一種采用豬脾臟高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種采用豬脾臟高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法，屬生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。方法為采集豬新鮮脾臟，-10℃以下凍存；用時(shí)融化、粉碎、洗滌、消化、分離白細(xì)胞；加入新城雞瘟病毒，發(fā)酵罐誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)分離、病毒滅活，制成粗制豬白細(xì)胞干擾素；離子交換和高壓反向?qū)游黾兓?，制成精制豬白細(xì)胞干擾素原液；真空冷凍干燥制劑，即制成精制豬白細(xì)胞干擾素粉針。精制豬白細(xì)胞干擾素屬純天然生物制品，具有抗病毒及增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用，可用于豬瘟、藍(lán)耳病、腹瀉等多種病毒性傳染病的防治。本發(fā)明利用豬脾臟取代豬血作原料進(jìn)行精制豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)，工藝簡(jiǎn)便，產(chǎn)品質(zhì)量好，成本低，為豬白細(xì)胞干擾素的生產(chǎn)開(kāi)辟了一條新的途徑。
【專利說(shuō)明】一種采用豬脾臟高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用豬脾臟作原料高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法，屬于采用細(xì)胞分離技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、誘導(dǎo)發(fā)酵技術(shù)及制劑技術(shù)對(duì)豬脾臟進(jìn)行深加工的生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豬白細(xì)胞干擾素是一種純天然的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫力功能的細(xì)胞因子，同時(shí)具有使用安全、治療效果好、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，臨床用于豬病毒性高熱病、瘟病、藍(lán)耳病、腹瀉等多種傳染性疾病的防治，收到了滿意效果。
[0003]目前市場(chǎng)銷售和使用的豬白細(xì)胞干擾素多采用豬血白細(xì)胞作原料生產(chǎn)制備的粗制品。由于豬血收集困難，不易大量?jī)?chǔ)存，且產(chǎn)品未經(jīng)任何純化提取，含有大量細(xì)胞組織、培養(yǎng)基及其它未知病原微生物等有害成分，導(dǎo)致其生物活性低(每ml僅含干擾素1-2萬(wàn)活性單位)，臨床治療效果差。因此有必要在擴(kuò)大豬白細(xì)胞來(lái)源的同時(shí)，進(jìn)一步將粗制豬白細(xì)胞干擾素提取純化，以改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，提高治療效果，滿足日趨嚴(yán)重的家畜病毒性傳染病防治的需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于采用豬脾臟代替豬血作原料分離白細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)酵、層析分離純化，高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素，從而拓寬了豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)原料的來(lái)源。該方法生產(chǎn)的精制豬白細(xì)胞干擾素生物活性高(每ml可含干擾素?cái)?shù)百萬(wàn)活性單位)，副作用小、治療效果好，且生產(chǎn)原料來(lái)源廣、取材方便、易于儲(chǔ)存、工藝簡(jiǎn)捷、回收率高、成本低，便于規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]上述目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:采集健康豬新鮮脾臟，-1O0C以下冰凍保存；使用時(shí)室溫?zé)o菌水浴融化，剝離脾臟表面的脂肪和結(jié)締組織；粉碎后加入含卡那霉素和慶大霉素的磷酸鹽緩沖液洗滌，4°C 2000rpm離心15分鐘離心；加入0.25 %胰蛋白酶，37°C保溫消化30分鐘；用不含抗生素的緩沖液洗滌2次，不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，4°C 2000rpm離心15分鐘，收集白細(xì)胞沉淀物；用MEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀物，制備成107/ml濃度的白細(xì)胞懸液，注入到發(fā)酵罐中，同時(shí)加入新城雞瘟病毒(NDV)誘導(dǎo)劑，濃度為100血凝單位/ml ;37°C，pH6.0-7.0，300rpm，通氣量3-5L/分，容氧度40-50%，誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵18-20小時(shí)；4°C，4000rpm離心30分鐘收集上清；用鹽酸調(diào)pH至2.0,4.(TC放置3天,滅活病毒,再用氫氧化鈉調(diào)pH至6.8,4°C，4000rpm離心30分鐘收集上清，即粗制豬白細(xì)胞干擾素原液；先經(jīng)陰離子層析，再經(jīng)高壓反向?qū)游黾兓?，收集洗脫鋒即精制豬白細(xì)胞干擾素原液；0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌制劑，無(wú)菌分裝真空冷凍干燥即制備成精制豬白細(xì)胞干擾素粉針。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]采用豬脾臟高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素的方法步驟如附圖所示?！揪唧w實(shí)施方式】
[0007]采用豬脾臟高效生產(chǎn)精制豬白細(xì)胞干擾素【具體實(shí)施方式】如下:
[0008]1、從豬脾臟分離白細(xì)胞
[0009](I)無(wú)菌采集健康豬新鮮脾臟，-1O0C以下冰凍保存?zhèn)溆茫?br> [0010](2)使用時(shí)室溫?zé)o菌水浴融化，剝離脾臟表面的脂肪和結(jié)締組織，用組織粉碎機(jī)粉碎成1-2mm3碎塊；
[0011](3)加入含慶大霉素40單位/ml、卡那霉素150 μ g/ml的ρΗ6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌，4V 2000rpm離心15分鐘，收集細(xì)胞組織沉淀物；
[0012](4)加入0.25%胰蛋白酶，37°C保溫消化30分鐘；
[0013](5)用不含抗生素的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，4°C 2000rpm離心15分鐘，收集白細(xì)胞沉淀物。
[0014]2、誘導(dǎo)發(fā)酵制備粗制豬白細(xì)胞干擾素原液
[0015](I)用MEM培養(yǎng)液稀釋白細(xì)胞沉淀物，制備成白細(xì)胞懸液，注入到發(fā)酵罐中，同時(shí)加入新城雞瘟病毒(NDV)誘導(dǎo)劑，濃度為100血凝單位/ml ；
[0016](2)啟動(dòng)發(fā)酵 罐，370C，ρΗ6.5-7.0, 300rpm,通氣量 3-5L/ 分，容氧度 40-50%，誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵18-20小時(shí)；
[0017](3)4°C，4000rpm離心30分鐘，收集上清；
[0018](4)加入鹽酸調(diào)pH至2.0，4.(TC放置72小時(shí)，滅活病毒；
[0019](5)用氫氧化鈉調(diào)pH至6.8，4°C，4000rpm離心30分鐘，收集上清，即粗制豬白細(xì)胞干擾素原液。
[0020]3、層析純化制備精制豬白細(xì)胞干擾素原液
[0021](I)將粗制豬白細(xì)胞干擾素原液上DEAE Sepharose FF柱，15_20ml/分，用Nacl緩沖液作0.1-0.6M/L線性梯度洗脫，流速I(mǎi)Oml/分，收集洗脫峰；
[0022](2)將收集的洗脫峰調(diào)pH4.0，上C4高壓反向?qū)游鲋?5_20ml/分，用鹽酸緩沖液作pH4-7線性梯度洗脫，流速I(mǎi)Oml/分，收集洗脫鋒即精制豬白細(xì)胞干擾素原液；
[0023](3)用氫氧化鈉調(diào)pH7.0,0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后置_20°C以下冰箱凍存?zhèn)溆?，同時(shí)留樣做質(zhì)量檢定。
[0024]3、精制豬白細(xì)胞干擾素制劑
[0025](I)用PH6.8,0.02M/L磷酸鹽緩沖液作稀釋液，按配方加入保護(hù)劑、穩(wěn)定劑和賦形劑，即豬白細(xì)胞干擾素半成品；
[0026](2)用磷酸或氫氧化鈉調(diào)pH至6.5-7.5,0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌；
[0027](3)無(wú)菌分裝，真空低溫冷凍干燥后封口，即精制豬白細(xì)胞干擾素粉針。
【權(quán)利要求】
1.用豬脾臟取代豬血作原料分離白細(xì)胞，誘導(dǎo)生產(chǎn)豬白細(xì)胞干擾素，其特征在于:擴(kuò)大了豬白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)原料來(lái)源，且豬脾臟采集方便，易于儲(chǔ)存，便于生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大。
2.將豬脾臟無(wú)菌粉碎成l_2mm3碎塊，加入0.25%胰蛋白酶，37°C保溫消化30分鐘，緩沖液洗滌2次，不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，4°C 2000rpm離心15分鐘，收集沉淀物即豬白細(xì)胞，其特征在于:經(jīng)酶消化分離得到的豬白細(xì)胞，分散性好，活力高，更加適合發(fā)酵培養(yǎng)和干擾素的誘導(dǎo)生產(chǎn)。
3.采用發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)對(duì)從豬脾臟分離的白細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)發(fā)酵，其特征在于:豬白細(xì)胞干擾素產(chǎn)量高，生物活性好，生產(chǎn)可控性強(qiáng)，培養(yǎng)物不易被外源病原微生物及其它有害物質(zhì)污染。
4.采用離子交換及高壓反向?qū)游龇椒▽⒋种曝i白細(xì)胞干擾素純化成精制豬白細(xì)胞干擾素，其特征在于:純化方法簡(jiǎn)便、成本低，且精制豬白細(xì)胞干擾素純度好、活性高、副作用小，臨床用于豬瘟、藍(lán)耳病、腹瀉等多種病毒性傳染病的防治，效果優(yōu)于粗制豬白細(xì)胞干擾素。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103923960SQ201310008071
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】李廣善, 傅李芳 申請(qǐng)人:北京紫辰醫(yī)藥生物技術(shù)研究所