一種采用抗體親和層析技術(shù)高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種采用抗體親和層析技術(shù)高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法，屬生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。方法為分離豬新鮮白細(xì)胞，加入新城雞瘟病毒誘導(dǎo)劑，用發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)粗制豬白細(xì)胞干擾素；鹽析純化制備豬白細(xì)胞干擾素抗原；免疫羊獲得羊抗豬白細(xì)胞干擾素抗血清，并從中提取免疫球蛋白IgG；將IgG與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，制成羊抗豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱；通過(guò)抗體親和層析柱將粗制豬白細(xì)胞干擾素純化成精制豬白細(xì)胞干擾素原液；將原液真空冷凍干燥制劑，即制成精制豬白細(xì)胞干擾素粉針。精制豬白細(xì)胞干擾素純度高、生物活性好、副作用小，臨床用于豬瘟、藍(lán)耳病、腹瀉等多種病毒性傳染病的防治，療效明顯優(yōu)于粗制豬白細(xì)胞干擾素。
【專利說(shuō)明】一種采用抗體親和層析技術(shù)高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種精制豬白細(xì)胞干擾素的生產(chǎn)方法，屬于采用發(fā)酵罐培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)酵技術(shù)、免疫生物生化技術(shù)、抗體親和層析純化提取技術(shù)生產(chǎn)制備精制豬白細(xì)胞干擾素的生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豬白細(xì)胞干擾素是一種純天然的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力功能的細(xì)胞因子，同時(shí)具有使用安全、治療效果好、成本低等特點(diǎn)，臨床用于豬病毒性高熱病、瘟病、藍(lán)耳病、腹瀉等傳染性疾病治療，收到了滿意效果。
[0003]目前市場(chǎng)銷售和使用的豬白細(xì)胞干擾素多為采用搖瓶培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的粗制豬白細(xì)胞干擾素，產(chǎn)品未經(jīng)純化提取處理，含有大量細(xì)胞蛋白、碎片、培養(yǎng)基及其它未知病原微生物等有害成分，且生物效價(jià)低(每ml僅含干擾素I萬(wàn)活性單位左右)，臨床治療效果差，因此有必要將其進(jìn)一步提取純化，以提高質(zhì)量，降低毒副作用和滿足日趨嚴(yán)重的家畜病毒性傳染病的控制和臨床治療的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本 發(fā)明的目的在于采用發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)對(duì)分離的豬白細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)制備粗制豬白細(xì)胞干擾素；利用免疫生物生化技術(shù)制備豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱；通過(guò)抗體親和層析柱分離純化生產(chǎn)制備精制豬白細(xì)胞干擾素原液；原液加入適當(dāng)保護(hù)劑、穩(wěn)定劑和賦形劑制劑即可生產(chǎn)制備出活性高(每ml可含干擾素?cái)?shù)百萬(wàn)活性單位)、治療效果好、成本低的精制豬白細(xì)胞干擾素針劑。本發(fā)明克服了粗制豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)技術(shù)落后、生物活性低、治療效果差、副作用大等缺陷，具有科技含量高，操作簡(jiǎn)捷，回收率高，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，便于規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]上述目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:無(wú)菌采集和分離健康豬新鮮白細(xì)胞；采用發(fā)酵罐技術(shù)對(duì)豬白細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)豬粗制白細(xì)胞干擾素；采用鹽析法將粗制豬白細(xì)胞干擾素分離純化制備抗原；用抗原免疫羊獲得羊抗豬白細(xì)胞干擾素抗血清；從抗血清中提取制備羊抗豬白細(xì)胞干擾素免疫球蛋白IgG，；再將IgG與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，制備成豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱；繼而采用抗體親和層析柱一步即可將粗制豬白細(xì)胞干擾素層析分離純化，制備出高純度的精制豬白細(xì)胞干擾素原液；將原液制劑即可制成精制豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針。該方法生產(chǎn)的精制豬白細(xì)胞干擾素純度好、比活性高、副作用低，且抗體親和層析柱可反復(fù)再生使用，生產(chǎn)程序簡(jiǎn)捷，回收率高,生產(chǎn)成本明顯降低，更加適合家畜市場(chǎng)和臨床病毒性傳染病防治的需要。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]采用抗體親和層析技術(shù)高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法步驟如附圖所示。【具體實(shí)施方式】
[0007]精制豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)制備【具體實(shí)施方式】如下:
[0008]1、采集分離豬白細(xì)胞
[0009](I)無(wú)菌收集健康豬新鮮抗凝全血；
[0010](2)將豬血于4°C，2500rpm離心10分鐘，收集白細(xì)胞灰黃層；
[0011](3)灰黃層加入硫酸銨，裂解殘留的紅細(xì)胞，2500rpm離心10分鐘，去除裂解液；
[0012](4)沉淀物用含慶大霉素40單位/ml、卡那霉素150 μ g/ml的無(wú)菌生理鹽水洗二遍，于4°C 2500rpm，離心10分鐘，棄上清，沉淀即為豬白細(xì)胞；
[0013]2、粗制豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)制備
[0014](I)將白細(xì)胞沉淀物用無(wú)菌培養(yǎng)液懸浮，加入到事先滅菌處理的含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，使白細(xì)胞終濃度為107/ml，同時(shí)加NDV誘導(dǎo)劑，終濃度為100血凝單位/ml左右；
[0015](2)啟動(dòng)發(fā)酵罐，誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，溫度371:4冊(cè).5-7.0，轉(zhuǎn)速350印111，通氣量3-517分，溶氧度40-50%，誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵18-20小時(shí)；
[0016](3)于 4°C 4000rpm,離心30分鐘，收集上清液；
[0017](4)將上清液用鹽酸調(diào)pH至2.0，4°C放置72小時(shí)，滅活NDV病毒；
[0018](5)將上清液用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，于4°C 4000rpm,離心30分鐘，收集上清液即粗制豬白細(xì)胞干擾素。
[0019]3、制備豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱
[0020](I)用鹽析法從粗制豬白細(xì)胞干擾素中提取精制豬白細(xì)胞干擾素；
[0021](2)用精制豬白細(xì)胞干擾素作抗原免疫羊，制備羊抗豬白細(xì)胞干擾素抗血清；
[0022](3)從抗血清中提取羊抗豬白細(xì)胞干擾素IgG ；
[0023](4)與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析凝膠。
[0024](5)將豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析凝膠裝入層析柱，制備抗體親和層析柱。
[0025]4、精制豬白細(xì)胞干擾素層析分離純化
[0026](I)將抗體親和層析柱用0.02M/L, pH7.0PB緩沖液平衡；
[0027](2)將按項(xiàng)2方法生產(chǎn)制備的粗制豬白細(xì)胞干擾素，上親和層析柱，流速15_20ml/分；
[0028](3)0.02M/L PB, ρΗ7.0緩沖液平衡，流速15_20ml/分；去除未結(jié)合的雜蛋白；
[0029](4)用pH2鹽酸甘氨酸緩沖液解脫干擾素，流速10_15ml/分，收集洗脫蛋白峰；
[0030](5)將收集的蛋白峰溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH7.0，0.22 μ m濾膜除菌，即精制豬白細(xì)胞干擾素；
[0031](6)無(wú)菌分裝并留樣，-20°C以下保存?zhèn)溆茫?br> [0032](6)對(duì)留樣進(jìn)行鑒定。
[0033]5、精制豬白細(xì)擾胞干擾素制劑
[0034](I)配制稀釋液，加入保護(hù)劑、穩(wěn)定劑和賦形劑；
[0035](2)按不同規(guī)格要求加入精制豬白細(xì)擾胞干素原液，用磷酸調(diào)整pH至6.5-7.0 ；
[0036](3) 0.22 μ m濾膜除菌過(guò)濾；[0037](4)按標(biāo)示量無(wú)菌灌裝；[0038](5)真空冷凍干燥后封口即制成精制豬白細(xì)胞干擾素凍干粉針。
【權(quán)利要求】
1.采用發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)對(duì)分離的豬白細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)發(fā)酵，其特征在于:利用該方法生產(chǎn)的粗制豬白細(xì)胞干擾素產(chǎn)量高，生物活性好，培養(yǎng)物不易被外源病原微生物及其它有害物質(zhì)污染，且生產(chǎn)可控性強(qiáng)，自動(dòng)化程度高、生產(chǎn)規(guī)?？筛鶕?jù)需要擴(kuò)大。
2.用純化后的豬白細(xì)胞干擾素作抗原免疫羊，制備羊抗豬白細(xì)胞干擾素抗體IgG，再與瓊脂糖凝膠偶合制備成豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱。其特征在于:該抗體親和層析柱具有與豬白細(xì)胞干擾素高特異性和高親和性結(jié)合的能力，可直接用于粗制豬白細(xì)胞干擾素的純化提取，且層析柱可反復(fù)再生使用。
3.用豬白細(xì)胞干擾素特異性抗體親和層析柱對(duì)粗制豬白細(xì)胞干擾素進(jìn)行層析分離純化，制備成精制豬白細(xì)胞干擾素。其特征在于:一步層析即可得到高純度和高比活性的精制豬白細(xì)胞干擾素，其治療效果明顯優(yōu)于粗制品。該純化技術(shù)先進(jìn)，步驟簡(jiǎn)捷，回收率高，成本低，便于規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C07K14/555GK103923961SQ201310008039
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】李廣善, 傅李芳 申請(qǐng)人:北京紫辰醫(yī)藥生物技術(shù)研究所