石墨烯/類過(guò)氧化物酶雙信號(hào)放大檢測(cè)白血病的生物傳感方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感器的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種石墨烯/類過(guò)氧化物酶雙 信號(hào)放大檢測(cè)白血病的生物傳感方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是一類常見和多發(fā)的造血干細(xì)胞克隆性惡性疾病，是我國(guó)十大高發(fā)惡性腫 瘤之一，居35歲以下人群惡性腫瘤死亡率的首位，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。其診斷分 型最初是1976年由法（F)、美（A)、英⑶協(xié)作組提出的FAB分類，它是診斷白血病的傳統(tǒng) 方法。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)和免疫分型在白血病診斷中的應(yīng)用，又提出了白血病的細(xì)胞形態(tài)學(xué) (Morphoiogic)、免疫學(xué)（Immunologic)、細(xì)胞遺傳學(xué)（Cytogentic)MIC 分型。20 世紀(jì) 80 年 代以來(lái)，由于MIC亞型特征性染色體異常受累基因的克隆及對(duì)這些基因功能的不斷剖析， 又逐漸形成了基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)（Molecular)的MIC-M分 型。近年來(lái)，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，染色體分析、Southern-Blot、 RT-PCR及FISH等技術(shù)被用于白血病的臨床診斷。然而這些方法仍存在較多缺點(diǎn)，如檢測(cè) 方法復(fù)雜、放射性污染、靈敏度低、測(cè)試費(fèi)用昂貴等，因此，在臨床診斷中，形態(tài)學(xué)檢測(cè)及抗 原-抗體特異性識(shí)別的免疫學(xué)表型檢測(cè)仍是白血病診斷的基礎(chǔ)。但單純依靠形態(tài)學(xué)檢查很 難進(jìn)行準(zhǔn)確的分型診斷，而免疫學(xué)表型檢測(cè)需要相應(yīng)的抗體，并且操作繁瑣，價(jià)格昂貴，因 此，發(fā)展新的快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的白血病檢測(cè)新方法具有非常重要的臨床意義。
[0003] 近年來(lái)，納米技術(shù)迅速發(fā)展并滲透于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為腫瘤的早期診斷帶來(lái)曙光。美國(guó) 國(guó)立衛(wèi)生研宄院于2005年啟動(dòng)了"癌癥納米技術(shù)計(jì)劃"，旨在將納米技術(shù)、癌癥研宄與分子 生物醫(yī)學(xué)相互結(jié)合，實(shí)現(xiàn)減輕癌癥病人痛苦和降低死亡率的目標(biāo)。石墨烯（graphene)是一 種通過(guò)sp2雜化組成的碳二維納米結(jié)構(gòu)，是所有其他維度（如零維富勒烯、一維碳納米管、 三維石墨等）碳質(zhì)材料的基本構(gòu)造單元。它具有獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)和熱、機(jī)械及電學(xué)屬性，如 比表面積大、表面反應(yīng)活性高、催化效率高、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于敏感分子的固 定、信號(hào)的傳感和放大。血紅素是一種鐵卟啉配合物，為人體內(nèi)血紅蛋白的核心，由于其價(jià) 格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定以及可以催化氧氣、過(guò)氧化氫等的還原而被廣泛應(yīng)用，但其催化活性和電 化學(xué)穩(wěn)定性并不令人滿意。通過(guò)Hemin與石墨稀之間JT-JT相互作用制備的Hemin功能化 石墨烯納米雜化材料（HGNs)在水溶液中具有很好的穩(wěn)定性，石墨烯表面附著的血紅素使 得HGNs具有過(guò)氧化氫酶的性質(zhì)，而石墨稀能提高Hemin的催化活性及穩(wěn)定性。因此，HGNs 可作為一種具有過(guò)氧化物酶催化活性的納米材料應(yīng)用于生物傳感器的制備中，而將HGNs 應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于白血病細(xì)胞檢測(cè)的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于白血病細(xì)胞檢測(cè)的試劑盒，含有如下（a)和（b):
[0006] (a)磁珠捕獲探針；
[0007] 所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定于所述磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針為 序列表中序列1所示的單鏈DNA分子；
[0008] (b)適配體功能化Hemin-石墨稀復(fù)合納米材料；
[0009] 所述適配體功能化Hemin-石墨稀復(fù)合納米材料由經(jīng)氯化高鐵血紅素（Hemin)修 飾的石墨烯和固定于所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯上的適配體探針組成；所述適配 體探針為序列表中序列2所示的單鏈DNA分子。
[0010] 在所述試劑盒中，所述適配體功能化Hemin-石墨稀復(fù)合納米材料具體可按照包 括如下步驟的方法制備得到：按照所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯與所述適配體探針 的配比為0. 5mg :4-40nmol (如Img :8nmol)的比例，將所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨 烯的懸濁液與所述適配體探針的溶液混合，20-25°C (如25°C )避光孵育16-24h (如24h)， 得到所述適配體功能化Hemin-石墨稀復(fù)合納米材料。
[0011] 其中，所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯的懸濁液中，所述經(jīng)氯化高鐵血紅 素修飾的石墨烯的含量為lmg/ml。所述適配體探針的溶液中，所述適配體探針的濃度為 8 μΜ〇
[0012] 在進(jìn)行所述20-25°C避光孵育16-24h(如24h)的期間，還包括向孵育體系中加入 NaCl，至所述NaCl的終濃度為IOmM的步驟。
[0013] 其中，所述向孵育體系中加入NaCl為向所述孵育體系中逐次加入NaCl ;具體為： 每次0. 5 μ L NaCl溶液（濃度為1M)，每5個(gè)小時(shí)加一次。
[0014] 在所述試劑盒中，所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯是將氧化石墨烯和氯化高 鐵血紅素按照質(zhì)量比為1 :(1?10)(如1:1)的比例制備得到的。
[0015] 所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯具體是按照包括如下步驟的方法制備得到 的：將氧化石墨烯和氯化高鐵血紅素按照質(zhì)量比為1 :(1?10)(如1:1)的比例混合后，加 入氨水和水合肼，60°c孵育2-6h (如4h)，得到所述經(jīng)氯化高鐵血紅素修飾的石墨烯。
[0016] 其中，所述加入氨水和水合肼具體為：加入的所述氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25-28% )與 氯化高鐵血紅素的比例為10 yL :lmg，加入的所述水合肼（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80% )與氧化石墨 稀的比例3 μ L :lmg。
[0017] 在所述試劑盒中，所述磁珠捕獲探針按照包括如下步驟的方法制備得到：將經(jīng)生 物素標(biāo)記的所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠共同孵育，獲得所述磁珠捕獲探 針。
[0018] 在本發(fā)明中，所述生物素具體標(biāo)記于所述捕獲探針的3'端。
[0019] 進(jìn)行所述孵育時(shí)，經(jīng)生物素標(biāo)記的所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠 的配比具體為IOOpmol : Img ;
[0020] 進(jìn)一步，所述孵育具體為20-30°C (如25°C )80-150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育 10-30min (如15min)。所述孵育的液體環(huán)境為結(jié)合緩沖液；所述結(jié)合緩沖液的溶劑為水，溶 質(zhì)及濃度如下：Tris 0· 605g/L，EDTA 0· 185g/L，NaCl 58. 45g/L，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7. 5。
[0021] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述磁珠捕獲探針的制備方法包括如下 步驟：分別取濃度為500nM(以DNA計(jì)量）的經(jīng)生物素標(biāo)記的所述捕獲探針的溶液（溶劑 為所述結(jié)合緩沖液）和濃度為l〇mg/ml (以磁珠計(jì)量）的經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠 溶液（溶劑為所述結(jié)合緩沖液），按照體積比2:1的配比混合，20-301(如25°〇80? 150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育10-30min (如15min)，即獲得所述磁珠捕獲探針。
[0022] 在所述試劑盒中，還可含有記載有如下（A)和/或（B)的可讀載體（如說(shuō)明書）：
[0023] ㈧檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞是否為白血病細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0024] (al)將所述適配體功能化Hemin-石墨稀復(fù)合納米材料、待測(cè)細(xì)胞和所述磁珠捕 獲探針按照25 μ g :105個(gè)：25 μ g的配比混合，37°C避光孵育30min ;所述磁珠捕獲探針的量 以磁珠量計(jì)；
[0025] 根據(jù)需要，在所述孵育之后還可包括采用清洗緩沖液對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行清洗的步驟； 所述清洗緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl2O. 14g/L， Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 · 6H20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
[0026] (a2)對(duì)步驟（al)孵育后的體系進(jìn)行磁富集，去除上清，向富集產(chǎn)物中加入TMB顯 色液和過(guò)氧化氫，37°C避光孵育30min ;
[0027] (a3)按照如下方法確定待測(cè)細(xì)胞是否為白血病細(xì)胞：若步驟（a2)孵育后的體系 較孵育前相比發(fā)生了顯色反應(yīng)（