本發(fā)明屬于植物活性組分的提取純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，大量流行病學(xué)研究表明，十字花科蔬菜具有顯著的化學(xué)預(yù)防癌癥的作用，經(jīng)常大量食用十字花科蔬菜的人群患多種癌癥的概率顯著低于不食用或少量食用十字花科蔬菜的人群，即十字花科蔬菜的攝入量與多種癌癥的發(fā)病率呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明十字花科蔬菜中含有的天然活性成分具有預(yù)防癌癥的功效。進(jìn)一步研究表明，十字花科蔬菜中含有大量的硫代葡萄糖苷和黑芥子酶，硫代葡萄糖苷分布于細(xì)胞液中，而黑芥子酶分布于特定的蛋白體中。在十字花科蔬菜組織細(xì)胞完好的情況下，硫代葡萄糖苷與黑芥子酶不能相互接觸，硫代葡萄糖苷可穩(wěn)定存在。當(dāng)組織細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，黑芥子酶可與硫代葡萄糖苷接觸，硫代葡萄糖苷被快速水解，形成不穩(wěn)定的糖苷配基，該糖苷配基通過(guò)非酶催化的分子內(nèi)重排反應(yīng)，轉(zhuǎn)化生成具有高效抗癌活性的異硫氰酸酯類化合物，因此，在人們食用十字花科蔬菜的過(guò)程中，十字花科蔬菜能夠生成并釋放具有高效抗癌活性的異硫氰酸酯類化合物，從而具有了抗癌防癌的功效。

蘿卜是一種人們?nèi)粘４罅渴秤玫氖只剖卟耍}卜芽苗、蘿卜根莖和蘿卜葉子中都含有豐富的還原型蘿卜硫苷(4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)和黑芥子酶，黑芥子酶可將還原型蘿卜硫苷水解，并通過(guò)非酶催化的分子內(nèi)重排反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成還原型蘿卜硫素(4-甲硫基-3-丁烯基異硫氰酸酯)。還原型蘿卜硫素是具有誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶活性的一種異硫氰酸酯類化合物，其不僅可提高人體對(duì)致癌物的清除能力，還可抑制并殺死癌細(xì)胞。研究表明，還原型蘿卜硫素可通過(guò)阻斷癌細(xì)胞周期循環(huán)以及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡而阻礙腫瘤組織的生長(zhǎng)；還原型蘿卜硫素可作為細(xì)胞致癌代謝途徑阻遏因子，通過(guò)多重機(jī)制特異性地調(diào)節(jié)組織細(xì)胞致癌代謝過(guò)程；還原型蘿卜硫素能夠高效誘導(dǎo)醌氧化還原酶的表達(dá)，加速細(xì)胞中致癌物質(zhì)的代謝排出過(guò)程，從而具有化學(xué)預(yù)防癌癥的功效；還原型蘿卜硫素具有抑制幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)增殖和小鼠胃炎的活性，并能夠通過(guò)抑制和消除幽門(mén)螺桿菌感染，來(lái)預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染引起的胃癌。還原型蘿卜硫素是蘿卜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強(qiáng)的植物化學(xué)組分，對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及腸癌等多種癌癥都具有很強(qiáng)的抑制功效。但還原型蘿卜硫素穩(wěn)定性極差，易降解，且易與含巰基的化合物反應(yīng)而失去抗癌活性，而其前體物質(zhì)還原型蘿卜硫苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，并在人體攝入后，可在腸道微生物的作用下轉(zhuǎn)化生成具有高效抗癌活性的還原型蘿卜硫素，因此，還原型蘿卜硫苷可作為抗癌和防癌天然活性成分，添加至食品、功能性食品、保健品和藥品中。目前，國(guó)際上可供出售的硫代葡萄糖苷高純品(純度≥98％)主要有4-甲基亞磺酰基-3-丁基硫代葡萄糖苷、4-甲硫基-3-丁基硫代葡萄糖苷、4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷和烯丙基硫代葡萄糖苷，均由美國(guó)和德國(guó)公司提供，且價(jià)格昂貴，而具有高效抗癌和防癌效果的還原型蘿卜硫苷高純品尚無(wú)公司銷售。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)目前還原型蘿卜硫苷依賴國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴、工藝技術(shù)復(fù)雜的缺點(diǎn)，提供了一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，該方法可高效率的制備高純度的還原型蘿卜硫苷，大大降低了生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了還原型蘿卜硫苷高純品的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)將蘿卜原材料干燥，粉碎，得蘿卜原材料粉末；

(2)以提取劑回流提取蘿卜原材料粉末，過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)回流提取，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，減壓蒸餾回收提取劑，得干燥的蘿卜提取物；

(3)用水溶解提取蘿卜提取物，過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)溶解提取，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物；

(4)酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為25-250μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡10-120min，重復(fù)洗滌1-5次，去離子水洗滌后，裝填于高徑比為2-30的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為25-750mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附0.25-20毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用5-20g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為1-15BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為210-245nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，減壓蒸餾得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的還原型蘿卜硫苷半成品；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為10-140μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡10-120min，重復(fù)洗滌1-5次，無(wú)水甲醇洗滌后，裝填于高徑比為2-30的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配置成10-750mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附0.1-15毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.超純水洗脫，在流速為1-15BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為210-245nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥到干燥的高純度還原型蘿卜硫苷。

所述的，步驟(1)中，蘿卜原材料為蘿卜芽苗、蘿卜根莖和蘿卜葉子中的一種；所述干燥為40-65℃條件下烘箱干燥至含水量為1.5-7.5％；粉碎的粉末粒度為30-300目。

所述的，步驟(2)中，提取劑為70-100％甲醇-水溶液，提取劑的加入量為蘿卜原材料粉末重量的5-30倍，回流提取0.5-3h，重復(fù)回流提取1-5次。

優(yōu)選的，步驟(2)中，提取劑的加入量為蘿卜原材料粉末重量的10-20倍，回流提取1-2h，重復(fù)回流提取2-3次。

所述的，步驟(3)中，水的加入量為蘿卜提取物重量的5-30倍，溶解提取10-180min，重復(fù)溶解提取1-5次。

優(yōu)選的，步驟(3)中，水的加入量為蘿卜提取物重量的10-20倍，溶解提取30-60min，重復(fù)溶解提取2-3次。

優(yōu)選的，步驟(4)中，酸性氧化鋁的粒徑為50-200μm，浸泡時(shí)間為30-60min，重復(fù)洗滌2-3次，低壓不銹鋼柱的高徑比為5-20，還原型蘿卜硫苷提取物溶液濃度為50-500mg/mL，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附0.5-15毫克還原型蘿卜硫苷提取物，硫酸鉀-水溶液濃度為5-15g/L，流速為3-10BV/h，檢測(cè)波長(zhǎng)為220-240nm。

所述的，步驟(4)中，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的10-30倍，攪拌浸取10-60min，重復(fù)浸取1-3次。

優(yōu)選的，步驟(5)中，親水C-18的粒徑為25-100μm；浸泡時(shí)間為30-60min；重復(fù)洗滌2-3次；低壓不銹鋼柱高徑比為5-20；還原型蘿卜硫苷半成品溶液濃度為25-500mg/mL；進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附0.25-10毫克還原型蘿卜硫苷半成品；流速為3-10BV/h；檢測(cè)波長(zhǎng)為220-240nm。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的原材料價(jià)廉易得，適用范圍廣，采用提取劑和水溶解提取還原型蘿卜硫苷提取物，同時(shí)沉淀除去大量親脂性雜質(zhì)成分，顯著提高了總體工藝產(chǎn)率和提取物中還原型蘿卜硫苷的含量；采用酸性氧化鋁低壓柱吸附和親水C-18低壓柱吸附相結(jié)合，顯著提高還原型蘿卜硫苷產(chǎn)品的純度及收率，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了提取純化工藝過(guò)程，易于工業(yè)化放大生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；

圖2為本發(fā)明制備的還原型蘿卜硫苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)；

圖3為本發(fā)明制備的還原型蘿卜硫苷提取物的高效液相色譜圖；

圖4為本發(fā)明酸性氧化鋁低壓柱初步純化還原型蘿卜硫苷提取物的色譜圖；

圖5為本發(fā)明親水C-18低壓柱純化還原型蘿卜硫苷半成品的色譜圖；

圖6為本發(fā)明制備的高純度還原型蘿卜硫苷的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的工藝技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜芽苗，50℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜芽苗，含水量為3.5％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在50-300目范圍內(nèi)的蘿卜芽苗粉末；

(2)采用100％甲醇-水溶液回流提取蘿卜芽苗粉末，100％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜芽苗粉末重量的5倍，回流提取1h，重復(fù)提取5次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為25.3％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的20倍，溶解提取60min，重復(fù)提取3次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為16.4％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為75-150μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡10min，重復(fù)洗滌5次，裝填于高徑比為30的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為25mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附0.25毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用20g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為1BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的10倍，攪拌浸取60min，重復(fù)浸取2次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為44.2％，收率為96.5％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為10μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡120min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌3次，裝填于高徑比為2的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成500mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附10毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為3BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為99.6％，收率為91.3％。

實(shí)施例2

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜芽苗，40℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜芽苗，含水量為7.5％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在30-300目范圍內(nèi)的蘿卜芽苗粉末；

(2)采用80％甲醇-水溶液回流提取蘿卜芽苗粉末，80％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜芽苗粉末重量的30倍，回流提取0.5h，重復(fù)提取3次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為27.5％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的5倍，溶解提取10min，重復(fù)提取5次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為19.2％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為25-50μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡60min，重復(fù)洗滌3次，裝填于高徑比為20的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為50mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附0.5毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用10g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為6BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的30倍，攪拌浸取30min，重復(fù)浸取1次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為50.3％，收率為93.6％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為50μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡60min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌5次，裝填于高徑比為5的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成10mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附0.1毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為1BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為99.2％，收率為92.5％。

實(shí)施例3

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜芽苗，65℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜芽苗，含水量為1.5％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在60-300目范圍內(nèi)的蘿卜芽苗粉末；

(2)采用70％甲醇-水溶液回流提取蘿卜芽苗粉末，70％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜芽苗粉末重量的20倍，回流提取3h，重復(fù)提取1次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為27.6％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的30倍，溶解提取180min，重復(fù)提取1次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為17.1％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為150-250μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡120min，重復(fù)洗滌5次，裝填于高徑比為15的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為350mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附7毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用15g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為10BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的20倍，攪拌浸取10min，重復(fù)浸取3次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為46.7％，收率為94.8％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為100μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡30min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌2次，裝填于高徑比為30的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成25mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附0.25毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為10BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為99.5％，收率為90.8％。

實(shí)施例4

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜根莖，切成10×10×20mm的方形柱體小塊，50℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜根莖，含水量為4.0％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在40-300目范圍內(nèi)的蘿卜根莖粉末；

(2)采用90％甲醇-水溶液回流提取蘿卜根莖粉末，90％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜根莖粉末重量的10倍，回流提取2h，重復(fù)提取3次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為22.1％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的20倍，溶解提取120min，重復(fù)提取2次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為15.2％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為50-200μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡120min，重復(fù)洗滌1次，裝填于高徑比為2的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為750mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附15毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用5g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為15BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的10倍，攪拌浸取20min，重復(fù)浸取2次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為43.5％，收率為93.2％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為25μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡10min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌3次，裝填于高徑比為10的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成750mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附15毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為15BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為98.5％，收率為86.7％。

實(shí)施例5

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜根莖，切成10×10×20mm的方形柱體小塊，55℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜根莖，含水量為2.5％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在60-300目范圍內(nèi)的蘿卜根莖粉末；

(2)采用100％甲醇-水溶液回流提取蘿卜根莖粉末，100％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜根莖粉末重量的20倍，回流提取0.5h，重復(fù)提取5次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為21.5％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的10倍，溶解提取60min，重復(fù)提取3次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為13.8％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為75-150μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡90min，重復(fù)洗滌4次，裝填于高徑比為5的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為250mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附10毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用15g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為3BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的30倍，攪拌浸取40min，重復(fù)浸取1次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為40.9％，收率為95.6％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為140μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡90min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌1次，裝填于高徑比為20的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成250mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附10毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為10BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為98.8％，收率為90.5％。

實(shí)施例6

一種以蘿卜為原材料制備高純度還原型蘿卜硫苷的方法，是由以下步驟制備得到的：

(1)收獲新鮮的蘿卜葉子，切成10×10mm的方形蘿卜葉片，45℃烘箱干燥，獲得干燥的蘿卜葉子，含水量為5.5％；高速粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩，獲得粒度在30-300目范圍內(nèi)的蘿卜葉子粉末；

(2)采用80％甲醇-水溶液回流提取蘿卜葉子粉末，80％甲醇-水溶液的加入量為蘿卜葉子粉末重量的30倍，回流提取2h，重復(fù)提取2次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下，減壓蒸餾回收甲醇，得干燥的蘿卜提取物，提取率為18.5％；

(3)將蘿卜提取物溶解于水中，水的加入量為蘿卜提取物重量的30倍，溶解提取30min，重復(fù)提取2次，過(guò)濾除去固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在55℃條件下減壓蒸餾，得干燥的還原型蘿卜硫苷提取物，總提取率為9.51％；

(4)采用酸性氧化鋁低壓柱色譜初步純化還原型蘿卜硫苷提取物：

a.將粒徑為50-75μm的酸性氧化鋁浸泡于去離子水中，浸泡30min，重復(fù)洗滌2次，裝填于高徑比為20的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷提取物用去離子水溶解配制成濃度為500mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷提取物溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷提取物溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升酸性氧化鋁上樣吸附20毫克還原型蘿卜硫苷提取物，去離子水洗脫，充分除去不能被酸性氧化鋁吸附的雜質(zhì)；

d.用10g/L的硫酸鉀-水溶液洗脫，在流速為10BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，在55℃條件下減壓蒸餾，得到干燥的還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物；

e.用無(wú)水甲醇攪拌浸取，無(wú)水甲醇的加入量為還原型蘿卜硫苷和硫酸鉀混合物總質(zhì)量的20倍，攪拌浸取50min，重復(fù)浸取2次，過(guò)濾除去硫酸鉀固體雜質(zhì)，收集并合并濾液，在50℃條件下減壓蒸餾回收甲醇，并得到干燥的還原型蘿卜硫苷半成品，還原型蘿卜硫苷含量為38.5％，收率為96.8％；

(5)親水C-18低壓柱色譜進(jìn)一步純化：

a.將粒徑為50μm的親水C-18浸泡于無(wú)水甲醇中，浸泡60min，無(wú)水甲醇重復(fù)洗滌3次，裝填于高徑比為15的低壓不銹鋼柱中；

b.將還原型蘿卜硫苷半成品用超純水溶解配制成100mg/mL的溶液，5000rpm離心20min，除去固體雜質(zhì)，得還原型蘿卜硫苷半成品溶液；

c.將還原型蘿卜硫苷半成品溶液上樣，進(jìn)樣量為每毫升親水C-18上樣吸附5毫克還原型蘿卜硫苷半成品；

d.用超純水洗脫，在流速為6BV/h和檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm下，收集還原型蘿卜硫苷色譜峰，經(jīng)冷凍干燥得到高純度還原型蘿卜硫苷，還原型蘿卜硫苷含量為98.2％，收率為85.6％。