本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及磁性納米材料，具體涉及一種磁性納米材料及其制備方法和在用于富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的方法中的用途。

技術(shù)背景

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了蛋白質(zhì)的S-?；揎検且环N非常重要的翻譯后修飾形式。蛋白質(zhì)的S-?；?S-acylation)修飾，通常也被稱(chēng)作棕櫚?；揎?palmitoylation)，它是指長(zhǎng)鏈脂肪酸(主要是16個(gè)碳的棕櫚酸)通過(guò)硫酯鍵共價(jià)修飾到蛋白質(zhì)半胱氨酸的巰基上。研究顯示，S-?；揎検莿?dòng)態(tài)、可逆的，它可調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，蛋白-蛋白相互作用，有效地增加蛋白質(zhì)的疏水性，促進(jìn)自身或其它蛋白質(zhì)定位膜脂筏等，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、疾病的發(fā)生和癌變中都起著重要的作用。

現(xiàn)有技術(shù)的研究基本上是采用生物素(biotin)或代謝標(biāo)記的方法富集該類(lèi)修飾，然而實(shí)踐表明，利用biotin的方法容易得到內(nèi)源性生物素化的蛋白質(zhì)/肽段，造成假陽(yáng)性結(jié)果，利用代謝標(biāo)記只能分析活細(xì)胞，對(duì)于組織樣品和體液等樣品無(wú)法分析。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)分析富集手段的缺陷，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種能與巰基特異反應(yīng)的新型磁性納米材料，進(jìn)一步建立低豐度S-?；揎椀鞍踪|(zhì)高效富集的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)分析富集手段的缺陷，提供一種能與巰基特異反應(yīng)的新型磁性納米材料，具體涉及一種磁性納米材料及其制備方法和用于富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的方法中的用途。

本發(fā)明中提供了Fe₃O₄@NH₂@SPDP新型的磁性納米材料的合成方法，用該磁性納米材料能選擇性地提高富集棕櫚?；揎楇亩?蛋白的效率，進(jìn)一步建立了一種高效富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段新方法，用于實(shí)際生物樣本的分析。

具體的，本發(fā)明的磁性納米材料，其特征是，用合成的納米Fe₃O₄磁核作為材料磁性中心，將3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)包裹Fe₃O₄磁核，得到Fe₃O₄@NH₂@SPDP磁性納米材料。

本發(fā)明中，包裹Fe₃O₄磁核的3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)能與棕櫚酰化修飾的肽段/蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)。

本發(fā)明提供了所述的磁性納米材料的制備方法，其包括步驟：

1)合成氨基磁珠

1)稱(chēng)取無(wú)水乙酸鈉(NaAc)與三氯化鐵(FeCl₃·6H₂O)于燒杯中，加入乙二醇，攪拌溶解；

2)蠟狀固體乙二胺，加熱溶解變?yōu)橐后w狀，加入上述反應(yīng)燒杯中，溶解完全后，溶液變?yōu)榧t橙色；

3)將溶解后的溶液倒入反應(yīng)釜中；

4)將反應(yīng)釜放入烘箱中，180℃反應(yīng)6h；

5)反應(yīng)結(jié)束后，取出冷卻；

6)分別用水和乙醇對(duì)反應(yīng)結(jié)束后的材料進(jìn)行洗滌，得氨基磁珠Fe₃O₄@NH₂；

2，合成Fe₃O₄@NH₂@SPDP

1)取合成的氨基磁珠Fe₃O₄@NH₂，用乙醇和PBS-EDTA各洗三次后，用PBS-EDTA配成濃度為1mg/ml；

2)用二甲基亞砜(DMSO)溶解SPDP粉末后，加入Fe₃O₄@NH₂溶液后的濃度為1mg/ml；

3)在避光條件下室溫反應(yīng)過(guò)夜，所述SPDP嫁接到合成的氨基磁珠納米材料上，得Fe₃O₄@NH₂@SPDP納米材料；

4)將獲得的Fe₃O₄@NH₂@SPDP用PBS-EDTA溶液洗滌后備用。

本發(fā)明中，將得到的Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP在高倍電鏡下檢測(cè)形貌特征，結(jié)果如圖2所示，磁核球型從圖2a)和c)中顯示Fe₃O₄@NH₂核殼納米材料呈圓球形，粒徑均一，平均粒徑約為100nm左右；圖2中b)和d)圖分別顯示了Fe₃O₄@NH₂@SPDP的掃描電鏡圖和透射電鏡圖，圖中清楚地表明Fe₃O₄@NH₂@SPDP呈規(guī)則的圓球形，粒徑均一，分散性較好，平均粒徑為100nm； 最終連接上SPDP的磁球在電鏡圖下未見(jiàn)明顯變化，這是基于SPDP官能團(tuán)只是嫁接在最外層緣故，故，視覺(jué)上不增加其粒徑尺寸。

本發(fā)明中，對(duì)Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP的紅外表征結(jié)果如圖3所示：圖a)中561cm^-1是Fe-O的彎曲振動(dòng)吸收峰，圖b)中增加了1678cm^-1和1634cm^-1兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于連接上SPDP后形成的酰胺鍵上的C＝O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)峰；酰胺鍵的形成說(shuō)明SPDP被成功的嫁接在最外層；另一個(gè)峰1419cm^-1表示酰胺中的C-N峰。

本發(fā)明中，對(duì)Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP的磁性測(cè)定結(jié)果顯示，由于Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP材料是磁性納米材料，其有特殊的超順磁性，本發(fā)明中在室溫下測(cè)定它的磁滯曲線，圖4中a)表明Fe₃O₄磁球的飽和磁化強(qiáng)度為97.86emu/g，說(shuō)明其具有非常好的磁響應(yīng)性；而嫁接了SPDP后(如圖4b所示)，飽和磁化強(qiáng)度都有所下降，為95.94emu/g；所述的磁響應(yīng)度的下降說(shuō)明磁球表面確實(shí)包裹了SPDP，雖然磁響應(yīng)度下降，但是并不影響后續(xù)蛋白質(zhì)富集的操作。

本發(fā)明制備的磁性納米材料進(jìn)一步用于富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的方法中，其中，用合成的Fe₃O₄@NH₂@SPDP納米材料作為富集材料對(duì)含有棕櫚?；揎椀幕旌衔镞M(jìn)行選擇性富集，有高效的富集選擇性；更優(yōu)選的，從肽段層面和蛋白層面兩個(gè)路線進(jìn)行該方法的富集，將肽段層面得到的樣品經(jīng)過(guò)LC/MS MS分析后，能得到豐富的修飾肽段/蛋白信息；

所述的富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的方法中，包括：

1)以合成的帶有棕櫚酸修飾的肽段(S-G#R)作為標(biāo)準(zhǔn)修飾肽段，用Fe₃O₄@NH₂@SPDP作為富集材料進(jìn)行特異性富集，測(cè)試富集效果；

以標(biāo)準(zhǔn)合成肽段S-G#R與馬心肌紅蛋白[Myoglobin(MYO)]酶解肽段的混合物作為模型測(cè)試Fe₃O₄@NH₂@SPDP的選擇性富集S-G#R的效果；

本發(fā)明的實(shí)施例中，在弱堿性的水相體系中，將Fe₃O₄@NH₂@SPDP納米材料與合成的棕櫚?；揎椀碾亩魏蜆?biāo)準(zhǔn)蛋白酶解肽段混合物共同孵育，洗脫后得到了失去棕櫚酸化修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段，在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)下檢測(cè)，評(píng)價(jià)該材料對(duì)棕櫚酰化修飾肽段的富集選擇性；

2)以S-G#R為標(biāo)準(zhǔn)肽段，在逐漸降低肽段起始上樣量下用相同質(zhì)量的 Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集S-G#R，測(cè)試Fe₃O₄@NH₂@SPDP的靈敏度；

3)以S-G#R為標(biāo)準(zhǔn)肽段，在加入相同比例的肽段混合物與Fe₃O₄@NH₂@SPDP孵育時(shí)，縮短反應(yīng)時(shí)間的富集效果；

4)以S-G#R為標(biāo)準(zhǔn)肽段，在相同的Fe₃O₄@NH₂@SPDP用量下，測(cè)試加入不同質(zhì)量S-G#R時(shí)材料的富集容量；

5)用小鼠肝膜蛋白作為復(fù)雜生物樣品，對(duì)得到的蛋白樣品和酶解后肽段樣品，用Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集，測(cè)試Fe₃O₄@NH₂@SPDP用于實(shí)際樣品分析的可行性；本發(fā)明的實(shí)施例中，在弱堿性的水相體系中，將Fe₃O₄@NH₂@SPDP納米材料與復(fù)雜生物樣品酶解肽段孵育后，洗脫后得到失去棕櫚?；揎椀碾亩螛悠?，用高分辨的質(zhì)譜方法檢測(cè)樣品，評(píng)價(jià)該材料對(duì)復(fù)雜樣品中修飾肽段的富集能力；在弱堿性的水相體系中，將Fe₃O₄@NH₂@SPDP納米材料與復(fù)雜生物樣品蛋白質(zhì)孵育，洗脫后的得到了失去棕櫚?；揎椀牡鞍讟悠?，將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后比較富集與未富集樣品的差異，評(píng)價(jià)該材料對(duì)復(fù)雜樣品中修飾蛋白的富集能力。

結(jié)果顯示，本發(fā)明制得的納米材料具有大的比表面積，能增大富集容量，提高富集效率；利用磁分離分離快速、操作簡(jiǎn)便；利用其的裂解位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)富集后肽段/蛋白的洗脫，對(duì)實(shí)際生物樣品富集，結(jié)合質(zhì)譜分析，能得到豐富的修飾位點(diǎn)信息。采用本發(fā)明的富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的方法能提高棕櫚?；揎楇亩?蛋白的富集檢測(cè)效率，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的帶有棕櫚酸修飾的肽段的富集靈敏度可達(dá)0.05ng/μl，尤其在混合了棕櫚?；揎楇亩魏蜆?biāo)準(zhǔn)蛋白酶解肽段的樣品中，F(xiàn)e₃O₄@NH₂@SPDP可以選擇性地富集得到修飾的肽段，并且經(jīng)過(guò)清洗步驟后沒(méi)有多余的雜質(zhì)肽段被富集。

本發(fā)明中，利用材料的特殊反應(yīng)基團(tuán)實(shí)現(xiàn)S-?；揎楇亩蔚奶禺惛患?；利用其納米尺寸具有大的比表面積，增大富集容量，提高富集效率；利用其磁核心實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便地分離；利用其裂解位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)富集后肽段的洗脫，獲得豐富的修飾位點(diǎn)信息。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果有：

制備合成Fe₃O₄@NH₂@SPDP磁性納米材料的方法簡(jiǎn)單高效，制得的Fe₃O₄@NH₂@SPDP可以選擇性地富集棕櫚酰化修飾的肽段/蛋白，同時(shí)減少肽段/ 蛋白的非特異吸附；相比較于現(xiàn)有技術(shù)的方法，本發(fā)明的Fe₃O₄@NH₂@SPDP材料合成步驟簡(jiǎn)單，該納米材料具有大的比表面積，增大了富集容量，提高了富集效率；利用磁分離分離快速、操作簡(jiǎn)便，能避免樣品的損失，節(jié)省分離時(shí)間；利用它的裂解位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)富集后肽段/蛋白的洗脫，對(duì)實(shí)際生物樣品富集，結(jié)合質(zhì)譜分析，能得到豐富的修飾位點(diǎn)信息。

附圖說(shuō)明

圖1為SPDP的結(jié)構(gòu)示意圖及Fe₃O₄@NH₂@SPDP的合成路線。

圖2為Fe₃O₄@NH₂@SPDP的電鏡示意圖。

圖3為Fe₃O₄@NH₂@SPDP的紅外表征圖。

圖4為Fe₃O₄@NH₂@SPDP的磁滯曲線圖。

圖5為上樣量為50ng的棕櫚?；揎楇亩蜸-G#R(#)(a圖)在羥胺(HA)的作用下，失去棕櫚酸修飾基團(tuán)后，與Fe₃O₄@NH₂@SPDP反應(yīng)后，富集洗脫后得到S-GR(*)(b圖)；#代表棕櫚?；揎椀碾亩?，*代表失去棕櫚酸修飾鏈的肽段。

圖6為棕櫚酰化修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-G#R與MYO酶解肽段摩爾比為1:1(a，c)和1:20(b，d)時(shí)，用Fe₃O₄@NH₂@SPDP選擇性富集S-G#R前后的質(zhì)譜圖?！翊鞰YO的酶解肽段峰，#代表棕櫚酰化修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-G#R，*代表失去棕櫚酸修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-GR。

圖7為棕櫚?；揎椀臉?biāo)準(zhǔn)肽段S-G#R與MYO酶解肽段摩爾比為1:50(a，c)和1:100(b，d)時(shí)，用Fe₃O₄@NH₂@SPDP選擇性富集S-G#R前后的質(zhì)譜圖。●代表MYO的酶解肽段峰，#代表棕櫚酰化修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-G#R，*代表失去棕櫚酸修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-GR。

圖8為棕櫚?；揎椀臉?biāo)準(zhǔn)肽段S-G#R與MYO酶解肽段摩爾比為1:1(a)和1:100(b)時(shí)，在縮短反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)后的效果。*代表失去棕櫚酸修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-GR。

圖9為起始上樣量為0.05ng的S-G#R經(jīng)過(guò)Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集后，洗脫的肽段S-GR的質(zhì)譜圖。*代表失去棕櫚酸修飾的標(biāo)準(zhǔn)肽段S-GR。

圖10為在不同肽段S-G#R的起始反應(yīng)量下，質(zhì)譜檢測(cè)富集后的上清中S-GR 的信號(hào)強(qiáng)度分布圖。

圖11為用Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集鼠肝膜蛋白后的樣品，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯包裹的新型磁性納米材料

1，合成氨基磁珠

1)稱(chēng)取無(wú)水乙酸鈉(NaAc)8g與三氯化鐵(FeCl₃·6H₂O)2g于一燒杯中，加入60ml乙二醇，攪拌溶解；

2)乙二胺為蠟狀固體，加熱溶解變?yōu)橐后w狀，用吸管吸取7.2ml(約7.2g)加入上述反應(yīng)燒杯中。溶解完全后，溶液變?yōu)榧t橙色；

3)將溶解后的溶液倒入反應(yīng)釜中；

4)將反應(yīng)釜放入烘箱中，180℃反應(yīng)6h；

5)反應(yīng)結(jié)束后，取出冷卻；

6)分別用水和乙醇對(duì)材料進(jìn)行洗滌；

2，合成Fe₃O₄@NH₂@SPDP

1)取上述合成的氨基磁珠Fe₃O₄@NH₂，用乙醇和PBS-EDTA各洗三次后，用PBS-EDTA配成濃度為1mg/ml；

2)用二甲基亞砜(DMSO)溶解SPDP粉末后，加入Fe₃O₄@NH₂溶液后的濃度為1mg/ml；

3)在避光條件下室溫反應(yīng)過(guò)夜；

4)將得到的Fe₃O₄@NH₂@SPDP用PBS-EDTA溶液洗滌后即可使用。

本實(shí)施例中，將制得的Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP在高倍電鏡下檢測(cè)形貌特征，結(jié)果如圖2所示，磁核球型從圖2a)和c)中可以看出Fe₃O₄@NH₂核殼納米材料呈圓球形，粒徑均一，平均粒徑約為100nm左右；圖2b)和d)圖顯示了Fe₃O₄@NH₂@SPDP的掃描電鏡圖和透射電鏡圖，其中顯示Fe₃O₄@NH₂@SPDP呈規(guī)則的圓球形，粒徑均一，分散性較好，平均粒徑為100nm；最終連接上SPDP之后的磁球在電鏡圖下變化不大；

對(duì)Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP的紅外表征結(jié)果如圖3所示，圖a)中561cm^-1是Fe-O的彎曲振動(dòng)吸收峰，圖b)中增加了1678cm^-1和1634cm^-1兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于連接上SPDP后形成的酰胺鍵上的C＝O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)峰；酰胺鍵的形成說(shuō)明SPDP已經(jīng)被成功的嫁接在最外層；另一個(gè)峰1419cm^-1表示酰胺中的C-N峰；

室溫下對(duì)Fe₃O₄@NH₂和Fe₃O₄@NH₂@SPDP磁性測(cè)定，圖4a)顯示Fe₃O₄磁球的飽和磁化強(qiáng)度為97.86emu/g，說(shuō)明其具有非常好的磁響應(yīng)性；而嫁接了SPDP后(如圖4b所示)，飽和磁化強(qiáng)度都有所下降，95.94emu/g；磁響應(yīng)度的下降說(shuō)明磁球表面確實(shí)包裹了SPDP。

實(shí)施例2

1)取1μl帶有棕櫚?；揎椀碾亩蜸-G#R(100ng/μl)與Fe₃O₄@NH₂@SPDP在羥胺(pH 7.4)的PBS-EDTA溶液中孵育，室溫4小時(shí)后，磁分離除去上清，將材料經(jīng)過(guò)洗滌后，用60mM二硫蘇糖醇(DTT)洗脫下結(jié)合的S-GR，用C18ziptip對(duì)洗脫液除鹽，此時(shí)的S-GR肽段已經(jīng)失去了棕櫚酰修飾的側(cè)鏈，分子量發(fā)生了變化，點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析后，結(jié)果如圖5所示，圖5(a)和圖5(b)分別顯示用Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集前后的質(zhì)譜圖，進(jìn)過(guò)富集后能得到清晰的994肽段峰；

2)取S-G#R肽段和MYO酶解肽段分別按照摩爾比1:1，1:20，1:50和1:100混合后，各取1μl混合物點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，結(jié)果如圖6(a)(b)和圖7(a)(b)所示，結(jié)果顯示混合物中，S-G#R的信號(hào)被MYO酶解肽段的信號(hào)所抑制，隨著MYO肽段的增多，沒(méi)有S-G#R信號(hào)出現(xiàn)，當(dāng)用Fe₃O₄@NH₂@SPDP富集后，經(jīng)過(guò)洗滌，洗脫，除鹽，用1μl點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，結(jié)果如圖6(c)(d)和圖7(c)(d)所示，失去棕櫚?；揎椀腟-GR有很強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)峰出現(xiàn)，并且沒(méi)有明顯的MYO肽段峰信號(hào)，說(shuō)明Fe₃O₄@NH₂@SPDP具有優(yōu)秀的富集選擇性；

3)取S-G#R肽段和MYO酶解肽段分別按照摩爾比1:1和1:100混合后，按照上述2的操作進(jìn)行，最后取1μl點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，得如圖8所示的結(jié)果，將反應(yīng)時(shí)間縮短至1小時(shí)后，在摩爾比為1:1和1:100的混合物中，依舊能夠檢測(cè)到清晰的S-GR的肽段峰信號(hào)，進(jìn)一步說(shuō)明Fe₃O₄@NH₂@SPDP能在迅速 的與目標(biāo)肽段結(jié)合，能縮短檢測(cè)時(shí)間，更加方便快捷。

實(shí)施例3

取1μlS-G#R(0.05ng/μl)與Fe₃O₄@NH₂@SPDP一起孵育后，評(píng)價(jià)該方法對(duì)棕櫚?；亩蔚母患`敏度，從富集洗脫后的溶液中取樣點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析(如圖9所示)，富集后S-GR信號(hào)峰明顯，說(shuō)明該方法有很高的靈敏度。

實(shí)施例4

為了測(cè)定該方法的富集容量，將等量的Fe₃O₄@NH₂@SPDP分別與一系列不同濃度的1μl S-G#R肽段孵育4小時(shí)，然后分別利用外加磁場(chǎng)分離除去Fe₃O₄@NH₂@SPDP，對(duì)得到的上清進(jìn)行除鹽后點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，理論上只有當(dāng)S-GR的肽段總量高于材料的富集容量時(shí)，才能檢測(cè)到肽段信號(hào)峰，經(jīng)測(cè)定，表明本發(fā)明的方法對(duì)肽段的富集容量達(dá)到6.7×10^-3-8.3×10^-3mg/g結(jié)果(如圖10所示)。

實(shí)施例5生物樣本分析

按如下過(guò)程提取小鼠肝臟膜蛋白：

1)分離純化鼠肝膜組分：取新鮮的小鼠肝組織，剪碎后用預(yù)冷的PBS溶液洗去血液等，加入裂解液A(150mM NaCl,50mM Tris,5mM EDTA,pH 7.4)進(jìn)行勻漿，高速離心(200000g，4℃)30分鐘后收集其中的膜組分；

2)取5mg上述小鼠肝膜組分蛋白質(zhì)，加入蛋白質(zhì)裂解液B(2％SDS,50mM Tris,5mM EDTA,pH 7.4)，加入終濃度為20mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)還原打開(kāi)蛋白質(zhì)中的二硫鍵，并加入終濃度為50mM的N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)避光反應(yīng)，封閉蛋白質(zhì)中的自由巰基；采用甲醇-氯仿沉淀蛋白質(zhì)樣品除去其中過(guò)量的TCEP和NEM。加入裂解液A重懸蛋白質(zhì)，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；

3)在蛋白層面的富集：經(jīng)過(guò)還原烷基化后的蛋白質(zhì)樣品等分成兩部分，每份含蛋白2.5mg，加入Fe₃O₄@NH₂@SPDP后，其中一份加入pH 7.4的羥胺，另一份加入pH 7.4的Tris溶液，室溫處理2～4hr，通過(guò)磁分離除去上清，將得到的材料洗滌后，加入DTT洗脫下富集到的蛋白，凍干后，對(duì)得到的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離。跑膠結(jié)束后，用考馬蘇亮藍(lán)染色后，加羥胺處理的樣品對(duì)比加Tris的樣品 有更加明顯藍(lán)色蛋白條帶出現(xiàn)；

4)在肽段層面的富集：同樣取用等量的兩份經(jīng)過(guò)還原烷基化處理的蛋白樣品，加入胰酶(按照蛋白：胰蛋白酶質(zhì)量比為40:1)酶解過(guò)夜后，加入Fe₃O₄@NH₂@SPDP后，其中一份加入pH 7.4的羥胺，另一份加入pH 7.4的Tris溶液，室溫處理2～4hr。再經(jīng)過(guò)分離、洗滌、洗脫、除鹽步驟，對(duì)得到的肽段樣品直接進(jìn)行LC/MS MS分析。