專利名稱：一種拆分β－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種拆分β-氨基酸的方法，具體地說是用兩種?；??；D(zhuǎn)移酶)來拆分制備單一構(gòu)型β-氨基酸的方法，屬于有機(jī)合成領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性的β-氨基酸存在于天然物質(zhì)如生物堿和抗生素中，游離態(tài)的光學(xué)活性非天然氨基酸及其衍生物表現(xiàn)出令人感興趣的藥理作用，而且也用于改性肽的合成，它們作為醫(yī)藥制備重要中間體的日益重要性，他們的分離愈加引起了人們的興趣。光學(xué)活性的β-氨基酸是許多國外已上市或準(zhǔn)備上市的藥物的重要中間體。如Vicuron制藥公司開發(fā)的抗菌藥Deoxynegamycin(2-[2-[3(R)，6-Diaminohexanoyl]-1-methylhydrazino]acetic acid)，NitroMed公司開發(fā)的心血管藥Paclitaxel-SNO(7-O-[3-Methyl-3-butyryl]paclitaxel)(nitrososulfanyl)，Merck KGaA公司開發(fā)的治療胃腸道疾病的抗生素阿撲西林(Aspoxicillin)，用于抑制乳汁分泌的甲麥角(Metergoline)，用于治療惡性腫瘤烏苯美司(Ubenimex)，抗?jié)儾∷幜_塞帕泛(Rotraxate)等等。
作為單一構(gòu)型β-氨基酸制備方法，迄今已建立了經(jīng)由非對(duì)映異構(gòu)鹽的常規(guī)外消旋體拆分方法(建議路線H.Boesch et al.，Org.Proc.Res.Developm.2001，5，23-27)，特別是苯乙基酰胺鋰的非對(duì)映選擇性加成的拆分方法(A.F.Abdel-Mafid，J.H.Cohen，C.A.Maryanoff，Curr.Med.Chem.1999，6，955-970)。盡管會(huì)帶來許多不利，但是后者方法已經(jīng)被集中研究并優(yōu)選使用。一方面，需要化學(xué)計(jì)量的手性試劑，與催化不對(duì)稱方法相比，這是主要的缺點(diǎn)。此外，需要昂貴且危險(xiǎn)的輔助物質(zhì)，如正丁基鋰來通過去質(zhì)子化而活化化學(xué)計(jì)量試劑。另外，為了得到滿意的立體選擇性，在約-70℃的低溫進(jìn)行反應(yīng)是重要的，這意味著對(duì)反應(yīng)器材料、附加成本及高能量消耗的高要求。
通過生物催化方式制備光學(xué)活性的β-氨基酸，它不需要使用化學(xué)計(jì)量的手性試劑，只需要使用少量的催化酶，酶是對(duì)自然和環(huán)境友好的催化劑。與大量合成的含金屬催化劑相比，除了它們的催化特性和高活性外，這些在水介質(zhì)中高效使用的生物催化劑具有可能不需要使用含金屬、尤其是含重金屬并因此是有毒物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。
例如，在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)映選擇性的β-氨基羧酸的N-酰化已經(jīng)被報(bào)道多次。
例如，于TetrahedronAsymmetry，Vol.7，No.6，p.1707-1716，1996，L.T.Kanerva等人描述了不同脂環(huán)族β-氨基羧酸乙酯在有機(jī)溶劑中使用2，2，2-三氟乙酯和來自Candida antarctica脂肪酶SP526或者來自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS作為生物催化劑的對(duì)映選擇性N-?；?。
V.M.Sanchez等研究了使用來自Candida antarctica的脂肪酶經(jīng)由N-?；?氨基羧酸酯制備的(±)-乙基-3-氨基丁酸酯的生物催化外消旋體拆分(TetrahedronAsymmetry，Vol.8，No.1，p.37-40)。
EP-A-8 890 649公開了在水解酶存在下通過羧酸酯的對(duì)映選擇性?；瘡耐庀被狨ブ兄苽涔饣钚园被狨ィ约敖又蛛x未轉(zhuǎn)換氨基酸酯對(duì)映體的方法，其中水解酶自選包括酰胺酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶。
為了得到單一構(gòu)型的β-氨基酸，很久前就已知將它們的酯與脂肪酶反應(yīng)。在US5518903中，該原理已被轉(zhuǎn)化為N-保護(hù)的β-氨基酸，但是卻有不同的成功程度。當(dāng)只有外消旋N-叔丁氧基羰基-β-氨基酸的相應(yīng)芐基酯可以通過脂肪酶以高度對(duì)映選擇性方式拆分時(shí)，殘留的甲基酯和正丁基酯僅實(shí)現(xiàn)ee值在70％左右。需要注意的是從相應(yīng)甲基酯到正丁基酯的轉(zhuǎn)變明顯伴隨著所制備酸ee值的降低。例如，用得自Asahi的脂肪酶從N-Boc-β-氨基酸起始的酯水解在8天后以37％的產(chǎn)率給出相應(yīng)酸的ee值為45％ee。使用得自Amano的脂肪酶PS時(shí)，相同反應(yīng)在7天內(nèi)以41％的產(chǎn)率可以獲得富集到61％ee的化合物。相比而言，相應(yīng)的甲基酯為70％ee。
最近Faulconbridge等報(bào)道的結(jié)果表明用Amano的脂肪酶PS在pH8時(shí)發(fā)生芳香β-氨基羧酸乙酯的酯水解，帶有可接受的產(chǎn)率和非常好的對(duì)映體過量(Tetrahedron Letters2000，41，2679-81)。獲得產(chǎn)品的對(duì)映體純度高達(dá)99％，但是該合成僅僅在懸浮液中進(jìn)行，有一些缺點(diǎn)。一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管在這些條件下結(jié)晶是選擇性的，但是，反應(yīng)本身導(dǎo)致了較低的ee值為85.1％ee?？傊?，這意味著一方面由于形成不希望的對(duì)映體而造成產(chǎn)率的損失，另一方面由于改變的結(jié)晶條件，與輕微的方法變化有關(guān)的ee值可能容易地降到99％ee以下，或者甚至降到商業(yè)規(guī)格98％ee以下。特別是R為烷基的ee值很難達(dá)到98％以上。但是，藥物應(yīng)用需要盡可能高的ee值＞98％ee，尤其是＞99％ee。該方法還有一個(gè)很大的缺點(diǎn)是β-氨基酸的酯同樣是一個(gè)極性很大的化合物，在水中，分離β-氨基酸的酯和β-氨基酸是一件困難的事情，特別是R為短鏈烷基的β-氨基酸。這種方法在選擇性上的不穩(wěn)定性，在分離方法的繁瑣都限制了其在工業(yè)規(guī)模上的應(yīng)用。
WO-A-98/50575報(bào)道了為了立體選擇性地?；庀?氨基羧酸的對(duì)映體，外消旋N-苯乙?；?氨基酸與青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在一定條件下接觸，從而獲得手性β-氨基羧酸的方法。其中，R構(gòu)型得到游離的氨基酸＞99％ee，而S構(gòu)形基本上未轉(zhuǎn)化。未轉(zhuǎn)化的S-N-苯乙?；?氨基酸再用化學(xué)方法脫掉苯乙?；Ｗo(hù)基(自然界尚未發(fā)現(xiàn)催化該構(gòu)型苯乙?；獾拿?，得到S構(gòu)形的β-氨基羧酸。但通常S構(gòu)型的β-氨基酸ee值為95％以下且不確定(80-95％ee)。該方法還有一個(gè)主要的缺點(diǎn)是苯乙?；乔嗝顾谿?；D(zhuǎn)移酶唯一可以作用的底物；而N-苯乙?；?β-氨基酸的合成需要苯乙酰氯作為原料，一方面，苯乙酰氯氣味難聞，有較大的毒性和腐蝕性，不符合環(huán)保要求，另一方面，其昂貴的價(jià)格也是不能忽略的缺點(diǎn)。也已經(jīng)研究了相反的反應(yīng)順序(V.A.Soloshonok，V.K.Svedas，V.P.Kukhar，A.Gkirilenko，A.V.Rybakova，V.A.Solodenko，N.A.Fokina，O.V.Kogut，I.Y.Galaev，E.V.Kozlova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，Synlett1993，399-341；V.Soloshonok，A.G.Kirilenko，N.A.Fokina，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，V.P.Kukhar，V.K.Svedas，E.V.Kozlova，TetrahedronAsymmetry，1994，5，1119-1126；V.Soloshonok，N.A.Fokina，A.V.Rybakova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，A.E.Sochorinsky，V.P.Kukhar，M.V.Savchenko，V.K.Svedas，TetrahedronAsymmetry，1995，6，1601-1610；G.Cardillo，A.Tolomelli，C.Tomasini，Eur.J.Org.Chem.1999，155-161)。該方法是在有機(jī)相中，用青霉素G?；D(zhuǎn)移酶合成R構(gòu)型的N-苯乙酰基β-氨基酸(98％)，S構(gòu)型的游離氨基酸(95％ee)。該方法的缺點(diǎn)是產(chǎn)物混合物很難進(jìn)行隨后的分離。分離游離β-氨基羧酸后，獲得很難分離的苯乙酸和N-苯乙?；?β-氨基羧酸的混合物。還有個(gè)重要的缺陷是文獻(xiàn)采用的酶是Altus公司的交聯(lián)酶晶體，價(jià)格昂貴，不可能達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的規(guī)模，采用國產(chǎn)的固定化青霉素G酰化酶根本不能發(fā)生上述的反應(yīng)。
單一構(gòu)型β-氨基酸在藥物合成中占有的重要地位，要求這些重要的β-氨基酸能工業(yè)化生產(chǎn)。這需要穩(wěn)定，環(huán)保，安全，低成本且不苛刻的生產(chǎn)條件。迄今為止的文獻(xiàn)方法不能實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明的目的在于提供一種拆分β-氨基酸的方法，它是將氨基酸N?；螅ㄟ^酶解，其中一種構(gòu)型的N酰化β-氨基酸的?；猓玫綄?duì)應(yīng)的β-氨基酸，而它的對(duì)應(yīng)構(gòu)型N酰化β-氨基酸的不被水解，從而根據(jù)上述物質(zhì)的脂水溶解性質(zhì)的差異通過萃取分開；再用選擇另一種酶將對(duì)應(yīng)構(gòu)型N?；?氨基酸水解得到相應(yīng)氨基酸，從而得到單一構(gòu)型β-氨基酸。
具體地說，方法之一，它是通過β-氨基酸?；?β-Amino acylase)專一性水解(R)構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基，生成游離的R-β-氨基酸，而(S)構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基不被水解而拆分消旋β-氨基酸，分別得到(R)構(gòu)型和(S)構(gòu)型的β-氨基酸的方法；其中，所述β-氨基酸?；甘窃从赑seudomonas putida IFO 12996，Brevibacillus agri NCHU1002等菌株的β-氨基酸?；?β-Amino acylase)。不同菌株來源的酶同源性在90％左右，認(rèn)為是同一種酶。這種酶的特點(diǎn)是可以高度專一性水解(R)構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基，生成游離的R-β-氨基酸，而(S)N-?；?氨基酸不能被該酶作用。該種酶在天然狀態(tài)下，可以水解的?；柞；?，乙酰基，丙酰基，正丁酰基，并且這些酰基的氫原子可以被一個(gè)或者多個(gè)鹵素原子取代，這些氫原子同樣可以被氨基取代。
方法之二，它是通過源于豬腎的氨基?；窱(porcine kidney acylase I)專一性水解(S)構(gòu)型N-酰基β-氨基酸的酰胺基，生成游離的S-β-氨基酸，而(R)構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基不被水解而拆分消旋β-氨基酸，分別得到(S)構(gòu)型和(R)構(gòu)型的β-氨基酸的方法。
方法之三，它是通過采用PEG與2吡啶基二硫修飾，使PEG通過二硫鍵直接連接到酶蛋白的巰基上得到的修飾酶催化水解S構(gòu)型N-苯乙?；?氨基酸，得到游離的S構(gòu)型β-氨基酸，而R構(gòu)型的N-苯乙?；?氨基酸分離后采用化學(xué)方法水解或者青霉素G?；D(zhuǎn)移酶水解得到游離的N構(gòu)型β-氨基酸。
本發(fā)明拆分方法所述β-氨基酸為伯氨基(-NH2)與β炭原子直接相連的氨基酸分子。具有以下結(jié)構(gòu) 其中，R1代表(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-環(huán)烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-雜芳基；R2代表H、(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-環(huán)烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-雜芳基。
拆分前所述β-氨基酸轉(zhuǎn)換成具有以下結(jié)構(gòu)的N-酰基β-氨基酸作為拆分的底物 其中，R3代表(C1-C4)-烷基，或這些?；?個(gè)氫原子可以被其他原子或基團(tuán)(主要是鹵素原子或者氨基取代)，或苯乙基。
原則上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以隨意選擇?；Ｓ糜诒Ｗo(hù)氨基的?；康氖莾煞N構(gòu)型的產(chǎn)物可以方便的分離?；谶@種考慮，對(duì)于大極性氨基酸，需要能減小其極性的?；詭椭鷥蓚€(gè)構(gòu)型產(chǎn)物的分離，很自然的，本發(fā)明采用了芳?；５笆龅倪@種天然的β-氨基酸?；覆荒艽呋疦-芳酰基β-氨基酸的水解，來源于豬腎的氨基?；?(porcine kidney acylase I)也沒有需要的功能。
通過比較β-氨基酸?；概c青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)序列上的差異，采用PEG-胺修飾蛋白質(zhì)巰基的方法(C Paul，J Vincentelli..Phytochemistry351413-1417，1994)。經(jīng)過修飾的新酶可以催化大部分N-芳酰基β-氨基酸的選擇性水解。經(jīng)過該方法修飾后，新酶催化水解S構(gòu)型N-苯乙酰基β-氨基酸水解，產(chǎn)生游離的S構(gòu)型氨基酸，R構(gòu)型的N-苯乙?；?氨基酸可以采用化學(xué)方法水解或者青霉素G?；D(zhuǎn)移酶水解。
因此本發(fā)明采用PEG的2吡啶基二硫衍生物修飾β-氨基酸?；?，使PEG通過二硫鍵直接連接到酶蛋白的巰基上得到。該酶在天然狀態(tài)下不能水解N-苯乙?；?氨基酸；但在用PEG-胺修飾之后可以水解S-N-苯乙酰基β-氨基酸，生成游離的S-β-氨基酸。該酶的天然狀態(tài)解釋為該酶的氨基酸殘基沒有經(jīng)過化學(xué)修飾。該酶任何形式的固定化仍屬于天然狀態(tài)。與之對(duì)應(yīng)的選擇水解R-N-苯乙酰基β-氨基酸的酶，是青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，可以得到游離的R-β-氨基酸。該方法主要針對(duì)大極性β-氨基酸，采用苯乙酰基，可以減小極性，方便兩個(gè)構(gòu)型之間產(chǎn)物的分離。
具體地說，本發(fā)明可以通過以下任一方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供的拆分β-氨基酸的方法之一，包括以下步驟a、合成消旋體化合物N酰化β-氨基酸；
b、pH為7.0-8.0條件下，30-50℃溫度，用β-氨基酸?；?β-Amino acylase)水解反應(yīng)10-1000分鐘后，調(diào)節(jié)pH為1-3，用疏水性溶劑，比如MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，水相為R-β-氨基酸；有機(jī)相為(S)構(gòu)型N-酰基β-氨基酸；c、(S)構(gòu)型N-酰基β-氨基酸于pH為7.8-8.0條件下，30-40℃反應(yīng)溫度下加入氨基酰化酶I(porcine kidney acylase I)，反應(yīng)10-1000分鐘，得到S-β-氨基酸。
本發(fā)明提供的拆分β-氨基酸的方法之二，包括以下步驟a、合成消旋體化合物N酰化β-氨基酸；b、pH為7.8-8.0條件下，30-40℃溫度，用氨基?；窱(porcine kidney acylase I)水解反應(yīng)(10-1000)分鐘后，調(diào)節(jié)pH為1-3，用疏水性溶劑，比如MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，水相為S-β-氨基酸；有機(jī)相為(R)構(gòu)型N-?；?氨基酸；c、(R)構(gòu)型N-?；?氨基酸，于pH為7.0-8.0條件下，30-50℃反應(yīng)溫度下加入β-氨基酸?；?β-Amino acylase)，反應(yīng)10-1000分鐘，得到R-β-氨基酸。
本發(fā)明提供的拆分β-氨基酸的方法之三，包括以下步驟a、合成消旋體化合物N?；?氨基酸；b、β-Amino acylase的修飾PEG與2吡啶基二硫聯(lián)結(jié)成衍生物，將酶蛋白置于緩沖液中，加入PEG的2吡啶基二硫衍生物，0-5℃緩慢攪拌12小時(shí)，再用石油醚萃取，低溫抽走石油醚，得到修飾酶；c、消旋體化合物N?；?氨基酸，于pH為7.0-8.0，在30-50℃反應(yīng)溫度下加入修飾后的β-Amino acylase，1-10小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH為1-3，疏水性溶劑，比如MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，水相為S-3氨基-己酸；有機(jī)相蒸干后得到R-N?；?氨基酸；d、R-N?；?氨基酸，溶于氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7.5-8.0，在20-30℃反應(yīng)溫度下加入青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶，1-10小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，結(jié)束反應(yīng)得到R-β-氨基酸。
上述方法中，在水相的S-β-氨基酸或R-β-氨基酸在量大時(shí)都可通過結(jié)晶方式得到，也可以在pH為8.5-11，加入Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)0.5-3小時(shí)后，調(diào)節(jié)pH為1-3，用疏水性溶劑，比如MTBE(甲基叔丁基醚)萃取、蒸干溶劑，得到Boc保護(hù)的相應(yīng)構(gòu)型的氨基酸，通過HCl溶液水解，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，收集得到相應(yīng)構(gòu)型的氨基酸。
本發(fā)明涉及到的反應(yīng)參數(shù)通常是由常規(guī)試驗(yàn)對(duì)每種情況單獨(dú)確定。對(duì)于本發(fā)明采用的溫度，最重要的指標(biāo)是反應(yīng)溫度下該酶的選擇性是否能使目標(biāo)化合物達(dá)到要求的ee％，從比較研究發(fā)現(xiàn)，30-40℃條件下，所使用的?；D(zhuǎn)移酶都能保證很快的反應(yīng)速度和很高的選擇性。關(guān)于反應(yīng)的pH，對(duì)于β-氨基酸?；?，pH在7-8，對(duì)反應(yīng)速度和選擇性沒有影響；對(duì)于來源于豬腎的氨基?；?(porcine kidney acylase I)，則要求pH精確控制在7.8-8.0；青霉素G?；D(zhuǎn)移酶則需要pH精確控制在7.5-8.0，才能保證較快的反應(yīng)速度。
本發(fā)明的反應(yīng)可以在為此提供的任何容器中進(jìn)行。這些反應(yīng)容器包括常規(guī)間歇式反應(yīng)釜，環(huán)管式反應(yīng)器，酶-膜反應(yīng)器。在發(fā)明者的研究中，從1mL到10m3規(guī)模，該方法，無論是天然狀態(tài)的酶還是經(jīng)修飾的酶都有相同的效果。本發(fā)明采用水相介質(zhì)，但某些情況下，向反應(yīng)體系中加入水溶性有機(jī)溶劑是有利的，這種有利表現(xiàn)在對(duì)于某些N-?；?氨基酸，加入有機(jī)溶劑后，其濃度增大，提高了效率；對(duì)某些結(jié)構(gòu)的β-氨基酸，其ee％有所提高。
本發(fā)明涉及的化合物結(jié)構(gòu)中，(C1-C8)-烷基被認(rèn)為是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，包括雙健不同位置的所有異構(gòu)體。它們可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基單取代或多取代。(C3-C8)-烷基也可以這么認(rèn)為。
(C2-C8)-烯基被理解成是除甲基外，含有至少一個(gè)雙健的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C2-C8)-炔基被理解成是除甲基外，含有至少一個(gè)三健的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-酰基被理解成是經(jīng)由-C＝O-官能團(tuán)與分子結(jié)合的(C1-C8)-烷基。
(C3-C8)-環(huán)烷基被理解成是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基等。它們可以被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子和/或含N、O、P、S原子的基團(tuán)所取代、和/或具有含有N、O、P、S原子的環(huán)基團(tuán)，例如1-，2-，3-，4-哌啶基、1-，2-，3-吡咯烷基、2-，3-四氫呋喃基、2-，3-，4-嗎啉基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-?；?、(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C6-C18)-芳基被理解成是含有6到18個(gè)碳原子的芳基基團(tuán)。得別的，它們包含苯基、蒽基、菲基、聯(lián)苯基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-?；?、(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
(C7-C19)-芳烷基是經(jīng)由(C1-C8)-烷基與分子結(jié)合的(C6-C18)-芳基。
(C1-C8)-烷氧基是經(jīng)由氧原子與所述分子鍵合的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-烷氧羰基是經(jīng)由-OC(O)-官能團(tuán)與所述分子結(jié)合的(C1-C8)-烷基。相同的描述類似地應(yīng)用于其它的氧羰基。
(C1-C8)-鹵烷基由一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的(C1-C8)-烷基。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，(C3-C18)-雜芳基表示具有3到18個(gè)碳原子并且在環(huán)上含有諸如N、O、S雜原子的五、六、七原芳環(huán)系統(tǒng)。這些芳環(huán)化合物被特別地認(rèn)為是如下基團(tuán)1-，2-，3-呋喃基、1-，2-，3-吡咯基、1-，2-，3-噻吩基、2-，3-，4-吡啶基、2-，3-，4-，5-，6-，7-吲哚基、3-，4-，5-吡唑基、2-，4-，5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基、2-，3-，4-，5-，6-嘧啶基。此類基團(tuán)可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-鹵烷基、OH、鹵素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基單取代或多取代。
C4-C19-雜芳烷基被理解成相應(yīng)于(C7-C19)-芳烷基的雜芳香系統(tǒng)。
適當(dāng)?shù)柠u素是氟、氯、溴和碘。
本發(fā)明的特點(diǎn)是采用兩種具有不同選擇性的酰化酶(酰基轉(zhuǎn)移酶)來拆分N-?；?氨基酸。其優(yōu)點(diǎn)之一是可以用最溫和的生物催化的方法得到任何一種需要構(gòu)型的β-氨基酸。避免了某些特殊結(jié)構(gòu)β-氨基酸在強(qiáng)酸性條件下分解的可能。優(yōu)點(diǎn)之二是可以根據(jù)需要的構(gòu)型選擇酶，用最短的步驟得到需要的產(chǎn)品，大大提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明提供的拆分方法從經(jīng)濟(jì)和生態(tài)學(xué)角度來看，是對(duì)商業(yè)規(guī)模有利的方法，也就是說該方法在環(huán)境的相容性、工作區(qū)的安全性和方法的穩(wěn)健性，以及時(shí)空效率和選擇性方面特別突出。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一(比較例1 3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯的拆分)a，底物的合成10g3-苯基-3-氨基-丙酸(購買)裝入100mL反應(yīng)瓶，加入50mL乙醇，0℃滴加5g二氯亞砜，室溫反應(yīng)約2-8小時(shí)，反應(yīng)完畢。蒸干溶劑，得3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯的鹽酸鹽13g，收率95％；b，拆分反應(yīng)及檢測10mmol(毫摩爾)消旋體化合物3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯的鹽酸鹽，溶于50mL水，調(diào)節(jié)pH為7.5-8.5。在30℃反應(yīng)溫度下加入10mgAmano脂肪酶PS，3小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，取出部分反應(yīng)液處理。加入50mL乙酸乙酯萃取(R)3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，得(R)3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯1.5g，測定ee值為40％；水相調(diào)節(jié)pH為9-10，加入適量Boc20(碳酸二叔丁酯)，反應(yīng)室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸1g；測定ee值為90％.為處理的反應(yīng)液繼續(xù)反應(yīng)8小時(shí)，按前述的分離方法分離得到(R)3-苯基-3-氨基-丙酸乙酯，ee值為80％；(S)S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸，ee值為85％。ee值用HPLC確定。
實(shí)施例二(比較例2 3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸的拆分)a、消旋體底物的合成10g3-苯基-3-氨基-丙酸(購買)裝入100mL反應(yīng)瓶，加入50mL水，加入碳酸鉀12.5g，-20℃滴加苯乙酰氯14.5g，低溫(0℃以下)反應(yīng)2小時(shí)。調(diào)節(jié)pH為1，析出白色固體16g，收率93％。
b、拆分反應(yīng)及檢測10mmol消旋體化合物3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸，溶于50mLNaOH溶液(1mol/L)，調(diào)節(jié)pH為7.5-8.5。在30℃反應(yīng)溫度下加入10mg青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，30分鐘反應(yīng)時(shí)間后，取部分反應(yīng)液分離產(chǎn)物。用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸，測定ee值為70％；萃取后的水層用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸.測定ee值為99％。未處理的部分繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，按相同的方法分離產(chǎn)物，(S)-3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸的ee值為99％.，R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸ee值為95％。
c、(S)-3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸的脫苯乙?；磻?yīng)及檢測。
(S)-3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸加入6NHCl回流水解苯乙?；?，6小時(shí)后反應(yīng)完全，蒸干水，得(S)-3-苯基-3-氨基-丙酸的鹽酸鹽，溶于20ml水。用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸。測得ee值為85％。ee值用HPLC確定實(shí)施例三 用兩種酶拆分3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸(小試)a、合成消旋體底物3-苯基-3-氨基-丙酸可以從市場方便的買到。將10mmol消旋體化合物3-苯基-3-氨基-丙酸溶于10mLNaOH溶液(2mol/L)。0℃下滴加醋酸酐12毫摩爾，5分鐘后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取產(chǎn)物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸。
b、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及檢測10mmol消旋體化合物3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，溶于50mlNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入10mgβ-Amino acylase，30min反應(yīng)時(shí)間后，用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，測定ee值為90％；萃取后的水層用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)，1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸，測定ee值為99％，轉(zhuǎn)化率為45％。R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為R-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.5克，產(chǎn)率80％。
c、氨基?；?(porcine kidney acylase I)催化的拆分1克，約5mmolS-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，溶于20mlNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10mg氨基酰化酶1(porcine kidney acylase I)，5分鐘后，底物完全反應(yīng)，反應(yīng)液用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸。S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為S-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.45克，產(chǎn)率70％，ee值為99％。ee值用HPLC確定。
實(shí)施例四 用兩種酶拆分3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸(放大)a、合成消旋體底物200L反應(yīng)釜，加入100L水，加入8kgNaOH，溶解后，加入25kg3-苯基-3-氨基-丙酸，體系降溫至0℃，滴加醋酸酐10kg，反應(yīng)1小時(shí)后，再加入2kgNaOH，然后在滴加醋酸酐6kg，1小時(shí)后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為1，析出白色固體，過濾(或離心)，再用清水洗滌，烘干，得3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸30kg，收率95.65％.化學(xué)純度99％。
b、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及產(chǎn)物純化檢測用1000L反應(yīng)釜的放大試驗(yàn)。20.7kg(100mol)消旋體化合物3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，溶于500LNaOH(4.2kg)溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入100gβ-Amino acylase，3小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，測定(R)-3-苯基-3-氨基-丙酸的轉(zhuǎn)化率和ee％。轉(zhuǎn)化率為45％，ee值為99％ee；(S)-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸的ee值為90％，結(jié)束反應(yīng)。拆分后的反應(yīng)液用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，析出為反應(yīng)的S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸8kg，再用MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未析出的S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，蒸干得S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸2kg。
水相用碳酸鉀調(diào)節(jié)pH為6.5，60℃減壓蒸餾蒸掉約400升水，開始析出固體，加入約100L乙醇，降溫至0℃，攪動(dòng)1小時(shí)，析出大量白色固體。離心分離固體，并用約50L水洗滌固體，烘干，得固體6.2kg，為產(chǎn)品R-3-苯基-3-氨基-丙酸，純度99％，收率75％。
c、氨基酰化酶1(porcine kidney acylase I)催化的拆分10kg S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，溶于200LNaOH(2KG)溶液，調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10g氨基?；?(porcine kidney acylase I)，1小時(shí)后，底物完全反應(yīng)，ee值為99％。調(diào)pH為6.5，60℃減壓蒸餾蒸掉約150L水，加入乙醇50L，降溫至0℃，攪動(dòng)1小時(shí)，析出大量白色固體。離心分離固體，并用約50L水洗滌固體，烘干，得固體5.5kg，為產(chǎn)品S-3-苯基-3-氨基-丙酸，化學(xué)純度99％，收率66.7％。
產(chǎn)物的化學(xué)純度，ee值用HPLC確定。
實(shí)施例五 3-乙酰氨基-3-喹啉-丙酸的拆分a、合成消旋體底物3-喹啉-3-氨基-丙酸可以簡單的合成。將10mmol消旋體化合物3-喹啉-3-氨基-丙酸溶于10mLNaOH溶液(2mol/L)。0℃下滴加醋酸酐12mmol，5分鐘后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取產(chǎn)物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得3-喹啉-3-乙酰氨基-丙酸。
b、氨基?；?(porcine kidney acylase I)催化的拆分及檢測10mmol消旋體化合物3-Acetylamino-3-quinolin-3-yl-propionic acid(3-乙酰氨基-3-喹啉-丙酸)，溶于50mLNaOH溶液，，加入乙醇20mL，使完全溶解。調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入10mg氨基?；?(porcine kidney acylase I)，1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，結(jié)束反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH為3，蒸干乙醇，析出(R)3-乙酰氨基-3-喹啉-丙酸。再用MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，蒸干得到(R)3-乙酰氨基-3-喹啉-丙酸，共計(jì)1.2g，約5mmol。水相調(diào)節(jié)pH為8.8，蒸掉大部分水，加入乙醇，析出固體(S)3-氨基-3-喹啉-丙酸1g，，轉(zhuǎn)化率為45％，ee值為99％ee，化學(xué)純度99％。
c、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及產(chǎn)物純化檢測分離出(R)3-乙酰氨基-3-喹啉-丙酸1.2克，約5mmol，溶于20mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10mgβ-Amino acylase，1小時(shí)后，調(diào)節(jié)pH為8.8，蒸掉大部分水，加入乙醇，析出固體(R)3-氨基-3-喹啉-丙酸1g，，ee值為99％，化學(xué)純度99％，收率90％?；瘜W(xué)純度和ee值用HPLC確定。
實(shí)施例六 3-苯乙酰氨基-己酸的拆分a、合成消旋體底物3-氨基-己酸可以從市場容易的買到。13.1g(0.1mol)3-氨基-己酸(購買)裝入100mL反應(yīng)瓶，加入50mL水，加入碳酸鉀18.5g，-20℃滴加苯乙酰氯16.5g，低溫(0℃以下)反應(yīng)2小時(shí)。調(diào)節(jié)pH為1，析出白色固體20g，用水，石油醚洗滌，收率80％，純度95％。
b、β-Amino acylase的修飾PEG與2吡啶基二硫聯(lián)結(jié)成衍生物，將酶蛋白置于緩沖液中，加入PEG的2吡啶基二硫衍生物，0℃緩慢攪拌12小時(shí)。再用石油醚萃取，低溫抽走石油醚，得到修飾酶。修飾酶用3-苯基-3-苯乙酰氨基-丙酸作為標(biāo)準(zhǔn)底物測定活性，1個(gè)活性單位u表示1分鐘，催化1mmol底物轉(zhuǎn)化所需要的酶量。經(jīng)修飾后，酶活力達(dá)到200u/g以上活力的修飾酶可以用來做反應(yīng)。
c、修飾后的β-Amino acylase拆分反應(yīng)及產(chǎn)物純化檢測10mmol消旋體化合物3-苯乙酰氨基-己酸，溶于50mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在50℃反應(yīng)溫度下加入10mg修飾后的β-Amino acylase，1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，結(jié)束反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取(R)-3-苯乙酰氨基-己酸，蒸干后得到1.5g(R)-3-苯乙酰氨基-己酸，ee值為70％。水相調(diào)節(jié)pH為10.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-N-Boc-己酸，測定ee值為99％。S-3-N-Boc-己酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為S-3氨基-己酸，得0.45克，產(chǎn)率70％。
d、青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶催化的拆分反應(yīng)及產(chǎn)物純化檢測(R)-3-苯乙酰氨基-己酸，溶于20mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.5-8.0。在25℃反應(yīng)溫度下加入10mg青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，結(jié)束反應(yīng)。用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯乙酰氨基-己酸，水相調(diào)節(jié)pH為10.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-N-Boc-己酸，測定ee值為99％。R-3-N-Boc-己酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為R-3氨基-己酸，得0.5克，產(chǎn)率75％。
實(shí)施例七 3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸拆分a、合成消旋體底物3-苯基-3-氨基-丙酸可以從市場方便的買到。將10mmol消旋體化合物3-苯基-3-氨基-丙酸溶于10mLNaOH溶液(2mol/L)。0℃下滴加丙酸酐12mmol，5分鐘后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取產(chǎn)物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸。
b、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及檢測10mmol消旋體化合物3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸，溶于50mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入10mgβ-Amino acylase，50分鐘反應(yīng)時(shí)間后，用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸，測定ee值為90％；萃取后的水層用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸.測定ee值為99％，轉(zhuǎn)化率為45％。R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為R-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.5克，產(chǎn)率80％。
c、氨基?；?(porcine kidney acylase I)催化的拆分1克，約5mmolS-3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸，溶于20mlNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10mg氨基?；?(porcine kidney acylase I)，30分鐘后，底物完全反應(yīng)，拆分后的反應(yīng)液用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸。S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為S-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.45克，產(chǎn)率70％，ee值為99％。ee值用HPLC確定。
這兩種酶拆分3-苯基-3-丙酰氨基-丙酸的反應(yīng)速度比拆分3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸要慢一些。
實(shí)施例八 3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸拆分a、合成消旋體底物3-苯基-3-氨基-丙酸可以從市場方便的買到。將10mmol消旋體化合物3-苯基-3-氨基-丙酸溶于10mLNaOH溶液(2mol/L)。0℃下滴加丁酸酐12毫摩爾，5分鐘后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取產(chǎn)物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸。
b、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及檢測10mmol消旋體化合物3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸，溶于50mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入10mgβ-Amino acylase，2小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后，用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸，測定ee值為90％；萃取后的水層用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸.測定ee值為99％，轉(zhuǎn)化率為45％。R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為R-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.5克，產(chǎn)率80％。
c、氨基?；窱(porcine kidney acylase I)催化的拆分1克，約5mmolS-3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸，溶于20mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10mg氨基?；?(porcine kidney acylase I)，3小時(shí)后，底物完全反應(yīng)，拆分后的反應(yīng)液用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸。S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為S-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.45克，產(chǎn)率70％，ee值為99％。ee值用HPLC確定。
這兩種酶拆分3-苯基-3-丁酰氨基-丙酸的反應(yīng)速度更慢。
實(shí)施例九 用兩種酶拆分3-苯基-3-氯乙酰氨基-丙酸a、合成消旋體底物3-苯基-3-氨基-丙酸可以從市場方便的買到。將10mmol消旋體化合物3-苯基-3-氨基-丙酸溶于10mLNaOH溶液(2mol/L)。0℃下滴加氯乙酸酐12毫摩爾，5分鐘后反應(yīng)完全。調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取產(chǎn)物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得3-苯基-3-氯乙酰氨基-丙酸。
b、β-Amino acylase拆分反應(yīng)及檢測10mmol消旋體化合物3-苯基-3-氯乙酰氨基-丙酸，溶于50mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.0-8.0。在40℃反應(yīng)溫度下加入10mgβ-Amino acylase，20分鐘反應(yīng)時(shí)間后，用1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取未反應(yīng)的S-3-苯基-3-氯乙酰氨基-丙酸，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-乙酰氨基-丙酸，測定ee值為90％；萃取后的水層用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為2-3，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸.測定ee值為99％，轉(zhuǎn)化率為45％。R-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為R-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.5克，產(chǎn)率80％。
c、氨基?；?(porcine kidney acylase I)催化的拆分1克，約5mmolS-3-苯基-3-氯乙酰氨基-丙酸，溶于20mLNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為7.8-8.0。40℃反應(yīng)溫度下加入10mg氨基?；?(porcine kidney acylase I)，5分鐘后，底物完全反應(yīng)，拆分后的反應(yīng)液用1MNaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入適量的Boc20(碳酸二叔丁酯)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。1MHCl調(diào)節(jié)pH為1，MTBE(甲基叔丁基醚)萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干得S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸。S-3-苯基-3-N-Boc-丙酸加入適量6MHCl，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干水，溶于乙醇，加入適量環(huán)氧丙烷，30℃反應(yīng)1小時(shí)，得白色固體，為S-3-苯基-3氨基-丙酸，得0.45克，產(chǎn)率70％，ee值為99％。ee值用HPLC確定。
用氯乙?；?，不會(huì)影響反應(yīng)速度，而且因?yàn)闇p小了極性，使底物與產(chǎn)物更容易分離。
綜上所述，本發(fā)明通過將β-氨基酸N?；?，通過酶解，其中一種構(gòu)型的N?；?氨基酸的?；凰?，而它的對(duì)應(yīng)體不發(fā)生?；夥磻?yīng)，然后，根據(jù)上述物質(zhì)的脂水溶解性質(zhì)的差異，用萃取的方法進(jìn)行分離，進(jìn)而得到相應(yīng)的光學(xué)純的β-氨基酸；然后，選擇另外一種酶再將它的對(duì)應(yīng)體N?；?氨基酸的酰基水解，得到相應(yīng)的另外一種光學(xué)純的β-氨基酸。本發(fā)明方法穩(wěn)定，環(huán)保，安全，低成本、生產(chǎn)條件溫和，同時(shí)光學(xué)純度高達(dá)99.9％，此發(fā)明為工業(yè)化生產(chǎn)光學(xué)純的β-氨基酸提供了一種新的途徑。
權(quán)利要求
1.一種拆分β-氨基酸的方法，其特征在于該方法是將β-氨基酸N?；?，選擇性地將一種構(gòu)型的N酰化β-氨基酸的?；?，而它的對(duì)應(yīng)體不發(fā)生酰基水解反應(yīng)，萃取分離，得到相應(yīng)的光學(xué)純的β-氨基酸；然后，再將它的對(duì)應(yīng)體N?；?氨基酸的?；猓玫较鄳?yīng)的另外一種光學(xué)純的β-氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于它是通過β-氨基酸?；笇Ｒ恍运釸構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基，生成游離的R-β-氨基酸，而S構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基不被水解而拆分消旋β-氨基酸，分別得到R構(gòu)型和S構(gòu)型的β-氨基酸的方法；其中，所述β-氨基酸酰化酶是來源于Pseudomonas putida IFO 12996，與Brevibacillus agri NCHU1002菌株的β-氨基酸酰化酶同源性在90％的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于所述β-氨基酸?；覆捎肞EG的2吡啶基二硫衍生物修飾，使PEG通過二硫鍵直接連接到酶蛋白的巰基上得到；修飾后的酶催化水解S構(gòu)型N-苯乙?；?氨基酸，得到游離的S構(gòu)型β-氨基酸，而R構(gòu)型的N-苯乙?；?氨基酸分離后采用化學(xué)方法水解或者青霉素G?；D(zhuǎn)移酶水解得到游離的N構(gòu)型β-氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的拆分β-氨基酸的方法，它是通過源于豬腎的氨基?；窱專一性水解S構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基，生成游離的S-β-氨基酸，而R構(gòu)型N-?；?氨基酸的酰胺基不被水解而拆分消旋β-氨基酸，分別得到S構(gòu)型和R構(gòu)型的β-氨基酸的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于所述β-氨基酸具有以下結(jié)構(gòu) 其中，R1代表(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-環(huán)烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-雜芳基；R2代表H、(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-環(huán)烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-雜芳基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于所述β-氨基酸轉(zhuǎn)換成具有以下結(jié)構(gòu)的N-酰基β-氨基酸作為拆分的底物 其中，R3代表(C1-C4)-烷基、或這些烷基的1個(gè)氫原子被鹵素原子取代、或苯乙基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于包括以下步驟a、合成消旋體化合物N?；?氨基酸；b、pH為7.0-8.0條件下，30-50℃溫度，用β-氨基酸?；杆夥磻?yīng)10-1000分鐘后，調(diào)節(jié)pH為1-3，用疏水性溶劑萃取，水相為R-β-氨基酸；有機(jī)相為S構(gòu)型N-?；?氨基酸；c、S構(gòu)型N-酰基β-氨基酸于pH為7.8-8.0條件下，30-40℃反應(yīng)溫度下加入氨基酰化酶I，反應(yīng)10-1000分鐘，得到S-β-氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于包括以下步驟a、合成消旋體化合物N?；?氨基酸；b、pH為7.8-8.0條件下，30-40℃溫度，用氨基酰化酶I水解反應(yīng)10-1000分鐘后，調(diào)節(jié)pH為1-3用疏水性溶劑萃取，水相為S-β-氨基酸；有機(jī)相為R構(gòu)型N-酰基β-氨基酸；c、R構(gòu)型N-?；?氨基酸，于pH為7.0-8.0條件下，30-50℃反應(yīng)溫度下加入β-氨基酸酰化酶(β-Amino acylase)，反應(yīng)10-1000分鐘，得到R-β-氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的拆分β-氨基酸的方法，其特征在于包括以下步驟a、合成消旋體化合物N?；?氨基酸；b、β-Amino acylase的修飾；PEG與2吡啶基二硫聯(lián)結(jié)成衍生物，將酶蛋白置于緩沖液中，加入PEG的2吡啶基二硫衍生物，0-5℃緩慢攪拌10-20小時(shí)，再用石油醚萃取，除去石油醚，得到修飾酶；c、消旋體化合物N?；?氨基酸，于pH為7.0-8.0，在30-50℃反應(yīng)溫度下加入修飾后的β-Amino acylase，1-10小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH為1，疏水性溶劑萃取，水相為S-β-氨基酸；有機(jī)相為R-N?；?氨基酸，蒸干后得到R-N?；?氨基酸；d、R-N?；?氨基酸，溶于氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH為7.5-8.0，在20-30℃反應(yīng)溫度下加入青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，1-10小時(shí)后，結(jié)束反應(yīng)得到R-β-氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種拆分β－氨基酸的新方法，它是將氨基酸N?；螅ㄟ^選擇合適的酶，高選擇性地將其中一種構(gòu)型的N?；拢被岬孽；猓膶?duì)應(yīng)體不發(fā)生?；夥磻?yīng)，然后，根據(jù)上述物質(zhì)的脂水溶解性質(zhì)的差異，用萃取的方法進(jìn)行分離，進(jìn)而得到相應(yīng)的光學(xué)純的β－氨基酸；然后，選擇另外一種酶再將它的對(duì)應(yīng)體N?；拢被岬孽；?，得到相應(yīng)的另外一種光學(xué)純的β－氨基酸。本發(fā)明方法穩(wěn)定，環(huán)保，安全，低成本、生產(chǎn)條件溫和，同時(shí)光學(xué)純度高達(dá)99.9％，此方法為工業(yè)化生產(chǎn)光學(xué)純的β－氨基酸提供了一種新的途徑。
文檔編號(hào)C12P41/00GK1928102SQ20061002113
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日
發(fā)明者郭鵬 申請(qǐng)人:愛斯特(成都)醫(yī)藥技術(shù)有限公司