一種抗mpo-anca抗體免疫層析試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及一種層析試紙條，屬于醫(yī)學(xué)免疫分析檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD)是一種病因尚不十分清楚的 慢性非特異性腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC)和克羅恩病 (Crohn' s disease，CD) 〇
[0003] IBD是北美和歐洲的常見病，近30年來日本IBD發(fā)病率亦呈逐步增高趨勢，我國雖 尚無普通人群的流行病學(xué)資料，但近10多年來本病就診人數(shù)呈逐步增加趨勢則非常明顯。 IBD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，不僅有消化道癥狀，還可有腸外表現(xiàn)。由于癥狀為腹痛、腹瀉、便 血等非特異性腸炎表現(xiàn)，⑶與UC，以及IBD與結(jié)核性腸炎等其他腸道慢性疾病很難鑒別診 斷。
[0004] 近年來關(guān)于血清特異性抗體標(biāo)記物的研究較多，包括核周型抗中性粒細(xì)胞抗 體（Perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody，pANCA)、抗釀酒酵母抗體 (anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin A，anti-ASCA)、抗膜腺腺泡抗體 (PAB)、抗細(xì)胞外膜蛋白復(fù)合物抗體（anti-OmpC)、12抗體等。pANCA是以中性粒細(xì)胞和單 核細(xì)胞胞漿成分為抗原的自身抗體，與IBD相關(guān)的pANCA為非典型ANCA，在IBD中的陽性 率目前的報(bào)道各不相同，UC的pANCA陽性率在27~83 %之間，⑶則為0~24 %。造成 各個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果差異的原因可能與研究對(duì)象的種族，人群選擇及研究樣本量的不同有 關(guān)，更主要的是與檢測方法的不同有關(guān)。與UC相關(guān)的pANCA靶抗原主要是髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，ΜΡ0)和通透性殺菌蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI-ANCA)，文獻(xiàn)報(bào)道UC患者中抗MPO-ANCA的陽性率為10~25%，以IgG型為 主。文獻(xiàn)報(bào)道抗MPO-ANCA抗體的檢測方法有兩種，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)及間接免疫熒 光（Indirect immunofluorescence，IFA)檢測技術(shù)。ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定， 靈敏度也比較高，目前也被廣泛認(rèn)可，但其操作比較繁瑣，需要多次加樣洗滌及孵育步驟， 完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要3小時(shí)左右，需要酶標(biāo)儀，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)技術(shù)要求比較高，同時(shí) 受到各種環(huán)境條件的影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來諸多不便。
[0005] 間接免疫熒光檢測技術(shù)是把抗原細(xì)胞固定在載玻片上，熒光染色用熒光顯微鏡進(jìn) 行觀察，該技術(shù)具有高特異性，但由于顯微鏡觀察需要主觀判斷，對(duì)檢驗(yàn)人員的要求高，并 且依賴于熒光顯微鏡，使用不便。
[0006] 免疫層析法（immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其 原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的纖維 素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至 固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢 測帶。現(xiàn)有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等， 其中以納米金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0007] 以膠體金作為失蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱為免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，GICT)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血 酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定 的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢 固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì) 結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物 理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而 使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金層析法的優(yōu)點(diǎn) 主要包括：（1)使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用，所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成；（2) 成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備；（3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測條件；(4)可以進(jìn)行多項(xiàng) 檢測，若陽性樣本比較難獲得，多項(xiàng)檢測可以節(jié)省樣品，降低成本；（5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣 品在4°C貯存兩年年以上，無信號(hào)衰減現(xiàn)象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑， 省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟，對(duì)人體無毒害。
[0008] 表面帶活性基團(tuán)的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術(shù)一 樣，彩色膠乳標(biāo)記免疫層析技術(shù)也具有操作簡便、試劑穩(wěn)定、快速出結(jié)果、可室溫保存等優(yōu) 點(diǎn)。彩色膠乳標(biāo)記是將不同直徑范圍0.1 um-Ium彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基等酯 類或其他大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使這些大分子標(biāo)記上顏色，當(dāng)在檢測線或質(zhì)控線上富集停 留后形成肉眼可見的彩色條帶。
[0009] 在自體免疫性疾病診斷方面，已出現(xiàn)較多的免疫層析試紙，但基于抗MPO-ANCA抗 體檢測的免疫層析試紙?jiān)趪鴥?nèi)外市場上仍沒有問世。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0010] 本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用 到抗MPO-ANCA抗體的檢測中，采用間接免疫法來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中的MPO-ANCA抗體進(jìn)行檢測， 通過把MPO-ANCA抗原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜檢測帶上，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中MPO-ANCA抗體 的高特異、高準(zhǔn)確性的檢測，快速篩查抗MPO-ANCA抗體陽性標(biāo)本，為臨床炎癥性腸病等自 體免疫性疾病提供快速的輔助診斷。
[0011] 本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題在于提供一種免疫層析法抗MPO-ANCA抗體測試 紙條。
[0012] 本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0013] -種抗MPO-ANCA抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、分析膜（3)、 吸水墊（6)、底板（7)、檢測帶T線（4)和質(zhì)控帶C線（5)，所述底板的上部貼合有分析膜，所 述分析膜上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，所述結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊， 所述檢測帶T線和質(zhì)控帶C線設(shè)置在分析膜上。
[0014] 所述的結(jié)合墊（2)包被膠體金或彩色膠乳標(biāo)記物，結(jié)合墊設(shè)1層或2層，設(shè)2層時(shí)， 如圖2所示錯(cuò)落與分析膜搭接。
[0015] 優(yōu)選例1中，所述的結(jié)合墊⑵包被有標(biāo)記的MPO-ANCA抗原蛋白，所述的檢測帶 T線（4)包被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有MPO-ANCA的單克隆或多克隆抗體 的一種或多種。
[0016] 所述的MPO-ANCA單克隆或多克隆抗體是指用MPO-ANCA抗原蛋白作為免疫原所獲 得的鼠源、兔源、馬源、豚鼠源、駱駝源的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0017] 優(yōu)選例2中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記的MPO-ANCA抗原蛋白和標(biāo)記物b層； 所述的檢測帶T線（4)包被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有蛋白C。
[0018] 優(yōu)選例3中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記物a層和標(biāo)記物b層；所述的檢測帶T 線（4)包被有MPO-ANCA抗原，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有蛋白C。
[0019] 所述標(biāo)記物a層的標(biāo)記蛋白為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球 菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)中的一種或多種。
[0020] 所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源、駱駝源或豚鼠源中的一種； 所述的抗