專利名稱：適用于制備重組多肽的突變體細胞的制作方法
適用于制備重組多肽的突變體細胞序列表本發(fā)明包含序列表。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌細胞，其中所述細 胞與其它的等基因(isogenic)但未突變的細胞相比，具有降低的YugJ (SEQ ID NO: 2)或其同源物的表達水平；產(chǎn)生所述細胞的方法，以及使用所述細胞產(chǎn) 生目的多肽的方法。發(fā)明背景目前經(jīng)?？梢娫诎l(fā)酵期間多肽結(jié)晶/非結(jié)晶的形成，因為發(fā)酵產(chǎn)量由于發(fā) 酵配方(fermentation recipe)的優(yōu)化和/或由于更有效的產(chǎn)生生物的鑒定/開發(fā)或 構(gòu)建而變得越來越高。在此情況下，以高于其溶解度極限的產(chǎn)量發(fā)酵多肽，意味著其可能以部 分沉淀的形式存在于培養(yǎng)液中。該沉淀物可能是以結(jié)晶的形式或作為非結(jié)晶 沉淀。這導(dǎo)致回收中的問題，其中在從培養(yǎng)液中除去細胞及其它固體以前必須 采用專門的方法溶解結(jié)晶/非結(jié)晶沉淀物。這些方法常常導(dǎo)致產(chǎn)量損失。WO 2004/003187公開了 一種發(fā)酵孩i生物來產(chǎn)生目的多肽的方法，其中在 發(fā)酵期間存在少量(例如5% w/w)的一種或多種選自由以下物質(zhì)所組成的組 的化合物1,2-丙二醇(單丙二醇；MPG)、 1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木 糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇(dulcitol)、甘露醇、赤蘚醇、纖維二糖、山梨 糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，由此可以避免、顯著延遲或顯著減少目 的多肽的結(jié)晶或非結(jié)晶沉淀的形成。通過在發(fā)酵期間避免形成多肽結(jié)晶/非結(jié) 晶沉淀，可使用更加筒單的回收方法來獲得較高的產(chǎn)量。MPG對于大多數(shù)微生物而言僅僅是非常不良的碳源，或者被大多數(shù)微生 物非常不良地代謝，或根本不代謝，所以可將其在開始發(fā)酵以前和/或在發(fā)酵期間加入而不明顯影響細胞生長和目的肽的生產(chǎn)力。但是， 一些微生物在一定程度上降解這些加入的化合物，例如MPG,并 且需要向這些微生物供給大量的該化合物來實現(xiàn)最佳效果。因為這些化合物 有些昂貴，所以感興趣的是將達到預(yù)期效果所需要的量最小化。發(fā)明概述在地衣芽孢桿菌0Ba"7/ws /fc/^mybnm's)酶產(chǎn)生菌株中推定的，gJ開放閱 讀框的失活令人驚訝地導(dǎo)致發(fā)酵過程中單丙二醇(MPG)降解的降低。將MPG 加入生長培養(yǎng)基來避免或顯著減少酶結(jié)晶的形成。因此，需要將更少的MPG 加入，gj突變體菌抹的發(fā)酵培養(yǎng)基中來達到預(yù)期效杲，從而降低生產(chǎn)成本。根據(jù)序列同源性，預(yù)測推定的yi^/開放閱讀框編碼醇脫氫酶，很可能編 碼丁醇脫氮酶。已發(fā)現(xiàn)文獻中的很多微生物包含編碼醇或丁醇脫氬酶的，g/ 同源物，其具有與本發(fā)明預(yù)測的YugJ非常相似的氨基酸序列，所述微生物包 括枯草芽孢桿菌(Ba"'〃ws 6^to'/z'力、蠟樣芽孢桿菌(5ac/〃M5 cerew力、蘇云金芽 3包4干菌(_6ac/〃z ^2wnV2g/em"/力、Geobfl"7/tu1 A:ai^top/7z7ws 、 克勞氏芽孑包4干菌因此，在第一個方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變 細菌細胞，其中所述細胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，具有降低的 YugJ (SEQ ID NO: 2)或其同源物的表達水平。本發(fā)明的另一個方面涉及產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌細胞， 其中所述細胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，具有降低的醇脫氫酶的 表達水平，所述醇脫氫酶包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ IDNO: 2具有至少60%的同一性，或優(yōu)選與SEQ ID NO: 2具有至少65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 92%、 94%、 96%、 98%或99%的同一性。本發(fā)明的又一個方面涉及構(gòu)建突變的細菌細胞的方法，所述方法包含如 下步驟a) 將細菌細"包突變；和b) 選4奪突變細胞，所述突變細胞與其它的等基因但未突變的細胞相比， 具有降低的YugJ (SEQ ID NO: 2)或其同源物的表達水平。本發(fā)明的又一個方面涉及產(chǎn)生目的多肽的方法，所述方法包含如下步驟 a)在至少50升的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌細胞，所述培養(yǎng)基包含一種或多種選自由以下物質(zhì)所組成的組的化合物1,2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘 露醇、赤蘚醇、纖維二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，其在發(fā) 酵之前和/或在發(fā)酵期間加入培養(yǎng)基中，其中所述突變細胞具有降低的YugJ (SEQIDNO: 2)或其同源物的表達水平，和 b)分離目的多肽。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及任何上述方面的突變體細胞，其中突變體細 胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，顯示降低的降解一種或多種多元醇 的能力，所述多元醇優(yōu)選自由以下物質(zhì)所組成的組1,2-丙二醇(單丙二醇； MPG)、 1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘 露醇、赤蘚醇、纖維二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚。附圖
簡述圖l顯示質(zhì)粒pAN212b的示意圖，所述質(zhì)粒pAN212b是質(zhì)粒pSJ2739(在 W0 99/41358中所述)的衍生物，而其又衍生自質(zhì)粒pE194,即一種用于復(fù)制的 天然溫度敏感型質(zhì)粒。質(zhì)粒pAN212b包含pE194復(fù)制子，以及來源于質(zhì)粒 pUB110的片l殳。圖2顯示質(zhì)粒pAN212b-，g/的示意圖，所述質(zhì)粒pAN212b-，gJ由 yugJSOEpcr片段組成，該片段克隆在如圖l所示的溫度敏感型質(zhì)粒pAN212b 的&cII-仏aM位點，構(gòu)建過程如以下實施例所述。發(fā)明詳述 微生物根據(jù)本發(fā)明的微生物(微生物菌抹或細胞)可從例如下列的那些細菌來源 的任何屬的微生物中獲得。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的第一個方面的細胞 是原核細胞，優(yōu)選革蘭氏陽性細胞，更優(yōu)選為芽孢桿菌屬08。"7/^)細胞，并 且最優(yōu)選嗜堿芽孢桿菌CSfl"7/w a汰a/op/n7w力、解淀粉芽孢桿菌(5ac"/w awy/o/z々we/a"'em)、 短芽孑包桿菌C6ac/〃ws 6rev/力、環(huán)狀芽孑包桿菌CSa"'〃m1 c/rcw/朋力、克勞氏芽孑包才干菌(S<3c/〃i c/<3iw")、)疑結(jié)芽孑包桿菌(5ac/〃ws cc agw/朋力、杣爛芽孑包桿菌CBa"7/w/awfw力、遲緩芽孢桿菌(萬a"7/z^/e "&力、地 衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bgcz7/w mega&n'w")、嗜熱脂肪芽孢桿菌(SacWe"ro決eww/ /H7w力、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。突變細胞在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，YugJ同源物包含與SEQ IDNO: 2所示序列 具有至少60%的同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO: 2具有至少65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 92%、 94%、 96%、 98%或99%同 一性的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的突變細胞在yi^/(SEQ ID NO: l)或 其同源物中突變；優(yōu)選，gJ和/或戸gJ同源物編碼包含氨基酸序列的多肽，所 述氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所示序列具有至少60%的同 一性，優(yōu)選與SEQ IDNO: 2具有至少65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 92%、 94%、 96%、 98%或99%的同一性；更優(yōu)選yz^/同源物包含具有核苷酸序列的多核苦酸，所 述核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列具有至少60%的同 一性，優(yōu)選與SEQ IDNO: 1具有至少65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 92%、 94%、 96%、 98%或99%的同一性。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞在至少一個多核苷酸中突變，其中具有至少100bp 大小的所述至少一個多核苷酸的亞序列與具有SEQ ID NO: l所示序列或相應(yīng) 互補序列的多核苦酸在中等嚴緊雜交條件下雜交。在本發(fā)明細胞的優(yōu)選實施方案中，將ywg/或其同源物部分或全部從染色 體中缺失；或者j^gJ或其同源物包含至少 一 個移碼突變或無義突變。這些突變的優(yōu)選結(jié)果是與其它的等基因但未突變的細胞相比，本發(fā)明 的細胞具有降低至少兩倍的(two-fold reduced) YugJ或其同源物的表達水平； 或者與其它的等基因但未突變的細胞相比，本發(fā)明的細胞檢測不到(has no measureable) YugJ或其同源物的表達。目的多肽在優(yōu)選實施方案中，目的多肽可獲得自細菌或真菌來源。 例如，目的多肽可獲得自革蘭氏陽性細菌，例如芽孢桿菌屬菌抹，如嗜 堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、 ;j:山爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽 孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬(5Yr印tomyce"菌抹， 如淺青紫《連霉菌OSVrepto〃iyces //v/cfa"力或鼠灰《連霉菌(;SVreptowyce5" mMn'm/s);或來自革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌(五.co/0或假單胞菌屬菌種目的多肽可獲得自真菌來源，例如來自酵母菌抹如假絲酵母屬(Ow&^)、 克魯維酵母屬(^7^vm5"^ce力、畢赤酵母屬(戶/c/w'")、酵母屬0S"cc/2"rawycay)、 裂殖酵母屬(&72izo^cc/wram少cey)或西洋蓍霉屬(!^rraWa)菌4朱如卡爾酵母 (SflccAarawyc^s c"/^yZ efgew&)、酉良酒酵母(&1cc/7aromyces cwev/w'ae) 、 4唐4匕酵 母(/S""cc/ (2raw少c&s1 (i/"5to"cw)、道才各4立氏酵母(S"cc/ "rcwycay <^9Wg/os7'/)、 克魯 弗酵母(&zcc/2ara/"cas" ven')、諾地酵母(&cc/犯ra，cas1 "or6em7.力或卯形酵 母(Sacc/Mrom少cas1 ovz》r鹿》菌抹。目的多肽可獲得自絲狀真菌菌株，例如枝頂孢霉屬(^7效船"/M附)、曲霉屬(y^/ ^g7'〃w力、》豆才更霉屬(JMWo6as7Www)、 隱5求菌屬(CV7ptoc0ccM力、 W/Aay/J/ww 、 嫌孑包屬(Fw紹".,)、腐質(zhì)零屬(7/w脂'co/a)、 M3g"flporf/2g、 毛審 屬(A/mcw)、 1更絲霉屬(7\^(^//0/9/7/770^3)、 Afeoc"〃/waW/;c、月永孑包菌屬(7Vewoy/7on2)、 扣乂青霉屬(戶ae"7omyce力、青霉屬(戶em'cz7/z'wm) 、 /Vrawycay 、 裂木習(xí)菌屬 (/5b/z/z(9/ /^〃MW)、 ^果節(jié)菌屬(7^/"rcwj^as1)、 熱子囊菌屬(772er柳oaycMS)、氺炎孑包殼 屬(777/e/flv/a)、 7b/j/poc/flA'wm或木霉屬(7Hc/zofiferma)菌才朱，凈爭另寸i也,目的多月太 可獲4尋自凈束孑包曲霉(/^perg/〃WJ" acw/eflf船)、泡盛曲霉(y4^erg77/ws 、 臭曲霉(/i印erg7.〃ws /b"油力、 日本曲霉(A戸rg/〃2^ 乂"po"/cw力、構(gòu)巢曲霉 (/^/ erg/〃MS m.c/w/am)、 黑曲霉(J5p^g/〃Ms m'ger)、 米曲霉(^印ergz'〃M1 。，ae)、 4干孑包^犬鐮孑包CFY^an'wm 6a"n'dVo/t/e力、禾谷鐮孑包(FMsan'w附cerea/z'力、庫威鐮孑包 (Fwsan'wm crao/twe/Zemg)、 大刀嫌孑包(尸iwar/〃附 c〃/7Worw附)、禾本 一牛嫌孑包 (Fwsan'wm gram&earww)、 禾赤嫌孑包(F附an'ww graw /wwm)、異孑包嫌孑包(Fwsan'wm /犯tera5porw附)、合7欠木鐮孑包(jpusan'M附"egMmiO、尖鐮孑包(Fwsan'w附wqy^porwm)、 多枝鐮孑包(FMsan'M7M re0.cw/加Mm)、 粉紅鐮孑包(FMsan'Mm mseMm)、 接骨木鐮孑包 (Fwsan'wm sam6wczYiMm)、月夫色鐮孑包(jFu a;n'wm sarcoc/zrowm) 、 4以分才支孑包鐮孑包 (Fz^an'w附^porafn'c/2z'o/(iey)、石克色鐮孑包(F船(3r/M/w siz/p/zMrewm)、圓鐮孑包(Fwsarfw附 torw/o5wm)、 擬絲孑包嫌孑包(Fksan'wm Wc/zof/zec/cu.ofes)、 銀片嫌孑包(FwsanY/m vewe"afwm) 、 4寺異腐質(zhì)霉(_f/wmfco/a z'wso/era) 、 沖帛4犬腐質(zhì)霉(7fM附〖co/a /a/ Mgi"cW(3)、 米黑毛霉(iWwcor m/e/2ez,)、 嗜熱毀絲零(Afyce/z'op/if/iora 〖/7er7wop/7z7a) 、 4且4造月永孑包菌(TVewraspora crassa)、 產(chǎn)紫青霉(Pem.c〃/z'Mm / w7 wr0geram)、 哈茨木審(Jh'c/ 0(ierma Ziarzz'cwwm)、 康亍木審(7Hc/iocfermaAcw/wg")、 長對支木審(7H'c/zcxierma /owg/6rac/z/"fwm)、 里氏木審(!Tn,c/zO(i^r附a re^ye/)或綠色木霉(！Hc/zo(ierma vzW刮菌抹。這些種的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保 藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、德意志《鼓生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSM)、 真菌菌種保藏中心 (Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏 中心北區(qū)研究中心(AgricuUural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center) (NRRL)。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"，應(yīng)指目的 多肽由該來源或由其中已插入來自該來源的基因的細胞產(chǎn)生。目的多肽可為肽或蛋白。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的肽包含2至100個氨基酸； 優(yōu)選10至80個氨基酸；更優(yōu)選15至60個氨基酸；甚至更優(yōu)選15至40個氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，該蛋白是酶，尤其是水解酶(根據(jù)酶命名法(Enzyme Nomenclature);國際生物化學(xué)聯(lián)合會.術(shù)語委員會的建議(Nomenclature實施方案中，優(yōu)選下列水解酶蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。微生物來源 是優(yōu)選的。其中包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。所述蛋白酶可為 酸性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白 酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶(subtilisin),特別是源自芽 孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、 枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168 (在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源的) 和鐮孢屬蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中描述。有用的蛋白酶的實例是在WO 92/19729、 WO 98/20115、 WO 98/20116和 WO 98/34946中描述的變體，特別是在一個或多個以下位置具有取代的變體 27、 36、 57、 76、 87、 97、 101、 104、 120、 123、 167、 170、 194、 206、 218、 222、 224、 235和274。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括ALCALASETM 、 SAVINASE 、 PRIMASETM、 DURALASETM、 ESPERASE 、 RELASE 和KANNASE (Novozymes A/S) 、 MAXATASE 、 MAXACAL 、 MAXAPEM 、 PROPERASE頂、PURAFECTtm 、 PURAFECT OXPTM 、 FN2TM和FN3 (Genencor International Inc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工 程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自如下的脂肪酶腐質(zhì)霉屬(同物 異名嗜熱霉屬(T7化rmomyc&y))，例如，來自疏棉狀腐質(zhì)霉(細毛嗜熱霉(7: /am^,'朋m ))如EP 258 068和EP 305 216中所述，或來自特異腐質(zhì)霉如WO 96/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產(chǎn)堿假單胞菌CP a/ca/z'ge"w) 或類產(chǎn)堿假單胞菌(P. psei^oa/ca/fge打es) (EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P. ce^"'a) (EP 331 376)、施氏假單胞菌OR (GB 1,372,034)、熒光假單胞菌CP /7Mw^cera)、假單胞菌屬菌種(尸化w^ /w ww w.)菌抹SD 705 (WO 95/06720和WO 96/27002)、戶Wscom,"e"^ (WO 96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪 酶，例如，來自枯草芽孑包桿菌(Dartois da/., 1993,祝oc/zem/ca "歷o/ /2jAS7'ca爿cta: 1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(凡pi/mz7附) (W0 91/16422)的脂肪酶。其它實例是脂肪酶變體，例如在WO 92/05249、 WO 94/01541 、EP 407 225、 EP 260 105、 WO 95/35381、 WO 96/00292、 WO 95/30744、 WO 94/25578、 WO 95/14783、 WO 95/22615、 WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂 肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括LIPOLASE 、 LIPOLASE ULTRAtm和LIPEXtm (Novozymes A/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(a和/或p)包括細菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或 蛋白質(zhì)工程化的變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的a-淀粉酶，例如， 地衣芽孢桿菌的特殊菌抹，在GB 1,296,839中有更詳細的描述。有用的淀粉酶的實例是在WO 94/02597、 WO 94/18314、 WO 96/23873、WO 97/43424和WO 01/66712中描述的變體，尤其是在一個或多個以下位置具 有取代的變體15、 23、 105、 106、 124、 128、 133、 154、 156、 181、 188、 190、 197、 202、 208、 209、 243、 264、 304、 305、 391、 408和444。商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是DURAMYL 、 TERMAMYL 、 FUNGAMYLTM、 NATALASETM、 TERMAMYL LCTM、 TERMAMYL SCTM 、 LIQUIZYME-XTM和BAN頂(Novozymes A/S)、 RAPIDASEtm和PURASTARtm 沐自Genencor International Inc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工 程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、 鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如，產(chǎn)生自特異腐質(zhì)霉、嗜 熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于US 4，435,307、 US 5,648，263、 US 5,691,178、 US 5,776,757和WO畫9259中。特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護顏色的益處 (colour care benefits)。這種纖維素酶的實例是在EP 0 495 257、 EP 0 531 372、 WO 96/11262、 WO 96/29397、 WO 98/08940中描述的纖維素酶。其它實例是 纖維素酶變體，例如在WO 94/07998、 EP 0 531 315、 US 5,457,046、 US 5,686,593、 US 5,763,254、 WO 95/24471、 WO 98/12307和PCT/DK98/00299中 描述的那些纖維素酶變體。商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括CELLUZYMETM 、 CAREZYME 和 CAREZYME CORE (Novozymes A/S)、 CLAZINASEtm和PURADAX HAtm (Genencor International Inc.)以及KAC-500(B)tm (Kao Corporation)。氧化還原酶可根據(jù)本發(fā)明處理的氧化還原酶包括過氧化物酶，以及氧化酶例如漆酶 和過氧化氫酶。其它優(yōu)選的水解酶是碳水解酶(carbohydrolase),包括MANNAWAYtm。其它優(yōu)選的酶是轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。目的多狀的表i^]建體在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞包含一個或多個在染色體上整合的、 編碼至少一種異源多肽的多核苦酸的拷貝。優(yōu)選本發(fā)明的至少一種異源多肽由從至少一種異源啟動子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼；優(yōu)選地，至少一個啟動子包括人工啟動子。合適的啟動子構(gòu)建體在 WO 93/10249中公開，該文獻以其整體并入本文作為參考。另外，優(yōu)選的人工啟動子包含一個或多個mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選源自 c, IIIa啟動子。合適的構(gòu)建體在W0 99/43835中描述，該文獻以其整體并入本 文作為參考。發(fā)酵本發(fā)明可用于工業(yè)規(guī)模的任何發(fā)酵，例如用于具有至少50升、優(yōu)選至少 100升、更優(yōu)選至少500升、更優(yōu)選1000升、尤其是至少5000升的培養(yǎng)基的任何發(fā)酵?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法來發(fā)酵菌抹或細胞。發(fā)酵培養(yǎng)基可為復(fù)合 培養(yǎng)基，其包含復(fù)合的氮源和/或碳源，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水 解物、棉籽粉、玉米漿、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、馬鈴薯蛋白、 馬鈴薯蛋白水解物、糖蜜(molasses)等。發(fā)酵培養(yǎng)基可為化學(xué)上確定成分培養(yǎng) 基，例如在W0 98/37179中所定義的?？赏ㄟ^分批、補料分批、重復(fù)補料分批(repeated fed-batch)或連續(xù)發(fā)酵方 法來進行發(fā)酵。在補料分批方法中，在發(fā)酵開始之前培養(yǎng)基中不添加包含一個或多個結(jié) 構(gòu)性和/或催化元件(element)的化合物(compound)或添加部分化合物，并在發(fā) 酵過程中分別補料包含一個或多個結(jié)構(gòu)性和/或催化元件的化合物的全部或 剩余部分。選擇用于補料的化合物可一起或彼此分離地補料到發(fā)酵過程。在重復(fù)補料分批或連續(xù)發(fā)酵的方法中，在發(fā)酵期間將完全的起始培養(yǎng)基 另外補料。可將起始培養(yǎng)基與結(jié)構(gòu)元件進料一起或分開補料。在重復(fù)補料分 批的方法中，在一定的時間間隔內(nèi)將包含生物質(zhì)的部分發(fā)酵液去除，而在連 續(xù)方法中，部分發(fā)酵液的去除連續(xù)發(fā)生。因此用相當(dāng)于回收發(fā)酵液的量的一 部分新鮮培養(yǎng)基補足(replenish)發(fā)酵過程。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選補料分批、重復(fù)補料分批方法或連續(xù) 發(fā)酵方法。多元醇可將非常有用的碳水化合物的亞類多元醇添加到根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵中?？?吏用任何多元醇。但是，優(yōu)選的是選自由以下物質(zhì)組成的組的多元醇1,2-丙二醇(單丙二醇；MPG)、 1，3-丙二醇、甘油、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、 半乳糖醇、甘露醇、赤蘚醇、纖維二糖和山梨糖醇。特別地，優(yōu)選可緩慢代 謝的多元醇。應(yīng)當(dāng)注意的是， 一些多元醇(例如甘油)被大多數(shù)細胞相當(dāng)容易地代謝，但 是例如甘油的吸收則可以被阻斷，這意味著可根據(jù)本發(fā)明使用甘油。在本發(fā)明的具體實施方案中，將多元醇在接種之前或在接種之后以至少 0.1% (w/w)的量；尤其是以至少0.5% (w/w)的量加入培養(yǎng)基中。將多元醇在接 種之前或在接種之后以多至10% w/w的量；優(yōu)選以多至8% w/w的量；更優(yōu)選 以多至6。/。w/w的量；更優(yōu)選以多至5% w/w的量；更優(yōu)選以多至4% w/w的量； 更優(yōu)選以多至3% w/w的量；更優(yōu)選以多至2% w/w的量；甚至更優(yōu)選以多至1% w/w的量力口入培養(yǎng)基中。在一些情況下，使用兩種或兩種以上多元醇(例如甘油和單丙二醇)的混合 物或者可緩慢代謝的多元醇和可緩慢代謝的碳水化合物的混合物可能是有利 的。代謝的程度下列測試可用來檢驗產(chǎn)生目的多肽的微生物是否不能或只能低程度地代 謝給定的化合物選擇用于培養(yǎng)目的微生物的合適的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的特點在于下列參數(shù)a. 該培養(yǎng)基包含葡萄糖作為唯一 的碳水化合物來源。b. 將葡萄糖除去時，該培養(yǎng)基只能維持顯著較低的生物量(小于50%)的生長。然后在以下3種培養(yǎng)基中比較目的微生物的生長I:正常培養(yǎng)基(以葡萄糖作為唯一的碳水化合物來源)II:無葡萄糖的培養(yǎng)基IIII:無葡萄糖但具有相同C-mol的測試化合物的培養(yǎng)基I 然后在上述的3種培養(yǎng)基中跟蹤8小時的時間的生長。用確保正常培養(yǎng)基在75%的時間范圍內(nèi)長出的生物質(zhì)濃度來進行接種。將生物質(zhì)的量測定為在 650nm的光密度(OD)。測定在不同培養(yǎng)基中獲得的OD。將待測的化合物定義為可低代謝的，如果(ODm-ODH)/(ODrOD〖0 < 25%;優(yōu)選地(OD"廣ODu)/(ODj-ODu) < 20%;更優(yōu)選地(ODm-ODn)/(ODrODn) < 15%;更優(yōu)選地(OD,ODn)/(ODrODn)〈 10%;更優(yōu)選地(OD,ODn)/(OD廣ODu) < 5%;更優(yōu)選地(ODm-ODn)/(OD廣ODu) = 0%在實施例2中，依據(jù)這種方法測試了發(fā)酵物。目的多肽的回收本發(fā)明的又一個方面涉及發(fā)酵液的下游加工。在發(fā)酵過程結(jié)束之后，可 使用為目的多肽開發(fā)的標準技術(shù)從發(fā)酵液中回收目的多肽。應(yīng)用的有關(guān)下游 加工技術(shù)取決于目的多肽的性質(zhì)。從發(fā)酵液中回收目的多肽的方法通常涉及(但不限于)下列步驟的一些或 全部1) 培養(yǎng)液的預(yù)處理(例如絮凝)2) 從培養(yǎng)液中除去細胞及其它固體物質(zhì)(初次分離)3) 過濾4) 濃縮5) 過濾6) 穩(wěn)、定和標準4匕。除了上面列出的單元操作之外，可應(yīng)用一些其它的回收方法和步驟，例 如pH-調(diào)節(jié)、溫度變化、結(jié)晶、用活性炭處理包含目的多肽的溶液以及使用 各種吸附劑。通過使用本發(fā)明的方法，當(dāng)通過在發(fā)酵期間加入例如MPG來減少或消除 結(jié)晶形成時，回收中的目的多肽的產(chǎn)率(yield)高得多。在下面實施例中進一步說明本發(fā)明，所述實施例不意欲以任何方式限制 本發(fā)明所要求的范圍。實施例實施例l:地衣芽孢桿菌菌林中3;Mg/基因的缺失除非另有說明，應(yīng)用分子生物學(xué)的標準方法來進行DNA搡作和轉(zhuǎn)化 (Sambrook ef a/. (1989) Molecular cloning: A laboratory mamial， Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. " fl/. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood， C. R. and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley and Sons, 1990)。根據(jù)供應(yīng)商的說明書來使用DNA操作的酶(例如限制性核 酸內(nèi)切酶、連接酶等可獲得自New England Biolabs, Inc.)。如Yasbin, R.E., Wilson, G.A.禾口Young, F.E. (1975) Transformation and txansfe.ction in lysogenic strains of 5a"7/z^ xwW/Zj: evidence for selective induction of prophage in competent cells, 乂i flcten'o/, 121:296-304。菌抹地衣芽孢桿菌SJi707:在WO93/10249中公開。地衣芽孢桿菌SJ1707b:在WO 01/66712中公開的表達重組變體a-淀粉酶 的SJ1707。地衣芽孢桿菌AN232: SJ1707b (AywgJ);本研究。枯草芽孢桿菌PP289-5:用于接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的供體菌株，所述質(zhì)粒具有來 源于pUBU0 (在WO 96/23073中描述)的轉(zhuǎn)移起點onT。質(zhì)粒粒pSJ2739又衍生自公知的質(zhì)粒pE194，其為用于復(fù)制的天然溫度敏感型質(zhì)粒。 質(zhì)粒pAN212b包含pE194復(fù)制子(replicon)，和源自質(zhì)粒pUBl 10的片段，如圖l 中所示。pAN212b的全部核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。引物yugJlF (SEQ ID NO. 4): ataaaagtccgcggttgatcagacctgcgattccg yugJ2R (SEQ ID NO. 5): cagcgttttaaagcggccgatcgcttaatgctgcctccgc yugJ3F (SEQ ID NO. 6): gcggaggcagcattaagcgatcggccgctttaaaacgctgyugJ4R (SEQ ID NO. 7): tgcccggacgtcttttttcgtgaatggtatggtgg 可根據(jù)核苷酸序列(SEQ ID NO. l)通過本領(lǐng)域已知的任何標準方法來進 行地衣芽孢桿菌菌抹中^wgX基因的缺失，所述標準方法例如下述通過使用由重疊延伸的剪接技術(shù)來產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。在以SJ1707染色體 DNA作為模板的PCR反應(yīng)中，通過使用51物yugJlF和yugJ2R來產(chǎn)生包含，gJ 上游序列的PCR1 。在另 一個以SJ1707染色體DNA作為模板的PCRA應(yīng)中，通 過使用引物yugJ3F和yugJ4R來產(chǎn)生包含，gJ下游序列的PCR2。在使用PCR1 和PCR2作為模板，以及yugJ 1 F和yugJ4R作為引物的第二階段PCR中產(chǎn)生剪接 產(chǎn)物(930bp，表示為yugJSOEpcr;如SEQ ID N0.8所示)，其中ywgJ基因從387aa 減少到51aa。然后通過將yugJSOEpcr克隆入溫度敏感型質(zhì)粒pAN212b的&c II 位點來構(gòu)建表示為"缺失質(zhì)粒(deletion plasmid)"的質(zhì)粒-產(chǎn)生缺失質(zhì)粒 pAN212b-yugJ,如在圖2中示意性顯示。pAN212b-yugJ的全部序列如SEQ ID NO. 9所示。將該缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌接合供體菌抹PP289-5(其包含染色體 &/-缺失、質(zhì)粒pBC16 (可從DSMZ ref. 4424獲得;Kreft J, " 1978. Mol Gen Genet. Jun 1; 162(1):59-67)和質(zhì)粒pLS20 (也可從DSMZ ref.4449獲得；K6hler, T. M.和Thome, C. B. 1987. J. Bacteriol. 169: 5271-5278))的感受態(tài)細胞，并且通過 使用標準方法(如WO 02/00907所述)接合于地衣芽孢桿菌SJ1707b菌才朱。然后通過由整合和切除溫度敏感型缺失質(zhì)粒介導(dǎo)的借助于PCR1和PCR2 的雙同源重組，將j^gJ缺失從缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到靶地衣芽孢桿菌SJ1707b菌抹的 染色體(如WO 02/00907所述)。通過以引物yugJlF和yugJ4R/人染色體DNA中產(chǎn)生PCR片#殳來確^人>^^/-缺失的菌林，其中通過標準核苷酸序列分析來驗證該缺失。將7i^Z-缺失的菌 才朱表示為地衣芽孢桿菌AN23 2 。實施例2.;;^/缺失菌林中降低的MPG降解將兩種等基因的地衣芽孢桿菌菌抹SJ1707b和AN232 (SJ1707b (A，g力)如 下進行發(fā)酵 培養(yǎng)基除非另有所述，在所有情況下使用自來水。通過本領(lǐng)域已知的方法對所有培養(yǎng)基進行滅菌來確保發(fā)酵作為單種培養(yǎng)(monoculture)進行。第一接種培養(yǎng)基將LB瓊脂用作固體生長培養(yǎng)基(如Ausubel， F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995所 述)。LB瓊脂10 g/l來自酪蛋白的蛋白胨；5 g/l酵母提取物；10 g/l氯化鈉； 12g/l細菌用瓊脂(Bacto-agar)，調(diào)節(jié)到pH6.8至7.2。使用來自Merck的預(yù)混物 (premix)。轉(zhuǎn)移緩沖液M-9緩沖液(使用去離子水)磷酸氫二鈉.21120 8.8 g/l;磷酸 二氫鉀3g/l;氯化鈉4g/l;石克酸鎂.7H20 0.2 g/1。接種搖瓶培養(yǎng)基(在接種之前濃縮)PRK-50: 110 g/l豆渣(soy grit);磷酸 氫二鈉.2!120 5 g/l;在滅菌之前用NaOH/H3P04將pH調(diào)節(jié)到8.0。補充培養(yǎng)基(在接種之前濃縮)胰蛋白胨(來自Difco的酪蛋白水解物)30 g/l;硫酸鎂'7H20 4g/l;磷酸氫二鉀7 g/l;磷酸氫二鈉'21120 7 g/l;硫酸銨4 g/l;檸檬酸0.78 g/l;維生素(石克胺素-二氯化物34.2 mg/l;核黃素2.9 mg/l; 煙酸23mg/l; D-泛酸輛28.5 mg/l;吡。多醛-HCl 5.7 mg/l; D-生物素1.1 mg/l; 葉酸2.9 mg/l);痕量金屬(MnS04'H20 39.2 mg/l; FeS04.7H20 157 mg/l; CuS04'5H20 15.6 mg/l; ZnCl2 15.6 mg/l);消泡劑(SB2121) 1.25 ml/l;在滅菌 之前用NaOH/H3P04將pH調(diào)節(jié)到6.0。補料培養(yǎng)基(Feed medium): Glucose-H20 820 g/l。步驟首先將菌抹在37。C在LB瓊脂斜面上培養(yǎng)1天。然后用M-9緩沖液洗滌瓊 脂，并且測定產(chǎn)生的細胞懸浮液在650nm處的光密度(OD)。將接種物搖瓶(PRK-50)用OD (650nm) x ml細胞懸液=0.1的接種物接種。 然后在37。C 300 rpm將搖瓶溫育20小時。通過將生長培養(yǎng)物從搖瓶中接種到主發(fā)酵罐中開始在主發(fā)酵罐(發(fā)酵槽 (fermentation tank))中的發(fā)酵。接種體積是10。/。的補充培養(yǎng)基(800ml補充培養(yǎng) 基的80ml)。使用裝備有溫度控制系統(tǒng)、用氨水和磷酸的pH控制、在整個發(fā)酵過程中 測量>20%氧飽和度的溶氧電極的標準實驗發(fā)酵罐。發(fā)酵參數(shù)是 溫度41°C。使用氨水和磷酸將pH保持在6.8-7.2。 控制6.8(氨水)；7.2磷酸通氣1.5升/min/kg培養(yǎng)液重量攪拌1500 rpm補料策略0小時。在接種之后0.05 g/min/kg初始培養(yǎng)液 8小時。在接種之后0.156 g/min/kg初始培養(yǎng)液 終止。在接種之后O. 156 g/min/kg初始培養(yǎng)液 結(jié)果分別平行進行SJ1707b (ywg，予生型)和AN 232 (yi^/缺失突變體)的兩個 發(fā)酵。在24小時和50小時20分時將2。/。MPG加入兩個發(fā)酵中。結(jié)果(如表l所示) 顯示在yMgJ缺失菌抹AN232中(在時間段30小時-93小時內(nèi))與其它等基因的 菌抹SJ1707b相比降低的MPG代謝。確實，通過使用，gJ缺失菌抹可以降低發(fā) 酵成本，因為需要加入更少的MPG來減少晶體形成。表l.發(fā)酵A (SJ1707b)和B (AN232; ywgJ突變體)的發(fā)酵液中的MPG濃度 (%)。在24小時和50小時20分加入2% MPG。時間MPG濃度(％)SJ1707bAN23224小時1.51,625小時45分鐘1.11.129小時30分鐘0.80.850小時0.50.768小時1.41.693小時1.01.權(quán)利要求
1. 產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌細胞，其中所述細胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，降低了YugJ(SEQ ID NO2)或其同源物的表達水平。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞，其是原核細胞，優(yōu)選革蘭氏陽性細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞，其是芽孢桿菌屬細胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞，其是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、 短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿 菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯 草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的細胞，其中所述YugJ同源物包含與 SEQIDNO: 2所示序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項所述的細胞，其在yMg/(SEQIDNO: l)或其 同源物中突變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞，其中戶gJ和/或，gJ同源物編碼包含氨 基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO: 2所示序列具有至少70%的 同一性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞，其中少wgJ同源物包含具有核苷酸序列的 多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列具有至少70%的同一性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l-8任一項所述的細胞，其在至少一個多核苷酸中突變， 其中具有至少100 bp大小的所述至少一個多核苷酸的亞序列與具有SEQ ID NO: 1所示序列或相應(yīng)互補序列的多核苷酸在中等嚴緊雜交條件下雜交。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項所述的細胞，其中將yw^/或其同源物從染 色體中部分或全部缺失。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項所述的細胞，其中ywgJ或其同源物包含至 少一個移碼突變或無義突變。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項所述的細胞，其與其它的等基因但未突變 的細胞相比，YugJ或其同源物的表達水平降低至少兩倍。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-12任一項所述的細胞，其與其它的等基因但未突變 的細胞相比，檢測不到Y(jié)ugJ或其同源物的表達。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項所述的細胞，其中至少一種異源多肽包括酶。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的細胞，其中所述的酶是裂合酶、連接酶、水 解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項所述的細胞，其包含一個或多個在染色體 上整合的、編碼至少一種異源多肽的多核苦酸的拷貝。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的細胞，其中所述至少一種異源多肽 由從至少 一 種異源啟動子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的細胞，其中所述至少一種啟動子包括人工啟 動子。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的細胞，其中所述人工啟動子包含一種或多種 mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選衍生自cry III a啟動子。
20. —種構(gòu)建突變細菌細胞的方法，所述方法包含如下步驟a) 將細菌細胞突變；以及b) 選4奪與其它的等基因4旦未突變的細胞相比，降4氐了 YugJ (SEQ ID NO: 2) 或其同源物的表達水平的突變細胞。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細胞是原核細胞，優(yōu)選革蘭 氏陽性細胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細胞是芽孢桿菌屬細胞。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀 粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、 燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽 孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20-23任一項所述的方法，其中YugJ同源物包含與SEQ ID NO: 2所示序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20-24任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞在 ywgJ(SEQ ID NO: 1 )或其同源物中突變。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中ywgJ同源物編碼具有氨基酸序列 的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2所示序列具有至少70%的同一性。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中少wgJ同源物具有與SEQIDNO: 1 所示序列具有至少70%同一性的核苷酸序列。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞在至 少一個多核苷酸中突變，其中具有至少lOObp大小的所述至少一種多核苷酸 的亞序列與具有SEQ ID NO: 1所示序列或相應(yīng)互補序列的多核苷酸在中等嚴 緊雜交條件下雜交。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞通過
30. 根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞通過在少MgJ或其同源物中引入至少一個移碼突變或無義突變來進行突變。
31. 根據(jù)權(quán)利要求20-30任一項所述的方法，其中步驟(b)中所選擇的細 胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，YugJ或其同源物的表達水平降低了 至少兩4咅。
32. 根據(jù)權(quán)利要求20-31任一項所述的方法，其中步驟(b)中所選擇的細 胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，檢測不到Y(jié)ugJ或其同源物的表達。
33. 根據(jù)權(quán)利要求20-32任一項所述的方法，其中所述至少一種目的異源 多肽包括酶。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解 酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
35. 根據(jù)權(quán)利要求20-34任一項所述的方法，其中所述細胞包含一個或多 個在染色體上整合的、編碼所述至少一種目的異源多肽的多核苷酸的拷貝。
36. 根據(jù)權(quán)利要求20-35任一項所述的方法，其中所述至少一種目的異源 多肽由從至少 一種異源啟動子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述至少一種啟動子包括人工啟 動子。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述人工啟動子包含一種或多種 mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選衍生自cryIII a啟動子。
39. —種產(chǎn)生目的多肽的方法，所述方法包含如下步驟a)在至少50升的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌 細胞，所述培養(yǎng)基包含一種或多種選自由以下物質(zhì)所組成的組的化合物1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘 露醇、赤蘚醇、纖維二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，其在發(fā) 酵之前和/或在發(fā)酵期間加入培養(yǎng)基中，其中所述突變細胞具有降低的YugJ(SEQ ID.NO: 2)或其同源物的表達水平，以及 b)分離目的多肽。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細胞是原核細胞，優(yōu)選革蘭 氏陽性細胞。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細胞是芽孢桿菌屬細胞。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀 粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、 燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽 孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。
43. 根據(jù)權(quán)利要求39-42任一項所述的方法，其中所述YugJ同源物包含 與SEQIDNO: 2所示序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
44. 根據(jù)權(quán)利要求39-43任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞在 ，g/(SEQ ID NO: l)或其同源物中突變。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述YugJ同源物編碼具有氨基 酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所示序列具有至少70%的同 一性。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中.wg/同源物具有與SEQ ID NO: 1 所示序列有至少70%同一性的核苷酸序列。
47. 根據(jù)權(quán)利要求39-46任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞在至 少一個多核苷酸中突變，其中具有至少lOObp大小的所述至少一個多核苷酸 的亞序列與具有SEQ ID NO: 1所示序列或相應(yīng)互補序列的多核苷酸在中等嚴 緊雜交條件下雜交。
48. 根據(jù)權(quán)利要求39-47任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞通過 從細胞的染色體中部分或全部缺失少i^/或其同源物來進行突變。
49. 根據(jù)權(quán)利要求39-47任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞通過 向ywgj或其同源物中引入至少一個移碼突變或無義突變來進行突變。
50. 根據(jù)權(quán)利要求39-49任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞與其 它的等基因但未突變的細胞相比，YugJ或其同源物的表達水平降低了至少兩 倍。
51. 根據(jù)權(quán)利要求39-50任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述細胞與其 它的等基因但未突變的細胞相比，檢測不到Y(jié)ugJ或其同源物的表達。
52. 根據(jù)權(quán)利要求39-51任一項所述的方法，其中所述至少一種目的多肽 包括酶。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解 酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
54. 根據(jù)權(quán)利要求39-53任一項所述的方法，其中所述細胞包含一個或多 個在染色體上整合的、編碼所述至少一種目的多肽的多核苷酸的拷貝。
55. 根據(jù)權(quán)利要求39-54任一項所述的方法，其中所述至少一種目的多肽 由從至少一種異源啟動子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述至少一種啟動子包括人工啟 動子。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述人工啟動子包含一個或多個 mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選A'f生自cry III a啟動子。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種目的異源多肽的突變細菌細胞，其中所述細胞與其它的等基因但未突變的細胞相比，降低了YugJ(SEQ ID NO2)或其同源物的表達水平；產(chǎn)生所述細胞的方法，以及使用所述細胞產(chǎn)生目的多肽的方法。
文檔編號C12N5/10GK101278044SQ200680022607
公開日2008年10月1日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者喬恩·M·珀森, 尼爾斯·班克, 艾倫·K·尼爾森 申請人:諾維信公司