專利名稱：呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層析技術制作的一種呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
硝基呋喃類藥物為一種光譜抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被廣泛應用于飼料添加劑和治療藥物，用于預防和治療由沙門氏菌和埃希氏桿菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。他們對人類健康有惡性影響，有致癌性。歐盟出于食品安全的考慮，在96/23/EC法規(guī)中將硝基呋喃類抗生素列為A類禁用·藥，決定從1997年I月I日起，禁止在動物飼料中添加任何硝基呋喃類抗生素。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。歐盟委員會于2003年通過了 2003/181/EC委員會決議，建立了用于檢測禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物的代謝物的各種方法的最小要求性能限值為Iu g/kg。目前，歐盟、美國及其他國家都對進口動物性食品中硝基呋喃類抗生素殘留做了非常嚴格的限制，要求4種硝基呋喃代謝物殘留不得超過I U g/kg。為了人和動物的安全很有必要對水源和食品(如肉)進行抗生素殘留檢測。呋喃類藥物本身的檢測很難，因為在食入這些藥物后會很快地發(fā)生代謝。這些代謝產物會在組織中存在很長時間。AMOZ是呋喃它酮的代謝物，在一般的烹調中不易分解，在溫和的酸性條件下可以從組織中釋放出來。因此可以用來做檢測使用。目前，檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)、酶聯免疫分析法(ELISA)。這些方法靈敏度高，結果準確，但是具有需要昂貴的儀器，檢測繁瑣、費時，檢測人員需要一定的專業(yè)培訓等缺點。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術制備了一種呋喃它酮代謝物檢測試劑盒。本發(fā)明具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、無需復雜儀器等特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快捷、靈敏度高、成本低的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法。一種呋喃它酮代謝物檢測試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了 AMOZ衍生物偶聯載體蛋白，質控線(C線)上包被了羊抗兔IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。偶聯呋喃它酮代謝物的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。
本發(fā)明采用納米膠體金技術及抗原抗體特異性反應，應用免疫競爭抑制反應的原理制備而成，通過待檢樣本中可能含有的AMOZ衍生物與硝酸纖維素膜上檢測線(T線)包被的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白競爭結合膠體金標記的AMOZ衍生物抗體的反應，使T線顯現肉眼可見紅色條帶用于判定待檢樣本中是否含有AM0Z。本發(fā)明提供了一種呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟(I)制備AMOZ衍生物偶聯載體蛋白呋喃它酮是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯后才能具有免疫原性。將AMOZ和間羧基苯丙醛在水中反應進行衍生化得到AMOZ衍生物半抗原。采用NHS活性酯法將AMOZ衍生物半抗原與載體蛋白偶聯得到AMOZ衍生物偶聯載體蛋白作為免疫原和包被原。其中載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)。 (2)制備AMOZ衍生物多克隆抗體采用AMOZ衍生物偶聯載體蛋白作為免疫原免疫白兔，制備抗AMOZ衍生物多克隆抗體。(3)制備膠體金取0.01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20_40nm。(4)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入AMOZ衍生物多克隆抗體，使AMOZ衍生物多克隆抗體的濃度為10-40 ii g/ml膠體金,混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入10-80 u I/ml膠體金的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物按15-35 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥
2.5-3小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP，0. 30% Casein-Na,pH值7. 0-9. 0的溶液。 (5)包被AMOZ衍生物偶聯載體蛋白、羊抗兔IgG抗體將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm。將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置干燥箱設置45°C，干燥1-1. 5小時。其中，T線包被液為0. 8-3. 5mg/ml的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白；C線包被液為
0.6-2. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。(6)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含0. 5-1. 5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(7)組裝試劑盒
取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開切條機，按產品要求設置裁切寬度，將上述組裝好的PVC板放于切條機上，按設置寬度進行切條，得到所述用于檢測呋喃它酮代謝物的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。本發(fā)明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出呋喃它酮代謝物檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，5-10分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果；或將呋喃它酮代謝物檢測試紙條樣品墊末端浸入被測樣品溶液中約10秒鐘后，水平放置；5-10分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。本發(fā)明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術測定AM0Z，因AMOZ的分子量較小，屬于小分子物質，抗體不能捕獲游離的AM0Z，因此需要檢測其衍生物。檢測樣品時，因毛細作用樣品溶液的沿試紙條向吸樣墊一端層析，若被測樣品中含有AMOZ衍生物，它們將和檢測線(T線)上包被的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白競爭結合膠體金標記的AMOZ衍生物多克 隆抗體上有限的抗體結合位點，當樣品中的AMOZ衍生物達到一定濃度時，與膠體金標記的AMOZ衍生物多克隆抗體發(fā)生免疫反應并完全飽和，此時膠體金復合物已無空余的位點和檢測線上包被的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白結合，此時T線不顯色，此為陽性結果；若被測樣品中不含AMOZ衍生物，標記了 AMOZ衍生物多克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置后，與T線上包被的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白發(fā)生免疫結合反應，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現出一條肉眼可見的紅色條帶，此為陰性結果。無論被測樣品中是否含有呋喃它酮，膠體金標記物均會與C線包被的羊抗兔IgG反應形成一條肉眼可見的紅色條帶，C線顯色與否，是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。


圖I呋喃它酮代謝物檢測試劑盒結構示意圖；附圖符號說明I :樣品墊；2 :膠體金墊(膠體金標記AMOZ衍生物多克隆抗體的聚酯膜)3 :硝酸纖維素膜(T :包被了 AMOZ衍生物偶聯載體蛋白的檢測線；C :包被了羊抗兔IgG多克隆抗體的質控線)；4 :吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖2本發(fā)明試劑盒的檢測結果示意圖。自左至右依次為C線一條線陽性檢測結果；T、C兩條線陰性檢測結果；無效。實施例I :呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的制備I.制備AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白將AMOZ和間羧基苯丙醛在水中反應進行衍生化得到AMOZ衍生物半抗原。采用NHS活性酯法將AMOZ衍生物半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白作為免疫原和包被原。
2.制備AMOZ衍生物多克隆抗體AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白作為免疫原免疫白兔，制備抗AMOZ衍生物多克隆抗體。3.制備膠體金取0.01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據需要迅速加入I %枸櫞酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5min,出現橙紅色。這樣制成的膠體 金顆粒的大小為20_40nm。4.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入70 u I濃度為3. 5mg/ml的AMOZ衍生物多克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入125 ill 10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用2. 5ml的膠體金復溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物按20 u I/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥3小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含0. 30% 的 Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP，0. 30% Casein-Na,pH值8.0的溶液。5.包被AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白、羊抗兔IgG抗體 將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 i! 1/cm, T線I. 0 i! 1/cm。將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置干燥箱設置45°C，干燥I. 5小時。其中，T線包被液為I. Omg/ml的AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白；C線包被液為I. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。6.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 8. O的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含I. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用7.組裝試劑盒取上述制備好的膠體金墊、PVC板及樣品墊，將膠體金墊切成寬度為IOmm的條型，然后膠體金墊貼于PVC板上NC膜的靠近T線端，壓NC膜1-1. 5_，樣品墊貼于膠體金墊的上方，露出金墊2-3mm(如圖I所示)。打開切條機，設置裁切寬度為3. 8mm，將上述組裝好的PVC板放于切條機上，按設置寬度進行切條，得到所述用于檢測呋喃它酮代謝物的試紙條；試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。實施例2 :呋喃它酮代謝物檢測試劑盒的檢測I.樣品的處理取Ig組織樣品組織樣品搗碎后，加入5ml蒸餾水，IM的HCl 0. 5ml和0. OlM的苯甲醛(乙醇溶液)100 U 1，充分振蕩，置于60°C過夜。然后加入IM的K2HP045ml，IM的NaOH
0.4ml以及5ml的乙酸乙酯,劇烈振蕩30秒。室溫下4000rpm離心10分鐘,然后取2. 5ml乙酸乙酯上清液轉移到新容器中。在45°C下用氮氣將其吹干，然后用正己烷重新溶解后與Iml 的 0. OlM PBST (pH 7. 4,0. 05% Tween-20)混勻。室溫下 4000rpm 離心 10 分鐘，最后取底部水相測定。2 檢測方法取出呋喃它酮代謝物檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。3.結果判定陽性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽性結果；陰性T線、C線均顯色，判定為陰性結果；無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經變質損壞。權利要求
1.一種呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了 AMOZ衍生物偶聯載體蛋白，質控線(C線)上包被了羊抗兔IgG抗體；所述吸樣墊為吸水紙。
2.—種權利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白為AMOZ衍生物偶聯牛血清白蛋白或卵清白蛋白；所述的AMOZ衍生物多克隆抗體由AMOZ衍生物偶聯載體蛋白作為免疫原免疫白兔獲得。
3.—種權利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆 粒。
4.一種權利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. 2mol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入AMOZ衍生物多克隆抗體，使AMOZ衍生物多克隆抗體的濃度為10-40 u g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；然后加入10-80 iil/ml膠體金的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；上述溶液于12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30-70%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物；將AMOZ衍生物多克隆抗體-膠體金標記物按15-35 iil/cm2的比例均勻的鋪在聚酯膜上，放入45°C干燥箱干燥2. 5-3小時，制成膠體金墊。
5.一種權利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復溶液為含0. 30%的Tris，5%蔗糖，0. 50% PVP, 0. 30% Casein-Na, pH值7.0-9. 0的溶液。
6.一種權利要求I所述的呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上T、C線的包被方法為將NC膜粘貼在PVC板上，吸水紙貼到PVC板上壓住膜1-1. 5mm。打開劃膜儀，按清洗鍵清洗劃膜儀，設置劃膜儀參數為C線I. 0 y 1/cm, T線l.Ou 1/cm ;將貼好的PVC板放在劃膜儀上，用C、T線包被液在NC膜上分別劃C、T線。劃膜不合格的用紅記號筆標出，將包被板置干燥箱設置45°C，干燥1-1. 5小時。其中，T線包被液為0. 8-3. 5mg/ml的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白；C線包被液為0. 6-2. Omg/ml的羊抗兔IgG抗體。
全文摘要
呋喃它酮代謝物檢測試劑盒及其制備方法，本發(fā)明涉及生物學免疫方法的測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒由樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)組成，在PVC支撐板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。膠體金墊為膠體金標記的AMOZ衍生物多克隆抗體聚酯膜，硝酸纖維素膜上依次包被了AMOZ衍生物偶聯載體蛋白作為檢測線(T線)，羊抗兔IgG抗體作為質控線(C線)。本發(fā)明利用膠體金免疫層析技術，運用被測樣品中可能含有的AMOZ衍生物與硝酸纖維素膜上包被的AMOZ衍生物偶聯載體蛋白競爭結合膠體金標記的AMOZ衍生物多克隆抗體的原理檢測樣品中是否含有AMOZ。
文檔編號G01N33/532GK102721805SQ201110076459
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權日2011年3月29日
發(fā)明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請人:寶瑞源生物技術(北京)有限公司