WB中。用WB洗涂四次和用雙重去離子水洗滌兩遍之后，把細(xì)胞封固在蓋玻片下，存放在4。C黑暗條件直到顯微鏡觀察。為了對(duì)細(xì)胞表面結(jié)合抗體染色，將105細(xì)胞用溶于PBS的冷的1%(w/v)BSA洗一遍，然后非特異性結(jié)合位點(diǎn)用溶于PBS的1%(w/V)的BSA冰上封閉30分鐘。為了標(biāo)記IgG,細(xì)胞與R-藻紅蛋白連接的羊抗人IgG(Dianova，德國(guó))的F(ab，)2片段冰上孵育一小時(shí)，所述IgG是1:50稀釋在PBS中。在用水PBS洗滌兩次之后，細(xì)胞附著于多聚-L-賴氨酸涂層的顯微鏡玻片，并且用溶于PBS的2。/。(V/V)的甲醛室溫固定10分鐘。用PBS清洗兩次后，將細(xì)胞封固在蓋玻片下，并且直到顯微鏡觀察之前都存放在4°C黑暗條件。應(yīng)用Plan-APOCHROMAT40x/1.0物鏡，在Axiophot焚光顯微鏡上分析(CarlZeiss,德國(guó))細(xì)胞內(nèi)和表面標(biāo)記的細(xì)胞。在克隆5B11中，可以在細(xì)胞表面(圖6，圖像l)以及細(xì)胞內(nèi)(圖4)檢測(cè)到主要是mlgG形式的抗體，這都是表達(dá)/分泌途徑的IgG形式。相比之下，在克隆J5-H3中，只可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)抗體(圖6，圖像2和5)，因?yàn)檫@林克隆不表達(dá)mlgG。在沒有轉(zhuǎn)染的Sp2/0-Ag14細(xì)胞系(圖6，圖像3和6)，用這兩種方法都，見察不到染色，因?yàn)檫@些細(xì)月包才艮本不表達(dá)IgG。實(shí)施例6通過RNA印跡檢測(cè)，鏈mRNA亞型為了界定通過原始轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接/多聚腺苷酸化形成的二個(gè)重鏈亞型之間的比例，用RNA印跡來分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆的RNA。因此，使用RNeasy技術(shù)(Qiagen，德國(guó))從細(xì)胞提取總RNA。在每個(gè)個(gè)案中，接著通過變性瓊脂糖凝膠電泳將10照的總RNA分離，并使用RNA印跡法Max系統(tǒng)(Ambion公司，美國(guó))轉(zhuǎn)移至尼龍膜。為了印跡膜的雜交，使用DECAprimeII試劑盒(Ambion公司，美國(guó))通過隨機(jī)引物法用[a-"P標(biāo)記兩種不同的DNA探針。如同圖7B所述，探針'A'與外顯子CH1和CH3之間的重鏈mRNA互補(bǔ)，因此同時(shí)能雜交至兩個(gè)亞型。相反，探針的'B，僅結(jié)合到長(zhǎng)mlgG重鏈mRNA的3'UTR。膜經(jīng)過雜交和嚴(yán)格的清洗之后，通過放射自顯影對(duì)其印跡進(jìn)行分析。圖7A代表用來自克隆5B11、克隆J5-H3和Sp2/0-Ag14細(xì)胞系的總RNA的RNA印跡的放射自顯影。用'A'探針的雜交顯示了在兩個(gè)抗體表達(dá)克隆(泳道1和2)中主要的1.8kb信號(hào)，其對(duì)應(yīng)于編碼slgG重鏈的短mRNA亞型的預(yù)期大小。在所描述的長(zhǎng)時(shí)間膝光里，在2和4kb之間也檢測(cè)到一些弱信號(hào)。3.3kb條帶僅在克隆5B11(泳道l)可見，代表了編碼mlgG重鏈的長(zhǎng)mRNA亞型，因?yàn)楫?dāng)用探針'B，(泳道4)雜交印跡時(shí)，會(huì)檢測(cè)到作為單一的信號(hào)的具有相同遷移模式的條帶。在泳道l中1.8kb和3,3kb條帶的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的比較，說明轉(zhuǎn)基因抗體重鏈的原始轉(zhuǎn)錄本主要加工為產(chǎn)生抗體slgG形式的小mRNA亞型。只有較小量(少于5%)完全被剪接成長(zhǎng)mRNA亞型，從而得到質(zhì)膜結(jié)合型mlgG。實(shí)施例7用堿性碳酸鹽提取和免疫印跡純化和檢測(cè)IgG重鏈亞型為了檢測(cè)mlgG重鏈，通過使用Fujiki本發(fā)明的堿性碳酸鹽提取方法從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取膜蛋白(Fujiki，Y.等人，J.CellBiol.93(1982)97-102)。在每個(gè)個(gè)案中，用PBS將107細(xì)胞洗兩次，然后在水上用0.1MNaCl洗一次。在懸浮于lml冷的0.1MpH11.5的Na2C03之后，通過超聲破碎20秒破壞細(xì)胞，在水上孵育30分鐘，然后在4。C以200000xg離心60分鐘。通過這一步，將仍含有整合膜蛋白的細(xì)胞膜與可溶性內(nèi)容物分離開。收集此上清并加入TritonX-100至終濃度為lD/。(w/v)、N-辛基-卩-D-葡萄糖苷至終濃度60mM、pH7.4的TRIS-HC1至終濃度50mM和NaCl至終濃度為300mM("SN組分")。從而，將膜顆粒溶解在1.1ml0.1MpH11'5的Na2C03、1%(w/v)的TritonX-IOO、60mM的N-辛基畫卩-D-葡萄糖苷、50mMpH7.4的TRIS-HC1和300mM的NaCl。在那一步驟之后，通過在15000xg離心10分鐘去除不溶性成分，收集其上清作為"膜組分"。進(jìn)行蛋白A的下^i實(shí)驗(yàn)以從膜或SN組分中純化抗體亞型。因此，每個(gè)組分與30^1床體積的蛋白A凝膠柱(GE健康保健，先前是Amersham生物科學(xué)，瑞典)在4。C孵育60分鐘，然后用含有0.02%(v/v)IgepalCA360的PBS洗4次。使結(jié)合到蛋白A基質(zhì)上的蛋白質(zhì)在70°C下通過還原蛋白質(zhì)凝膠樣品緩沖液被洗脫，以及通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(NuPAGE-系統(tǒng)，英杰公司，美國(guó))被分離。根據(jù)半干免疫印跡法(Ausubel，F(xiàn).A.等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻,JohnWiley和Sons,Inc.,NewYork(1995))將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。用連以辣根過氧化物酶的多克隆兔抗人IgG抗體(DakoCytomation，DAKOA/S，丹麥)標(biāo)記固定在膜的IgG重鏈，并且通過在LUMI-成像儀Fl(羅氏診斷有限公司)上的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(LUMI-增強(qiáng)發(fā)光免疫印跡試劑盒，羅氏診斷有限公司)檢測(cè)。在表達(dá)抗體的兩個(gè)克隆的膜和SN組分里都可以檢測(cè)出slgG重鏈的強(qiáng)信號(hào)(克隆5B11和J5-H3，參見圖8，泳道l、2、4和5)。在克隆5B11的個(gè)案中，檢測(cè)到遷移在slgG重鏈上方的額外蛋白質(zhì)(圖8，泳道l)。主要在這一克隆的膜組分中發(fā)現(xiàn)此條帶，所述組分中整合的膜蛋白被富集。其代表了較大的mlgG重鏈亞型，計(jì)算的分子量比slgG重鏈高8kDa。在克隆J5-H3中(圖8泳道2)始終沒有相應(yīng)的信號(hào)，因?yàn)榇丝寺〖兇獗磉_(dá)抗體的分泌型形式。實(shí)施例8CHO-K1細(xì)力包的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將已預(yù)先適應(yīng)在懸浮培養(yǎng)基中無血清生長(zhǎng)的CHO-K1細(xì)胞(ATCC號(hào)CCL-61;Puck，T.T.等人,J.Exp.Med.108(1958),945-956)培養(yǎng)在ProCH04-CDM培養(yǎng)液中(Cambrex公司，美國(guó))，補(bǔ)充8mML-丙氨酰-L陽谷氨酰胺(英杰^^司，美國(guó))和lx羥色胺(HT)補(bǔ)充物(英杰公司，美國(guó))，在37。C、5%<:02和95%濕度條件下在懸浮瓶培養(yǎng)。每3-4天將細(xì)胞以2xl05細(xì)胞/ml的密度分到新鮮培養(yǎng)液中。為了轉(zhuǎn)染，每7.5xl(^細(xì)胞用M^ig質(zhì)粒dna在總體積200h1的pbs中室溫下電穿孔細(xì)胞。此電穿孔用基因脈沖發(fā)生器XCell電穿孔裝置(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))在2mm間隙杯中進(jìn)行，應(yīng)用了單個(gè)160V脈沖15ms的方波操作流程。為了產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)IgG的克隆，6xl(f個(gè)細(xì)胞作為庫(kù)在以上指定的帶有700照/mlG41S培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩個(gè)星期左右(羅氏診斷有限公司，德國(guó))，所述G"S在轉(zhuǎn)染一天后加入用來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。實(shí)施例9用流式細(xì)胞儀分選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞選擇之后，標(biāo)記結(jié)合到轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面的IgG并且通過流式細(xì)胞儀分選帶有最強(qiáng)信號(hào)細(xì)胞的細(xì)胞。因此，來自庫(kù)的4xl(T個(gè)細(xì)胞首先通過40nm的尼龍網(wǎng)去除大細(xì)胞團(tuán)，然后與Accumax(PAA)在37。C孵育15分鐘，以分開留下的較小的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞在溶于培養(yǎng)液的1。/。(w/v)的BSA(見實(shí)施例8)中冰上孵育20分鐘，然后用10ng/ml蛋白AAlexaFluor488(分子探針公司，英杰7>司，美國(guó))，在總體積8ml1。/。(w/v)BSA中在冰上于黑暗中染色細(xì)胞30分鐘。通過帶有l(wèi)%(w/v)BSA的培養(yǎng)液兩步洗滌之后，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中并且轉(zhuǎn)移到BDFACSAria細(xì)胞分選儀(BD生物科學(xué)，美國(guó))。通過前散射/側(cè)散射(FSC/SSC)散點(diǎn)圖來門控活的單細(xì)胞群，亞群定義為包含門控的活細(xì)胞中熒光強(qiáng)度在前5%的細(xì)胞，從這個(gè)亞群收集了約45,000個(gè)細(xì)胞(mlgG-分選細(xì)胞庫(kù))。不論它們的熒光，隨機(jī)從FSC/SSC-選通活細(xì)胞群中收集約40,000個(gè)細(xì)胞作為對(duì)照(對(duì)照細(xì)胞庫(kù))。通過在選擇培養(yǎng)液(參見實(shí)施例8)培養(yǎng)兩個(gè)星期擴(kuò)增收集的細(xì)胞庫(kù)。接著進(jìn)行第二分選循環(huán)。如上文所述，對(duì)來自mlgG-分選細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞的細(xì)胞表面IgG染色。使用BDFACSAria細(xì)胞分選儀(BD生物科學(xué))從活的單細(xì)胞群中分選熒光強(qiáng)度前4%的細(xì)胞(由FSC/SSC散點(diǎn)圖門控)。將分選的細(xì)胞作為單個(gè)細(xì)胞收集到96孔板內(nèi)。隨機(jī)的從FSC/SSC門控的、未染色細(xì)胞群中收集來自對(duì)照細(xì)胞庫(kù)的單個(gè)細(xì)胞。在選擇培養(yǎng)液(參見實(shí)施例8)培養(yǎng)三周擴(kuò)增單細(xì)胞克隆。實(shí)施例10通過ELISA測(cè)定IgG濃度通過夾心ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的免疫球蛋白濃度，其中使用連有生物素的抗人IgG的F(ab，)2片段作為捕獲試劑和使用綴合過氧化物酶的抗人IgG的F(ab，)2抗體片段檢測(cè)。鏈霉親和素涂層的96孔板(皮爾森Reacti-BindTM鏈霉親和素涂層聚苯乙烯平板，貨號(hào)15121)用0.5ng/ml連有生物素的多克隆山羊抗人IgG的F(ab，)2抗體片段(F(ab，)2〈h-FrpBi;Dianova，德國(guó)，貨號(hào)109-066-098)捕獲抗體(0.1ml/孔)在稀釋緩沖液(稀釋緩沖液含0.5%重量體積比(w/v)的牛血清白蛋白的PBS緩沖液)中在室溫(RT)下?lián)u動(dòng)孵育一個(gè)小時(shí)。此后，用多于0.3ml的洗涂緩沖液(洗滌緩沖液含1%(w/v)的吐溫20的PBS)洗板3次。將含有IgG的細(xì)胞培養(yǎng)上清(樣本)系列稀釋(兩倍)達(dá)到在稀釋緩沖液中0.5-20ng/ml的濃度，加入孔中在室溫(RT)下?lián)u動(dòng)孵育一小時(shí)。稀釋緩沖液中純化的標(biāo)準(zhǔn)抗體(0.5-20ng/ml)用于IgG蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成。在用0.3ml/孔的洗滌緩沖液洗板3次后，用多克隆山羊抗人F(ab，)2-特異IgG(F(ab，)2<h-Fcr>POD;Dianova,德國(guó)，貨號(hào)109-036-098)的過氧化物酶連接的F(ab，)2片段可檢測(cè)結(jié)合到抗人Fq片段的結(jié)合復(fù)合物。之后用0.3ml/孔的洗滌緩沖液清洗板子3次，平板通過ABTS⑧(2，2，-連氮基-雙(3畫乙基苯并噻唑-6-磺酸)過氧化物酶底物溶液(羅氏診斷有限公司，德國(guó)，貨號(hào)168"02)顯影。10-S0分鐘后，以空白試劑(孵育緩沖液+ABTS溶液)為對(duì)照，在TecanSpectrafluorplus板閱讀器(TecanDeutschlandGmbH，德國(guó))測(cè)量405nm和4卯nm處的吸光度。根據(jù)下列公式，用在405nm處的吸光度減去490nm處的吸光度進(jìn)行背景校正<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該樣本的IgG成份。實(shí)施例11表達(dá)mlgG的CHO克隆的篩選和選擇單細(xì)胞沉積在96孔板三周后，通過ELISA分析515個(gè)mlgG-分選的克隆和550個(gè)對(duì)照克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清(參見實(shí)施例10)。表6顯示了不同IgG濃度水平的克隆的分布。表6:通過ELISA篩選96孔平板沉積的克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>觀察到，在對(duì)照方法中，所有克隆的百分之九十顯示為1pg/ml和低于ljig/ml的IgG的濃度。相反，沒有mlgG-分選克隆落入這個(gè)組。此外在這個(gè)方法中，有6個(gè)克隆達(dá)到高于22pg/ml的IgG濃度，然而在對(duì)照方法里，測(cè)出的最高IgG濃度為12.3^g/ml。接著將所有IgG濃度大于10ing/ml的mlgG-分選克隆和所有IgG濃度大于3pg/ml的對(duì)照克隆轉(zhuǎn)移至24孔平板做第二輪篩選。通過在選擇培養(yǎng)液(參見實(shí)施例8)培養(yǎng)20天使克隆過度生長(zhǎng)，然后用測(cè)定其細(xì)胞培養(yǎng)上清的IgG濃度。表7顯示了不同IgG濃度水平的克隆的分布。表7:通過ELISA篩選放入24孔板的克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>對(duì)照克隆顯示出平均6.1pg/ml的IgG濃度和高達(dá)16.8叫/ml的表達(dá)水平。對(duì)比之下，mlgG-分選克隆平均表達(dá)為31.4pg/ml，在這組中觀察到的克隆具有最高IgG濃度為58.9pg/ml。接著將六個(gè)IgG濃度大于45pg/ml的mlgG-分選克隆和兩個(gè)IgG濃度大于10ng/ml的對(duì)照克隆轉(zhuǎn)移到125ml搖瓶中作進(jìn)一步評(píng)估。實(shí)施例12選定的CHO克隆的生產(chǎn)力評(píng)估為了適應(yīng)搖動(dòng)，將實(shí)施例11中選定的克隆轉(zhuǎn)移到125ml搖瓶，在25ml選擇培養(yǎng)液中(參見實(shí)施例8)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，于150rpm轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上培養(yǎng)一周時(shí)間(參見實(shí)施例8)。此后，對(duì)于每個(gè)克隆，以lxl(^細(xì)胞/ml接種于25mlProCH05-CDM培養(yǎng)液(Cambrex公司，美國(guó))，補(bǔ)充8mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺(英杰公司，美國(guó))、lxHT的補(bǔ)充物(英杰公司，美國(guó))和400pg/ml的G418(羅氏診斷有限公司，德國(guó))，并在125ml搖瓶中進(jìn)行如前所述的培養(yǎng)。在第0、1、2、3、4、7天，由CASYTT細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Sch3rfeSystems,德國(guó))測(cè)定每個(gè)克隆的細(xì)胞計(jì)數(shù)，表明所有測(cè)試克隆的可比增長(zhǎng)(參見表8)。表8:搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)_<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在第十天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和通過ELISA測(cè)定IgG濃度。表9:通過ELISA對(duì)第IO天搖瓶培養(yǎng)的生產(chǎn)力測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>觀察到，六個(gè)mlgG-分選克隆里的三個(gè)(即克隆1A1、1B6和1D6)顯示在相當(dāng)于兩個(gè)對(duì)照克隆的范圍內(nèi)的表達(dá)水平。其他三個(gè)mlgG-分選克隆(即克隆1C5、1D1和2D6)顯示出明顯上升的IgG表達(dá)，其達(dá)到比對(duì)照克隆中觀察到的高3.3倍。實(shí)施例13選擇的CHO克隆的RNA雜交分析適應(yīng)于在搖瓶里生長(zhǎng)(參見實(shí)施例12)的六個(gè)mlgG分選克隆和兩個(gè)對(duì)照克隆，通過RNA雜交分析以確定在原始轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接形成的兩個(gè)重鏈亞型之間的比例。為了對(duì)比，對(duì)克隆，27，進(jìn)行平行分析。此克隆已由僅有同一抗體的分泌形式的基因組結(jié)構(gòu)的表達(dá)栽體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞而獲得。RNA印跡法如實(shí)施例6中詳細(xì)描述的進(jìn)行，并顯示在圖9中。實(shí)施例14slgG/IgG-GPI表達(dá)載體'pIgG-GPI-B，的構(gòu)建為了將免疫球蛋白錨定到質(zhì)膜，原有的由外顯子M1的3'部分編碼的跨膜結(jié)構(gòu)域以及由外顯子M2編碼的胞內(nèi)區(qū)，被介導(dǎo)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的人胎盤堿性磷酸酶的羧基端信號(hào)肽替代。因此，在質(zhì)粒pmlgGA-B(參見實(shí)施例lc)中的DNA序列編碼的下列53個(gè)氨基酸IRQGA(SEQIDNO:146)被由編碼下列人胎盤堿性磷酸酶(NCBI登錄號(hào)M13077;核苷酸1542-1643)羧基端信號(hào)肽的氨基酸序列的DNA序列所替代AGTTDAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP(SEQIDNO:147)。在SEQIDNO:148中給出"鏈表達(dá)盒恒定區(qū)的核酸序列，來自表達(dá)質(zhì)粒plgG-GPI-B的CHI到3'UTR。在SEQIDNO:149中給出質(zhì)粒plgG-GPI-B編碼的y-鏈恒定區(qū)的slgG亞型的相應(yīng)氨基酸序列。在SEQIDNO:150中給出y-鏈恒定區(qū)的長(zhǎng)亞型的相應(yīng)氨基酸序列，包括由質(zhì)粒plgG-GPI-B編碼的人胎盤堿性磷酸酶羧基端信號(hào)肽。這個(gè)質(zhì)粒允許表達(dá)由重鏈前體mRNA選擇性剪接的抗體的分泌形式(slgG)和GPI錨定形式(參見圖10)。權(quán)利要求1.核酸，其以5’到3’的方向包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的終止密碼子，b)起始于5’剪接供體位點(diǎn)和終止于3’剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，c)第三核酸，其編碼i)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或ii)GPI-錨定物的信號(hào)肽。2.包含根據(jù)權(quán)利要求1的核酸的真核細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2的真核細(xì)胞，其特征在于所述真核細(xì)胞選自由CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、K562細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞和HEK細(xì)胞組成的組。4.核酸，其以5，到3，的方向包含a)第一多克隆位點(diǎn)，b)起始于5，剪接供體位點(diǎn)和終止于3，剪接受體位點(diǎn)的核酸，其中i)所述核酸包含終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和ii)所述核酸在前體mRNA加工過程中不會(huì)被組成性移除，c)第二多克隆位點(diǎn)。5.選擇表達(dá)異源多肽的真核細(xì)胞的方法，由此該方法包含a)用核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述核酸以5，到3，的方向包含i)編碼異源多肽的第一核酸，該核酸沒有符合讀碼框的翻譯終止密碼子，ii)起始于剪接供體位點(diǎn)并且終止于剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，iii)第三核酸，其編碼iiia)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或iiib)GPI-錨定物的信號(hào)肽，b)在一定條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述條件包括適于從所述核酸產(chǎn)生前體mRNA、適于所述前體mRNA的加工、以及適于所迷加工后mRNA翻譯成多肽，其中所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過選擇性剪接所述前體mRNA產(chǎn)生可溶的異源多肽和質(zhì)膜-結(jié)合的異源多肽，和c)選擇具有質(zhì)膜-結(jié)合的異源多肽的細(xì)胞作為所迷表達(dá)異源多肽的細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述異源多肽選自的多肽組包含激素；細(xì)胞因子；白介素；免疫球蛋白；抗融合肽；生長(zhǎng)因子；受體的配體、激動(dòng)劑或拮抗劑；細(xì)胞毒性劑；抗病毒劑；顯象劑；酶抑制劑；酶的激活劑或酶活性調(diào)節(jié)劑，如變構(gòu)物；及其片段和融合物。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的任一項(xiàng)的方法，其特征在于i)所述第一核酸編碼至少免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結(jié)構(gòu)域的片段，ii)所述第二核,始于免疫球蛋白重鏈CH3或CH4結(jié)構(gòu)域外顯子的5，剪接供體位點(diǎn)和終止于繼之的免疫球蛋白重鏈跨膜結(jié)構(gòu)域外顯子Ml的3，剪接受體位點(diǎn)，iii)所述第三核酸至少是免疫球蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的片段。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6的任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第二核酸通過編碼多肽或蛋白質(zhì)的核酸獲得，所述多肽或蛋白質(zhì)選自的組包含C3b/C4b受體；人、雞和大鼠EGFR;FGFR;人和小鼠免疫球蛋白Iga、s、y、n重鏈；人PLAz受體；雞Cek5;和小鼠白血病抑制因子受體a-鏈。9.生產(chǎn)由根據(jù)權(quán)利要求l的核酸編碼的異源多肽或蛋白質(zhì)的方法，包括a)提供真核細(xì)胞，b)用根據(jù)權(quán)利要求l的核酸轉(zhuǎn)染所述真核細(xì)胞，c)在適合表達(dá)所述核酸的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，d)從培養(yǎng)液或細(xì)胞的胞質(zhì)中回收所述多肽或蛋白質(zhì)。10.制備根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求4的載體。全文摘要本發(fā)明描述了核酸，該核酸以5’到3’的方向包含a)編碼異源多肽的第一核酸，其沒有符合讀碼框的終止密碼子，b)起始于5’剪接供體位點(diǎn)和終止于3’剪接受體位點(diǎn)的第二核酸，其包含符合讀碼框的翻譯終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)，和c)核酸，其編碼i)至少跨膜結(jié)構(gòu)域的片段，或ii)GPI-錨定物的信號(hào)肽。文檔編號(hào)C12N15/82GK101410525SQ200780010828公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2007年5月15日優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日發(fā)明者E·科佩茨基,G·蒂分塔勒,J·恩德爾,O·普羅特奈爾,U·施瓦茨申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司