專利名稱：純物理法提取高純度sod的方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種提取SOD的方法，特別是純物理法提取高純度SOD的方法。
背景技術(shù)：
SOD即超氧化歧化酶，英文全稱Super Oxide Dismutase，它是國(guó)際界公認(rèn)的能夠有效清除自由基的酶，是人體中不可缺少的具有特殊生物活性的酶，它能分解自由基，是保護(hù)健康細(xì)胞不受自由基侵害的安全網(wǎng)，當(dāng)SOD與自由基相遇時(shí)，就會(huì)將自由基變成對(duì)人體無(wú)害的水分子和氧分子，進(jìn)而提高人體的免疫力，人體中的SOD會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，為了保持健康，我們就需要從體外攝取SOD，但我們所吃普通食物，由于烹飪、加工和食用后胃酸的破壞，再加之含量極少，我們無(wú)法從食物中攝取SOD。
SOD還是一種廣泛存在于動(dòng)植物中的藥用酶，在各國(guó)醫(yī)學(xué)上有極為廣泛的用途?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，SOD在防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和延緩衰老方面的功效顯著，這一研究結(jié)果使SOD在醫(yī)學(xué)界引起廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有SOD的提取方法，大部分都采用有毒藥劑和有毒的有機(jī)溶劑，對(duì)人們的人身安全造成威脅，同時(shí)帶來(lái)環(huán)境污染，而且工藝復(fù)雜，成本高，提取的SOD純度不高，不適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種成本低，無(wú)毒、無(wú)害，工藝簡(jiǎn)單的純物理法提取高純度SOD的方法，不使用化學(xué)溶劑，可大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)純物理法提取高純度SOD的方法，它包括以下步驟(1)溶血熱變首先取新鮮動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照10～15分鐘，用于預(yù)防瘋牛病、禽流感等高致病性傳染病的傳播，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝15～25∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置1～5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K、維生素E一種或一種以上的復(fù)合維生素保護(hù)劑，800～1200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑榧s1小時(shí)，在70～80℃水浴或恒溫器中熱變25～35分鐘，速凍，靜置1～5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；(2)超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；(3)純化濃縮液在水浴或恒溫器中，70～80℃熱變15～25分鐘后，調(diào)PH值為5.5，3～8分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
通過(guò)上面的敘述可以看出，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)采用純物理法提取，沒(méi)有化學(xué)溶劑，無(wú)毒無(wú)害，可作為藥用、注射用，保證了人身安全，同時(shí)保護(hù)了環(huán)境，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可大規(guī)模進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，制得的SOD純度高，每毫克比活性高達(dá)6000單位。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)1、試驗(yàn)材料1.1樣品(A)SOD樣品市場(chǎng)上購(gòu)買用沉淀法提取的藍(lán)綠色粉末，人體推薦量為6000μ/人；樣品(B)SOD樣品由西藏天使藏醫(yī)科技有限公司用純物理法提取的藍(lán)綠色粉末，人體推薦量為6000μ/人；1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD種大鼠由國(guó)家醫(yī)藥總局四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第95000247號(hào))；2、實(shí)驗(yàn)方法2.1 150-180g成年大鼠，全雌，隨機(jī)分為兩組，每組20只，樣品(A)(B)分別配置成活性為1000μ/M重蒸水溶液，按IMI/100gbw空腹灌胃。分別于灌胃后1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、7小時(shí)分批處死大鼠，收集血液進(jìn)行SOD測(cè)試；2.2檢測(cè)方法SOD測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所一分所提供；測(cè)試方法取血清0.4ml加0.1SDS水溶液，混勻后置37℃水浴30分鐘，取出后冰箱冷至4℃，加入KCL0.05ml，充分混勻后放入冰箱4℃冷凍30分鐘，取出后以3000轉(zhuǎn)/分離心。10分鐘后，取上清液測(cè)試，取上清液30μl，分別加入上述2.1中不同時(shí)間取的試劑，用旋渦混勻器充分混勻，37℃水浴中恒溫40分鐘，再加入顯色劑，10分鐘后蒸餾水調(diào)零在752分光光度計(jì)波長(zhǎng)550mm處比色。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表SOD活性測(cè)試結(jié)果單位Nμ/ml

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩組SOD活力于2小時(shí)后在血液中逐漸升高，其中，A組活力在7小時(shí)時(shí)呈下降，而B(niǎo)組活力7小時(shí)后保存較穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照10分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝15∶1的體積比加入肝素，靜置1小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K的復(fù)合維生素保護(hù)劑，800轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.1小時(shí)，在70℃水浴中熱變35分鐘，速凍，靜置1小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，70℃熱變25分鐘后，調(diào)PH值為5.5，8分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例2首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照15分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝20∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置2小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在75℃恒溫器中熱變30分鐘，速凍，靜置2小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，75℃熱變20分鐘后，調(diào)PH值為5.5，5分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例3首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照12分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝25∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.9小時(shí)，在80℃水浴中熱變25分鐘，速凍，靜置5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，80℃熱變15分鐘后，調(diào)PH值為5.5，3分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例4首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照14分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝18∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置3小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素C保護(hù)劑，900轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.05小時(shí)，在72℃恒溫器中熱變32分鐘，速凍，靜置3小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，78℃熱變17分鐘后，調(diào)PH值為5.5，4分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例5首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照13分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝23∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置4小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素K、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1100轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑榧s0.95小時(shí)，在77℃水浴中熱變27分鐘，速凍，靜置4小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，73℃熱變23分鐘后，調(diào)PH值為5.5，7分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例6首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照11分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝17∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置1.5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素K保護(hù)劑，850轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在73℃水浴中熱變28分鐘，速凍，靜置2小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，77℃熱變18分鐘后，調(diào)PH值為5.5，6分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
實(shí)施例7首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照15分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝22∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置2.5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素E保護(hù)劑，1050轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在76℃恒溫器中熱變26分鐘，速凍，靜置3.5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，74℃熱變22分鐘后，調(diào)PH值為5.5，5分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
權(quán)利要求
1.純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)溶血熱變首先取新鮮動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照10～15分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝15～25∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置1～5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K、維生素E一種或一種以上的復(fù)合維生素保護(hù)劑，800～1200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑榧s1小時(shí)，在70～80℃水浴或恒溫器中熱變25～35分鐘，速凍，靜置1～5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；(2)超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；(3)純化濃縮液在水浴或恒溫器中，70～80℃熱變15～25分鐘后，調(diào)PH值為5.5，3～8分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照10分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝15∶1的體積比加入肝素，靜置1小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K的復(fù)合維生素保護(hù)劑，800轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.1小時(shí)，在70℃水浴中熱變35分鐘，速凍，靜置1小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，70℃熱變25分鐘后，調(diào)PH值為5.5，8分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照15分鐘在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝20∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置2小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素K、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在75℃恒溫器中熱變30分鐘，速凍，靜置2小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，75℃熱變20分鐘后，調(diào)PH值為5.5，5分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照12分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝25∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素C、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.9小時(shí)，在80℃水浴中熱變25分鐘，速凍，靜置5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，80℃熱變15分鐘后，調(diào)PH值為5.5，3分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照14分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝18∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置3小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素C保護(hù)劑，900轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?.05小時(shí)，在72℃恒溫器中熱變32分鐘，速凍，靜置3小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，78℃熱變17分鐘后，調(diào)PH值為5.5，4分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照13分鐘在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝23∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置4小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為包含維生素K、維生素E的復(fù)合維生素保護(hù)劑，1100轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑榧s0.95小時(shí)，在77℃水浴中熱變27分鐘，速凍，靜置4小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，73℃熱變23分鐘后，調(diào)PH值為5.5，7分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照11分鐘在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝17∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置1.5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素K保護(hù)劑，850轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在73℃水浴中熱變28分鐘，速凍，靜置2小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在恒溫器中，77℃熱變18分鐘后，調(diào)PH值為5.5，6分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純物理法提取高純度SOD的方法，其特征在于它包括以下步驟首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照15分鐘，在此血液中按新鮮血液∶抗凝劑＝22∶1的體積比加入抗凝劑，抗凝劑為肝素，靜置2.5小時(shí)后，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入1倍體積的維生素保護(hù)劑，維生素保護(hù)劑為維生素E保護(hù)劑，1050轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杵扑?小時(shí)，在76℃恒溫器中熱變26分鐘，速凍，靜置3.5小時(shí)，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)截留分子量為6000的中孔纖維超濾機(jī)不斷加入凍純水，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液在水浴中，74℃熱變22分鐘后，調(diào)PH值為5.5，5分鐘后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了純物理法提取高純度SOD的方法，首先溶血熱變?nèi)⌒迈r動(dòng)物血液為原料，用鈷60輻照10～15分鐘，再加入肝素作為抗凝劑，靜置，倒去上層血清，在紅細(xì)胞中加入維生素保護(hù)劑，攪拌破碎，熱變，速凍，靜置，除去沉淀物，收集清明濾液；超濾濃縮將清明濾液經(jīng)中孔纖維超濾機(jī)，除去小分子雜質(zhì)后再經(jīng)濃縮得濃縮液；純化濃縮液熱變后，調(diào)pH值后速凍離心，超濾濃縮，即得高純度SOD。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)采用純物理法提取，沒(méi)有化學(xué)溶劑，無(wú)毒無(wú)害，可作為藥用、注射用，保證了人身安全，同時(shí)保護(hù)了環(huán)境，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可大規(guī)模進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，制得的SOD純度高，每毫克比活性高達(dá)6000單位。
文檔編號(hào)C12N9/08GK1884504SQ20061002124
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者陳穎敏 申請(qǐng)人:陳穎敏