專(zhuān)利名稱(chēng)：促進(jìn)靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽和調(diào)控靶miRNA生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進(jìn)靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽和使用該兩親肽調(diào)控靶miRNA生產(chǎn)的方法。2.
背景技術(shù)：
將編碼的DNA翻譯成蛋白質(zhì)的RNA被稱(chēng)為信使RNA(mRNA)，其只占總RNA的2%。 剩下的RNA(98%)為非編碼的RNA。這些不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA被認(rèn)為是不重要的，并且它們的功能大多也是未知的。然而，已有這種非編碼RNA的重要功能報(bào)道，即通過(guò)和基因或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，或作為被稱(chēng)為核糖酶(ribozyme)的酶行使功能。目前，已有這些非編碼RNA通過(guò)特異性地與基因或基因產(chǎn)物互相作用的調(diào)控功能報(bào)道。因此，了解這些非編碼 RNA的不同功能和特征變得更為重要。這種小分子量非編碼RNA被稱(chēng)為內(nèi)源小RNA(miRNA) 或核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch)，其控制超過(guò)2%的所有基因的調(diào)控功能。最為公知的非編碼RNA為小RNA(miRNA)，在人類(lèi)中有大約700中不同的miRNA。 miRNA是一種單鏈的RNA分子，由19 25個(gè)核苷酸組成。miRNA產(chǎn)生于內(nèi)源的發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄本(Bartel,D. P. ,Cell 116 :281-297,2004 ；Kim,V. N.，Mol. Cells. 19 :1-15,2005)。miRNA 互補(bǔ)結(jié)合到靶mRNA上，作為轉(zhuǎn)錄后基因抑制子行使功能，導(dǎo)致翻譯被抑制，并且還降解 mRNA。也有報(bào)道認(rèn)為miRNA可能和癌癥有關(guān)。在一些報(bào)道中，一些miRNA已經(jīng)表現(xiàn)出與癌癥的發(fā)展或其代謝有關(guān)。因此，研究miRNA的功能正被認(rèn)為是癌癥生物學(xué)中新的和重要的領(lǐng)域(Esquela-kerscher，A et al. , Nat. Rev. Cancer 6(4) :259_269，2006)。此夕卜，miRNA 的表達(dá)水平在細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中變化很大。miRNA在發(fā)育系統(tǒng)和疾病狀態(tài)中的重要性已經(jīng)被 miRNA 表達(dá)譜圖(profiling)證實(shí)(Lu，J. et al. ,Nature 435 :834_838，2005)。研究表明，一種miRNA即let7a-l與肺癌或結(jié)腸癌有關(guān)，miR16_l與白血病或前列腺癌有關(guān)， miR24-l與白血病有關(guān)，而且let7a-l通過(guò)抑制RAS基因抑制一般的癌癥促進(jìn)基因因子。至于miR16-l，能通過(guò)抑制致癌因子Bcl2抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，發(fā)現(xiàn)一種能調(diào)控miRNA數(shù)量的方法和試劑將會(huì)是一種有效目標(biāo)治療藥物的候選方案(candidate)?？傊?，我們可以通過(guò)抑制引起目標(biāo)疾病的miRNA和激活抑制疾病的miRNA來(lái)促進(jìn)對(duì)疾病的抑制。在體內(nèi)有兩種酶與miRNA的生產(chǎn)有關(guān)。一種被稱(chēng)為Drosha，為細(xì)胞核內(nèi)的核酸內(nèi)切酶。第二種為Dicer，為細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)中的核酸內(nèi)切酶。這兩種酶為RNA水解酶， 無(wú)堿基序列的特異性。通過(guò)識(shí)別用于消化的雙鏈RNA的長(zhǎng)度，使它們具有有限的特異性。最初的miRNA (miRNA前體)通過(guò)細(xì)胞核中的RNaseIII型Drosha酶形成大約70 90個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)miRNA前體。然后，miRNA前體進(jìn)入到細(xì)胞溶質(zhì)，被Dicer酶切成更短的 21 25個(gè)核苷酸的miRNA，稱(chēng)為成熟miRNA。既然miRNA的生產(chǎn)受這兩種酶的調(diào)控，因此理解這兩種酶的特異性對(duì)于miRNA生產(chǎn)是非常重要目標(biāo)。如果靶miRNA引起如癌癥那樣的疾病，這兩種酶將可能是用于擴(kuò)增或減少引起疾病的miRNA的很好靶蛋白。特別地，細(xì)胞溶質(zhì)中加工miRNA的Dicer被認(rèn)為是重要的靶標(biāo)，因?yàn)樗稍诩?xì)胞溶質(zhì)中直接與靶mRNA互作。然而，Dicer的問(wèn)題在于該酶的加工是非特異性的，并且對(duì)miRNA前體的堿基序列無(wú)選擇性。另一個(gè)加工miRNA的酶Drosha具有與底物結(jié)合的分子伴侶(chaperon)蛋白質(zhì)， 因此，有助于使非特異的底物變得更為特異。然而，Dicer具有識(shí)別發(fā)夾狀底物的莖長(zhǎng)度的特異性，而對(duì)超過(guò)700種其它發(fā)夾狀內(nèi)源底物缺乏特異性識(shí)別的能力。在體內(nèi)，特異性地使 miRNA成熟的調(diào)控因子是很關(guān)鍵的，但到目前為止還沒(méi)有這類(lèi)調(diào)控因子的報(bào)道。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)能特異性地結(jié)合靶miRNA前體的配體開(kāi)展了大量的研究，而且該配體有助于通過(guò)添加人造元素誘導(dǎo)使對(duì)miRNA前體的堿基序列不特異的Dicer 酶產(chǎn)生特異性而生產(chǎn)成熟的miRNA。在研究過(guò)程中本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)取代在疏水區(qū)具有昭丨哚基的色氨酸而構(gòu)建的兩親肽與靶miRNA前體形成緊密的特異性互作。這種特異性互作促進(jìn)了 Dicer酶的活性，并特異性地增加了成熟miRNA的生產(chǎn)，由此完成了本發(fā)明。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供促進(jìn)靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽和調(diào)控靶miRNA生產(chǎn)的方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明提供一種包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫(kù)，其中，一個(gè)所述α螺旋肽含有4 12個(gè)Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個(gè)或多個(gè)亮氨酸殘基被Try (色氨酸，W)取代。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)與發(fā)夾狀靶miRNA前體特異性結(jié)合的兩親肽的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫(kù)；2)合成發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA前體；3)混合兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍?，測(cè)定兩親肽結(jié)合miRNA前體的結(jié)合親和力；以及4)篩選結(jié)合靶miRNA前體的結(jié)合親和力大于結(jié)合非靶miRNA前體的結(jié)合親和力的兩親肽。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)與兩親肽特異性地結(jié)合的miRNA前體的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫(kù)；2)合成待檢測(cè)的發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA 前體以篩選所述兩親文庫(kù)；3)混合兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍螅瑴y(cè)定miRNA 前體結(jié)合兩親肽的結(jié)合親和力，以及4)篩選結(jié)合兩親肽的結(jié)合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)增加靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫(kù)；2)培養(yǎng)用兩親肽處理后的細(xì)胞系；3)測(cè)定細(xì)胞系的靶miRNA的表達(dá)水平；
4)篩選與未處理對(duì)照組相比，增加靶miRNA表達(dá)水平的兩親肽。本發(fā)明還提供一種促進(jìn)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的組合物，該靶miRNA用上述方法篩選，所述方法包括作為活性化合物的兩親肽。本發(fā)明還提供一種促進(jìn)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的方法，該靶miRNA用上述方法篩選，所述方法包括給受試者施用兩親肽。本發(fā)明還提供一種用于因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑，該靶miRNA用上述方法篩選，所述治療藥物或診斷試劑包括作為活性化合物的兩親肽。本發(fā)明還提供制備用于促進(jìn)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的組合物中兩親肽的應(yīng)用，該兩親肽用上述方法篩選。本發(fā)明還提供制備用于因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑中兩親肽的應(yīng)用，該兩親肽用上述方法篩選。另外，本發(fā)明提供促進(jìn)靶miRNA 前體體外加工的方法，包括1)體外用miRNA前體處理上述方法篩選的的兩親肽；以及2)使所述兩親肽和靶miRNA前體結(jié)合。


從下述的詳細(xì)說(shuō)明并結(jié)合所附的附圖，將更加清楚地理解本發(fā)明上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中圖1所示為通過(guò)M-fold預(yù)測(cè)的兩種miRNA前體pre-let7a_l (a)和 pre-miR16-l (b)的二級(jí)結(jié)構(gòu)視圖。圖2所示為在肽2b、2c或Ie存在下，Dicer將miRNA前體轉(zhuǎn)化為成熟miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化初始反應(yīng)速率(V。)圖表。圖3所示為在不同濃度的肽2b下，Dicer將miRNA前體轉(zhuǎn)化為成熟miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化初始反應(yīng)速率(V。)圖表。圖4所示為通過(guò)Northern印跡方法測(cè)定的在肽2b、2c或Ie存在下生產(chǎn)的成熟 miRNA含量圖表。發(fā)明詳述通過(guò)下面優(yōu)選的參考所附附圖的實(shí)施方案，將更加清楚地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)。首先應(yīng)當(dāng)注意，基于發(fā)明人可以恰當(dāng)?shù)囟x術(shù)語(yǔ)的概念以最佳地描述其自己的發(fā)明的原則，本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)和詞語(yǔ)應(yīng)當(dāng)被解釋成與本發(fā)明的技術(shù)精神一致的含義或概念。另外，還應(yīng)當(dāng)理解，為不對(duì)本發(fā)明的重要內(nèi)容產(chǎn)生不必要的混淆，與本發(fā)明有關(guān)的公知功能和結(jié)構(gòu)的詳述說(shuō)明將被省略。以下，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明提供一種包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫(kù)，其中，一個(gè)所述α 螺旋肽含有4 12個(gè)Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個(gè)或多個(gè)亮氨酸殘基被 Try (色氨酸，W)取代。所述兩親肽文庫(kù)優(yōu)選含有一種或多種兩親肽，所述兩親肽的氨基酸序列為一個(gè)或兩個(gè)疏水氨基酸亮氨酸(L)和親水氨基酸賴(lài)氨酸(K)或甘氨酸(G)交替排列，其中兩個(gè)賴(lài)
6氨酸(K)被兩個(gè)色氨酸(T)取代，但不限于此。所述兩親肽文庫(kù)優(yōu)選含有一種或多種肽，所述肽含有一個(gè)或多個(gè)具有SEQ ID NO 2-SEQ ID NO :9或SEQ ID N0:12_SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的肽，更為優(yōu)選的是，所述肽含有具有一個(gè)或多個(gè)SEQ ID N0:12-SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的肽，最為優(yōu)選的氨基酸序列如SEQ ID NO 13,16和18所示，但不總是限于此。所述兩親肽文庫(kù)優(yōu)選與發(fā)夾狀miRNA前體特異地結(jié)合，并通過(guò)Dicer酶激活miRNA 前體的加工而誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟的miRNA (小RNA)，但不限于此。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l ；但不限于此。為了由賴(lài)氨酸(L)、亮氨酸(K)和甘氨酸(G)組成的α螺旋兩親肽制備一種與發(fā)夾狀靶miRNA前體特異地結(jié)合的肽，所述兩個(gè)疏水氨基酸亮氨酸(L)被具有吲哚基并能與 RNA堿基互作的色氨酸(W)取代。構(gòu)建了篩選文庫(kù)(scanning library)(見(jiàn)表1)用于鑒定對(duì)于促進(jìn)強(qiáng)且特異地結(jié)合有重要作用的色氨酸位點(diǎn)。通過(guò)熒光各向異性方法測(cè)定第一代肽對(duì)pre-let7a-l和 pre-miR16-l的結(jié)合親和力，所述的肽通過(guò)將亮氨酸替換成色氨酸而構(gòu)建(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明，當(dāng)兩親肽(SEQ ID NO 1)的1#或14#的亮氨酸被色氨酸取代時(shí)，對(duì) miRNA前體的結(jié)合親和力顯著提高。每個(gè)末端被色氨酸取代的兩親肽增加了對(duì)miRNA的結(jié)合親和力。然而，對(duì)靶miRNA前體結(jié)合特異性的增加卻沒(méi)有效果(見(jiàn)表3)。因此，含有一個(gè)色氨酸取代的兩親肽表現(xiàn)出結(jié)合親和力的增加，但并非選擇性維持不變。基于第一代肽，亮氨酸篩選文庫(kù)，本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了第二代肽文庫(kù)，含有2個(gè)色氨酸取代。為了使兩親肽具有結(jié)合親和力和特異性，1位或14位的亮氨酸被色氨酸取代并且中間結(jié)構(gòu)域的6個(gè)亮氨酸中的一個(gè)被色氨酸取代(表4)。使用熒光各向異性方法測(cè)定第二代肽對(duì)pre-let7a-l和pre-miR16_l結(jié)合親和力，肽沘對(duì)pre-let7a_l的結(jié)合能力最強(qiáng)。肽2b和2c對(duì)pre-miR16-l的結(jié)合能力為第一和第二強(qiáng)(表5)。通過(guò)解離常數(shù)計(jì)算出鑒別比，肽2b對(duì)pre-let7a-l的結(jié)合親和力最強(qiáng)。然而，肽2b對(duì)其它發(fā)夾狀miRNA前體的結(jié)合能力相對(duì)較弱，具有較高的鑒別比11。肽加能強(qiáng)且特異地結(jié)合pre-miR16-l，鑒別比為2.3。肽2g能強(qiáng)且特異地結(jié)合pre-miR124-l，鑒別比為2.3表明了識(shí)別的特異性。兩個(gè)亮氨酸殘基被色氨酸取代，這種含有兩個(gè)色氨酸的肽能與靶miRNA強(qiáng)且特異地互作。為了研究肽2b和肽2c對(duì)Dicer酶活性的影響，本發(fā)明的發(fā)明人在肽2b或2c存在下，通過(guò)處理同位素標(biāo)記的miRNA前體、pre-let7a-l或pre-miR16-l，由反應(yīng)產(chǎn)物的量測(cè)定了初始反應(yīng)速率。結(jié)果表明，和未處理組相比，用肽2b和2c處理的組加速了 Dicer將 miRNA加工成成熟的miRNA。尤其是，當(dāng)pre-let7a-l和2b互作時(shí)，顯著增加了成熟miRNA的生產(chǎn)(見(jiàn)圖幻，表明肽和miRNA前體之間有強(qiáng)且特異的結(jié)合。另外，當(dāng)我們研究成熟miRNA 的生產(chǎn)與肽2b濃度的關(guān)系時(shí)，在初始反應(yīng)響應(yīng)中有取決于2b濃度的改變，而且在濃度大于 IOOnM時(shí)反應(yīng)有一個(gè)迅速的增加(見(jiàn)圖3)。為了在細(xì)胞水平研究所述肽通過(guò)激活Dicer酶活性而增加成熟miRNA生產(chǎn)的效果，本發(fā)明的發(fā)明人用肽2b或2c處理結(jié)腸癌細(xì)胞株，通過(guò)Northern印跡對(duì)成熟miRNA生產(chǎn)的量進(jìn)行了定量。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞用所述肽處理后，增加了靶miRNA的生產(chǎn)。當(dāng)用已被證明對(duì)pre-let7a-l有特異性結(jié)合親和力的2b處理后，成熟的let7a_l有顯著的增加(見(jiàn)圖4)。這些發(fā)現(xiàn)表明，特異地結(jié)合到miRNA前體的肽能特異性地誘導(dǎo)成熟靶miRNA的生產(chǎn)。因此，含有兩個(gè)色氨酸殘基的所述兩親肽文庫(kù)能有效地用于促進(jìn)靶miRNA的生產(chǎn)。本發(fā)明提供一種檢測(cè)與發(fā)夾狀靶miRNA前體特異性結(jié)合的兩親肽的方法，其包括1)制備所述的兩親肽文庫(kù)；2)合成發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA前體；3)混合兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍?，測(cè)定所述兩親肽對(duì)miRNA前體的結(jié)合親和力，以及4)篩選對(duì)靶miRNA前體的結(jié)合親和力大于對(duì)非靶miRNA前體的結(jié)合親和力的兩親肽。根據(jù)上述的方法，步驟2)中的miRNA前體選自下組pre-let-7a_l、pre-miR16_l 和pre-miRM-1，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟幻中的探針?lè)肿訛楹袩晒獠⒈粯?biāo)簽標(biāo)記的化合物，其與兩親肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟幻中的結(jié)合親和力通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方法的熒光各向異性測(cè)定，但不限于此。為了獲得強(qiáng)且選擇性地結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體，本發(fā)明的兩親肽含有兩個(gè)具吲哚基團(tuán)的色氨酸殘基，增加了對(duì)形成發(fā)夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合。特異的結(jié)合親和力促進(jìn)了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產(chǎn)。因此，改變兩親肽的兩親特性將會(huì)是一種用于檢測(cè)與靶miRNA前體特異性強(qiáng)結(jié)合的肽的有用方法。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)與兩親肽特異性結(jié)合的miRNA前體的方法，其包括1)制備所述兩親肽文庫(kù)；2)合成待檢測(cè)的發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA 前體以篩選兩親文庫(kù)；3)混合所述兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍?，測(cè)定 miRNA前體結(jié)合兩親肽的親和力，以及4)篩選對(duì)兩親肽的結(jié)合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA。根據(jù)上述的方法，步驟幻中的探針?lè)肿訛楹袩晒獠⒈粯?biāo)簽標(biāo)記的化合物，其與兩親肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟幻中的結(jié)合親和力通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方法的熒光各向異性測(cè)定，但不限于此。為了獲得強(qiáng)且選擇性地結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體，本發(fā)明的兩親肽含有兩個(gè)具吲哚基團(tuán)的色氨酸殘基，以增加對(duì)形成發(fā)夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合。特異的結(jié)合親和力促進(jìn)了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產(chǎn)，因此，可用于檢測(cè)作為兩親肽目標(biāo)的miRNA。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)增加靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽的方法，其包括1)制備所述兩親肽文庫(kù)；2)培養(yǎng)用所述兩親肽處理后的細(xì)胞系；
3)測(cè)定所述細(xì)胞系的靶miRNA的表達(dá)水平；4)篩選與未處理對(duì)照組相比，促進(jìn)靶miRNA表達(dá)水平的兩親肽。優(yōu)選的是，兩親肽特異地結(jié)合發(fā)夾狀小RNA前體(pre-miRNA)，因此，通過(guò)激活 Dicer酶促進(jìn)了成熟小RNA(miRNA)的生產(chǎn)，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟2)中的細(xì)胞系優(yōu)選為結(jié)腸癌細(xì)胞系，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟3)中的miRNA選自下組pre-let-7a_l、pre-miR16_l和 pre-miRM-1，但不限于此。根據(jù)上述的方法，步驟幻中的表達(dá)水平為選自下組=Northern印跡、RT-PCR和微陣列，但不限于此。為了獲得強(qiáng)且選擇性地結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體，本發(fā)明的兩親肽含有兩個(gè)具吲哚基團(tuán)的色氨酸殘基，以增加對(duì)形成發(fā)夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合。特異的結(jié)合親和力促進(jìn)了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產(chǎn)。因此，改變兩親肽的兩親特性將會(huì)是一種用于檢測(cè)強(qiáng)且特異地結(jié)合靶miRNA前體的肽的有用方法。此外，本發(fā)明提供一種促進(jìn)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的組合物，其包括作為活性化合物的兩親肽。本發(fā)明還提供兩親肽在用于制備促進(jìn)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的組合物中的應(yīng)用。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。本發(fā)明的兩親肽被兩個(gè)具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對(duì)發(fā)夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合，導(dǎo)致促進(jìn)了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加成熟靶miRNA的生產(chǎn)。本發(fā)明還提供一種增加兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的方法，其包括給受試者施用兩親肽。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更為優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括老鼠、兔子、豚鼠、倉(cāng)鼠、狗和貓，最為優(yōu)選的是靈長(zhǎng)類(lèi)，如黑猩猩和大猩猩。本發(fā)明的兩親肽被兩個(gè)具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對(duì)發(fā)夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合，導(dǎo)致促進(jìn)了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加成熟靶miRNA的生產(chǎn)。本發(fā)明還提供一種用于因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑，其包括作為活性化合物的兩親肽。本發(fā)明那個(gè)還提供治療因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的方法，包括給受試者施用兩親肽。本發(fā)明還提供兩親肽在制備用于因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷制劑中的應(yīng)用。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。所述疾病為選自下組結(jié)腸癌、前列腺癌、睪丸癌、小腸癌、結(jié)腸直腸癌、肛門(mén)癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和白血病，但不限于此。
受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更為優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括老鼠、兔子、豚鼠、倉(cāng)鼠、狗和貓，最為優(yōu)選的是靈長(zhǎng)類(lèi)，如黑猩猩和大猩猩。本發(fā)明的兩親肽被兩個(gè)具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對(duì)發(fā)夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合，導(dǎo)致促進(jìn)了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于制備因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷制劑和治療因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病。所述治療藥物除含有兩親肽外，還可含有一種或多種具有相同或相近的功能的活性化合物。所述治療藥物可包括藥用添加劑，如淀粉、明膠、微晶纖維素、乳脂糖、乳糖、聚維酮、膠態(tài)二氧化硅、磷酸鈣、甘露醇、阿拉伯膠、預(yù)糊化淀粉、玉米淀粉、纖維素粉、羥丙基纖維素、歐巴代(opadry)、羧基乙酸淀粉鈉、巴西棕櫚、鉛、合成硅酸鋁、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、白糖、葡萄糖、山梨醇和滑石。所述藥用添加劑的含量為0.01-90wt%，但不限于此。本發(fā)明的藥物組合物可為口服或腸胃給藥的制劑。當(dāng)將藥物組合物轉(zhuǎn)化成施用形式時(shí)，可使用填料、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑或表面活性劑。口服劑型包括，例如片劑、丸劑、顆粒劑和膠囊劑。固體口服劑型可包括至少一種或多種稀釋劑，如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠。固體口服劑型還可包括潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂和滑石。液體口服劑型可包括懸浮劑、乳劑、糖漿劑和酏劑。這些制劑可包含常規(guī)的稀釋劑，例如水和液體石蠟或其它稀釋劑，如吸附劑、著色劑、增味劑、香料和防腐劑。用于腸外給藥的劑型可包括無(wú)菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍干制劑和栓劑。作為非水溶液和懸浮液的溶劑，可使用丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油如橄欖油、或可注射的酯如ethyolate。 作為栓劑的基體，可使用Wit印sol、聚乙二醇(MacrogoDJi^ja (Tween)61、可可脂、月桂脂、甘油明膠等。本發(fā)明的藥物組合物可以0. 0001 100mg/kg，優(yōu)選0. 001 10mg/kg的有效劑量對(duì)受試者進(jìn)行施用，每天一至多次。劑量可根據(jù)多種因素進(jìn)行改變，包括年齡、體重、健康狀況、性別和飲食習(xí)慣、給藥頻率和途徑、排泄和疾病的嚴(yán)重程度。所述治療藥物的給藥途徑可為口服給藥或腸外給藥。該藥物可以常規(guī)的藥物組合物形式進(jìn)行腸外給藥，特別是通過(guò)腹腔注射、直腸內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、乳房注射、大腦血管注射或胸內(nèi)注射。所述治療藥物可單獨(dú)使用，或結(jié)合其它的治療方法，如手術(shù)、放射治療、激素治療、 化療和生物反應(yīng)調(diào)劑物。此外，本發(fā)明提供一種促進(jìn)體外靶miRNA前體加工的方法，其包括1)用根據(jù)前述的方法篩選的兩親肽處理體外存在的miRNA前體；以及2)結(jié)合兩親肽和靶miRNA前體。根據(jù)上述方法，步驟1)中的miRNA前體選自下組pre-let-7a-l、pre-miR16-l和 pre-miRM-1，但不限于此。本發(fā)明的兩親肽被兩個(gè)具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對(duì)發(fā)夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構(gòu)建的兩親肽表現(xiàn)出對(duì)靶miRNA前體的強(qiáng)且特異的結(jié)合，導(dǎo)致促進(jìn)了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加體外成熟靶miRNA的加工。
10實(shí)施例下文中，將參考下述的實(shí)施例和試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明。然而，下述的實(shí)施例和試驗(yàn)例僅用于舉例說(shuō)明，不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1第一代肽的合成通過(guò)使用link amide MBHA 樹(shù)脂(0. 4 0. 6mmol/g)，以 25 μ mol 的比例，用一般的固相合成方法合成肽。用于合成氨基酸的單體購(gòu)自NovaBiochem。將肽的N-端乙?；?通過(guò)配備有337mM的氮?dú)饧す夂?. an的飛行管的Auto Flex II MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜儀 (Bruker Daltonics,Germany)測(cè)定肽。還通過(guò) Agilent 1100 HPLC(高效液相色譜)分離肽并進(jìn)行純度測(cè)定。具體地，表1 所示的肽 1 用 50mg(32ymol)的 link amide MBHA resin(0. 64mmol/ g)合成。樹(shù)脂用二氯甲烷(lml，5min)和二甲基甲酰胺(DMF，lml，5min)進(jìn)行膨脹，然后， 5min攪拌兩次，用1.5ml的含有20%哌啶的DMF去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。用二氯甲烷(1ml， 5次)，DMF(lml，2次)進(jìn)行攪拌后進(jìn)行過(guò)濾完全去除哌啶溶液。肽1中，通過(guò)將Fmoc保護(hù)的單體FmoCGly-0!K48mg，5當(dāng)量(eq))(苯并三唑-1-基-氧-三-吡啶-磷代六氟磷酸酯，PyB0P，8^ig，5當(dāng)量)溶于Iml的DMF中，對(duì)第一個(gè)氨基酸甘氨酸進(jìn)行吸附，然后添加N， N-二異丙基乙胺(DIPEA，56μl，12當(dāng)量)。將溶液添加到樹(shù)脂中，其中Fmoc保護(hù)的樹(shù)脂已經(jīng)去除，通過(guò)旋轉(zhuǎn)攪拌在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。通過(guò)2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBQ檢測(cè)確定反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)終止后，用二氯甲烷(lml，5次)，DMF(lml，2次)進(jìn)行攪拌后進(jìn)行過(guò)濾去除溶液。如上所述，重復(fù)去除Fmoc和結(jié)合氨基酸的步驟，直到吸附最后的一個(gè)氨基酸。去除N-端的乙酰化，并將N-羥基苯并三唑(H0Bt，41. 2mg, 10當(dāng)量)、無(wú)水乙酸09 μ 1)溶于 900 μ 1 DMF和100 μ 1的二氯甲烷中。將該溶液添加到樹(shù)脂中，室溫下攪拌1小時(shí)。為從固相中分離合成的肽，添加1. 5ml的裂解混合液(cleave cocktail) {三氟乙酸，(TFA)/三異丙基甲硅烷(TIS)/水=95 2.5 2.5}，并攪拌2小時(shí)。攪拌后，通過(guò)過(guò)濾去除樹(shù)脂， 用三氟乙酸進(jìn)行洗滌(0.5ml，2次)，收集剩下的肽。氮?dú)庀聺饪s產(chǎn)生的溶液，然后用冷的二乙醚和正己烷(v/v = 50/50)沉淀所述肽。13，OOOrpm離心5min，收集丸狀的沉淀物，小心地傾去上清液。丸狀沉淀用IOml的冷的二乙醚和正己烷(v/v = 50/50)離心兩次，傾去溶液洗滌。獲得的丸狀沉淀風(fēng)干后溶于0.2ml的二甲基亞砜(DMSO)中，用0.45 μ m的注射過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC純化。使用Waters 600HPLC作為固定相，使用XBridge Prep C185ym 0BD (19mmxl50mm, Waters)柱。使用緩沖液A，含0. 1 % TFA的水溶液和緩沖液B， 含有0.1% TFA的CH3CN之間的梯度作為流動(dòng)相用于分離。在30 35%的梯度B條件下， 收集肽1，將肽凍干制備成白色粉末(4. 8mg，產(chǎn)率8% )。所有其它的肽也按上述的方法制備。肽1和色氨酸替換亮氨酸的肽(Ia-Ih)的氨基酸序列的計(jì)算重量和通過(guò) MALDI-T0F質(zhì)譜分析的實(shí)際重量如表1所示。表權(quán)利要求
1.包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫(kù)，其中，一個(gè)所述α螺旋肽含有4 12個(gè)Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個(gè)或多個(gè)亮氨酸殘基被Try (色氨酸，W)取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親肽文庫(kù)，其中，所述兩親肽文庫(kù)包括一種或多種兩親α 螺旋肽，所述兩親α螺旋肽的氨基酸序列為以一個(gè)或兩個(gè)疏水的亮氨酸(L)和親水的賴(lài)氨酸(K)或甘氨酸(G)交替排列，其中兩個(gè)賴(lài)氨酸(K)被兩個(gè)色氨酸(A)取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親肽文庫(kù)，其中，所述兩親肽文庫(kù)包括一種或多種兩親α 螺旋肽，所述的兩親α螺旋肽的氨基酸序列如SEQ ID No :2 SEQ ID No :9，或SEQ ID No 12 SEQ ID No 21 所示。
4.一種檢測(cè)與發(fā)夾狀靶miRNA前體特異性結(jié)合的兩親肽的方法，所述方法包括1)制備權(quán)利要求1所述的兩親肽文庫(kù)；2)合成發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA前體；3)混合所述兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍?，測(cè)定兩親肽對(duì)miRNA前體的結(jié)合親和力；以及4)篩選對(duì)靶miRNA前體的結(jié)合親和力大于對(duì)發(fā)夾狀非靶miRNA前體的結(jié)合親和力的兩親肽。
5.一種檢測(cè)與兩親肽特異性結(jié)合的miRNA前體的方法，該方法包括1)制備權(quán)利要求1所述的兩親肽文庫(kù)；2)合成待檢測(cè)的發(fā)夾狀靶miRNA前體和作為對(duì)照的一種或多種發(fā)夾狀非靶miRNA前體以篩選所述兩親文庫(kù)；3)混合所述兩親肽、發(fā)夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針?lè)肿雍?，測(cè)定miRNA 前體對(duì)兩親肽的結(jié)合親和力；以及4)篩選對(duì)兩親肽的結(jié)合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA前體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，步驟幻中的miRNA前體選自下組 pre-let_7a_l、pre-miR16_l 禾口 pre-miR24_l0
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，步驟；3)中的探針為一種帶標(biāo)簽的化合物，所述化合物能與兩親肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合發(fā)夾狀靶miRNA前體。
8.一種檢測(cè)增加靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽的方法，該方法包括1)制備權(quán)利要求1所述的兩親肽文庫(kù)；2)培養(yǎng)用所述兩親肽處理后的細(xì)胞系；3)測(cè)定所述細(xì)胞系的靶miRNA的表達(dá)水平；以及4)篩選與未處理對(duì)照組相比，增加靶miRNA表達(dá)水平的兩親肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟2)中的細(xì)胞系為結(jié)腸癌細(xì)胞系。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟3)中的miRNA選自下組let-7a-l、 miR16-l和 miR24-l。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟；3)中的表達(dá)水平為選自下組Northern印跡、RT-PCR和微陣列。
12.一種用于促進(jìn)對(duì)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的組合物，其包括作為活性組分的根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
13.一種用于促進(jìn)對(duì)兩親肽特異的靶miRNA生產(chǎn)的方法，其包括給受試者施用根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
14.一種用于因?qū)捎H肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑， 其包括作為活性組分的根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的治療藥物或診斷試劑，其中，所述疾病為選自下組結(jié)腸癌、前列腺癌、睪丸癌、小腸癌、結(jié)腸直腸癌、肛門(mén)癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和白血病。
16.一種促進(jìn)體外靶miRNA前體加工的方法，該方法包括1)用體外存在的miRNA前體處理根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽；以及2)使兩親肽和靶miRNA前體結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽在制備用于促進(jìn)對(duì)兩親肽特異的靶 miRAN前體生產(chǎn)的組合物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求4或8所述方法篩選的兩親肽在制備用于因?qū)捎H肽特異的靶 miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可促進(jìn)靶miRNA生產(chǎn)的兩親肽和使用該兩親肽調(diào)控靶miRNA生產(chǎn)的方法。更為具體的是，本發(fā)明的兩親肽與發(fā)夾狀靶miRNA特異地強(qiáng)結(jié)合。這種特異的結(jié)合親和力誘導(dǎo)Dicer酶的活性，從而特異地增加靶miRNA的生產(chǎn)。本發(fā)明可有效地用于在體內(nèi)調(diào)控靶miRNA的生產(chǎn)量、用于miRNA的功能研究和用于制備靶miRNA相關(guān)疾病的治療藥物。
文檔編號(hào)C07K7/00GK102203116SQ200980142222
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者俞載勛, 玄純實(shí), 金納麗 申請(qǐng)人:首爾大學(xué)教產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)