勻后離心，棄除上層的生理鹽水；再向剩余的紅細(xì)胞中加入等體積的生 理鹽水，混勻后即得到分離好的紅細(xì)胞樣品。
[0026] 取50μL紅細(xì)胞樣品，置于螺旋蓋玻璃離心管中，加入十七燒酸作為內(nèi)標(biāo)溶液，加 入lmL3mol/L的鹽酸-甲醇溶液，混勻后置烘箱中，90°C避光反應(yīng)3h，衍生化反應(yīng)完畢后， 冷卻至室溫，加入2mL正己烷萃取甲酯化反應(yīng)產(chǎn)物，取上清液并進(jìn)行氮?dú)獯蹈?，然后向殘?jiān)?中加入正己烷作為復(fù)溶劑，混勻，得到樣品檢測(cè)液。其中，十七烷酸與紅細(xì)胞樣品的體積比 為1 :1 ;紅細(xì)胞樣品、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復(fù)溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。
[0027] 通過(guò)上述前處理，將紅細(xì)胞中的脂肪酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性較強(qiáng)、適用于氣相色譜-質(zhì) 譜儀檢測(cè)的脂肪酸甲酯產(chǎn)物，并萃取分離出來(lái)，有效避免了其他物質(zhì)對(duì)后續(xù)檢測(cè)的干擾。
[0028] 實(shí)施例二全血紅細(xì)胞脂肪酸的檢測(cè) 將樣品檢測(cè)液使用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0029] 色譜條件包括：色譜柱為規(guī)格為20m*0. 18mm(ID)*0· 20μm(film)的極性毛細(xì)管 色譜柱(購(gòu)自安捷倫，型號(hào)DB-23,PartNumber122-2361 )，載氣為99. 999%純度的氦氣，載 氣流速為〇. 90mL/min，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為?μL，進(jìn)樣口溫度為230°C，后運(yùn) 行溫度為240°C，后運(yùn)行時(shí)間為2min，吹掃流量為4.OmL/min，總流量為55mL/min。程序升 溫條件如表1所示。
[0030]
質(zhì)譜檢測(cè)采用電子轟擊電離模式，采用全掃描和選擇離子掃描方式。質(zhì)譜條件包括：電 離源為電子轟擊離子源（EI)，70ev;傳輸線溫度為230°C，離子源溫度為250°C，四極桿質(zhì)量 分析器溫度為150°C，溶劑延遲時(shí)間為3. 70min;掃描模式為全掃描（Scan)和選擇離子掃描 (SHO,全掃描范圍為m/z60. 00~450. 00,選擇離子掃描（SHO模式參數(shù)如表2所示。
[0031]
全血紅細(xì)胞中脂肪酸的定性、定量檢測(cè)：以樣品中各脂肪酸與標(biāo)準(zhǔn)品的甲酯產(chǎn)物保留 時(shí)間、全掃描所得的質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST譜庫(kù)檢索以及與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)作為定 性依據(jù)，各脂肪酸甲酯的保留時(shí)間如表3所示。樣品色譜圖中所選擇的定性定量離子的相 對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比的偏差不超過(guò)預(yù)設(shè)規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存 在對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，二十烷三烯酸甲酯的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物甲 酯峰面積的比值為縱坐標(biāo)，二十烷三烯酸的濃度與內(nèi)標(biāo)物的濃度比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線，結(jié)果如圖1所示，計(jì)算人紅細(xì)胞二十烷三烯酸的含量。
[0032]
采用上述方法，對(duì)1例全血紅細(xì)胞樣品中的脂肪酸進(jìn)行了檢測(cè)，得出了 20種脂肪酸各 自的含量，脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，各脂肪酸甲酯峰型 對(duì)稱，沒有拖尾現(xiàn)象，分離效果很好。全血紅細(xì)胞樣品中，二十烷三烯酸甲酯的選擇離子色 譜圖如圖3所示，十七烷酸甲酯的選擇離子色譜圖如圖4所示。
[0033]本發(fā)明的檢測(cè)方法最低檢出限達(dá)到了 0. 01mg/L，得出人紅細(xì)胞樣品中20種脂肪 酸在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，線性良好，決定系數(shù)R2在〇. 996-0. 999之間。
[0034]重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一來(lái)源的全血樣品5份，進(jìn)行相同的前處理和檢測(cè)，結(jié)果20種脂 肪酸含量的RSD都在3°Ρ8%之間，表明該方法的重復(fù)性好。
[0035]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：包括如下步驟： A) 全血樣品的前處理：從全血樣品中分離紅細(xì)胞，加入內(nèi)標(biāo)溶液和鹽酸-甲醇溶液進(jìn) 行衍生化反應(yīng)，然后加入萃取劑萃取，取上清液并氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)屑尤霃?fù)溶劑，混勻，得到 樣品檢測(cè)液； B) 對(duì)所述樣品檢測(cè)液采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜條件包括：色譜柱采 用極性色譜柱，載氣為氦氣，不分流進(jìn)樣，線速度流量控制方式，載氣流量為0. 80~1. OOmL/ min，起始柱溫60°C，先升溫至180°C，然后升溫至220°C，整個(gè)升溫程序的梯度時(shí)間為 8~15min ;質(zhì)譜條件為：采用電子轟擊離子源，采用全掃描和選擇離子掃描方式。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述內(nèi)標(biāo)溶液選自十七烷酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述萃取劑選自正己烷，所述復(fù)溶劑選自正己烷。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述內(nèi)標(biāo)溶液與紅細(xì)胞的體積比為1 :(1~2);所述紅細(xì)胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復(fù)溶劑 的體積比為 1 : (1〇~25) : (20~50) : (4~10)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述紅細(xì)胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復(fù)溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述極性色譜柱選自規(guī)格為20m*0. 20 ym的極性毛細(xì)管色譜柱。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述氣相色譜條件還包括：進(jìn)樣體積為1ML，進(jìn)樣口溫度為220~230°C，后運(yùn)行溫 度為240~250°C，后運(yùn)行時(shí)間為2min，吹掃流量為3. 0~5. OmL/min，總流量為50. 0~60. 0 mL/ min，平均線速度為35. 0~45. Ocm/s。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述質(zhì)譜條件還包括：接口溫度為210~230°C ;離子源溫度為220~240°C ;四極桿 溫度為140~160°C，溶劑延遲時(shí)間為3. 0~4. Omin，全掃描范圍為m/z 60. 00~450. 00。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：還包括如下步驟：檢測(cè)結(jié)果的定性判斷和/或定量計(jì)算。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)全血紅細(xì)胞二十烷三烯酸的方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟：A）全血樣品的前處理；B）對(duì)所述樣品檢測(cè)液采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具有樣品用量少，前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，定性、定量功能強(qiáng)大，并且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間短、檢測(cè)通量高等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號(hào)】CN105241970
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510545380
【發(fā)明人】劉菲菲, 燕啟江, 梁耀銘, 程雅婷, 趙蓓蓓, 郭周萍, 趙強(qiáng)
【申請(qǐng)人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年8月31日