酮古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，特別設(shè)及酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素C是維持機(jī)體生長(zhǎng)和代謝所必須的一種水溶性維生素，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī) 藥、食品、飼料和化妝品領(lǐng)域，市場(chǎng)穩(wěn)定。目前維生素C的主流生產(chǎn)法是二步發(fā)酵法，主要指 從D-山梨醇開始，經(jīng)過(guò)兩步發(fā)酵轉(zhuǎn)化為維生素C前體一2-酬-k古龍酸的過(guò)程。第一步， 利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為k山梨糖，第二步利用生酬古龍酸桿菌及其伴 生菌（主要為芽抱桿菌）的混菌體系將k山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酬-k古龍酸。由于該菌株單 獨(dú)培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，影響其在擴(kuò)增培養(yǎng)、菌種活化的工業(yè)應(yīng)用，因此，尋找合適的培養(yǎng)基配方， 促進(jìn)其生長(zhǎng)，對(duì)工業(yè)應(yīng)用有很高價(jià)值。
[0003] 對(duì)促進(jìn)酬古龍酸桿菌生長(zhǎng)的物質(zhì)的研究，包括添加谷脫甘膚、Ξ簇酸循環(huán)中的四 碳酸或其鹽、硫辛酸、輔因子均對(duì)酬古龍酸桿菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用?，F(xiàn)有技術(shù)采用外源添加物 質(zhì)嘗試提高小菌生物量及產(chǎn)酸量，但由于外源添加物質(zhì)的濃度直接關(guān)系到企業(yè)成本，具有 企業(yè)應(yīng)用局限。因此，提供一種酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法。本專利提出用D-山梨 醇、D-甘露醇替換山梨糖作為碳源的種子培養(yǎng)方案，提高菌株的生物量達(dá)2倍，對(duì)活化工業(yè) 菌株有重要意義。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了山梨醇和/或甘露醇作為碳源在培養(yǎng)酬古龍酸桿菌中的應(yīng)用。
[0007] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述應(yīng)用中山梨醇或甘露醇在酬古龍酸桿菌的 種子培養(yǎng)基中的添加量為15~45g/L。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種酬古龍酸桿菌的種子培養(yǎng)基，用山梨醇和/或甘露醇代替山 梨糖作為碳源。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述種子培養(yǎng)基包括玉米漿l-5g/l，酵母粉 1~5g/l，牛肉膏1~5g/L蛋白腺1~20g/l，尿素0. 2~2g/l，憐酸二氨鐘0. 1~2g/L， 硫酸儀0. 01~Ig/L碳酸巧0. 1~2g/L，pH調(diào)至6. 5~7. 5，12rC，滅菌20min，制成種子 培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[0010] 分別配置山梨醇和甘露醇20g/100ml，115°C，滅菌20min，在種子培養(yǎng)過(guò)程中添加 至質(zhì)量濃度15~45g/L。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法，選用所述種子培養(yǎng)基對(duì)酬古龍酸 桿菌進(jìn)行種子培養(yǎng)。
[0012]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)方法將活化的酬古龍酸桿菌接種于所 述種子培養(yǎng)基中，在30°c、250r/min的條件下種子培養(yǎng)4她。
[0013]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2-酬-k古龍酸的方法，選用所述種 子培養(yǎng)基對(duì)酬古龍酸桿菌進(jìn)行種子培養(yǎng)，收集發(fā)酵產(chǎn)物。
[0014]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法將活化的酬古龍酸桿菌接種于所述種 子培養(yǎng)基中，在30°C、250r/min的條件下種子培養(yǎng)4她，收集發(fā)酵產(chǎn)物。
[0015]由于酬古龍酸桿菌單獨(dú)生長(zhǎng)較弱，尋找合適的培養(yǎng)基配方，促進(jìn)其生長(zhǎng)，對(duì)工業(yè)應(yīng) 用有很高價(jià)值。本發(fā)明比較該菌株在相同質(zhì)量濃度的葡萄糖、果糖、山梨醇、山梨糖、甘露 醇下對(duì)酬古龍酸桿菌生長(zhǎng)的作用，發(fā)現(xiàn)在山梨醇、甘露醇下，較山梨糖培養(yǎng)有1.6倍的生物 量，有菌種種子培養(yǎng)與工業(yè)發(fā)酵有重要意義。本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)/微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別 設(shè)及山梨醇、甘露醇增強(qiáng)菌株生長(zhǎng)與活性的應(yīng)用，并借助基因組對(duì)其代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，代 謝組對(duì)胞內(nèi)重要代謝物的變化差異進(jìn)行解析。證實(shí)酬古龍酸桿菌消耗山梨醇轉(zhuǎn)化為山梨 糖、2-酬基-k古龍酸的機(jī)制。
[0016]本發(fā)明建立了全新的酬古龍酸桿菌種子培養(yǎng)方式，獲得維生素C前體2-酬-k古 龍酸的新工藝流程。K.vulgare在果糖、山梨醇、甘露醇中培養(yǎng)5小時(shí)均已達(dá)到在山梨糖中 培養(yǎng)25小時(shí)的最高生物量（菌體密度達(dá)到3. 60)而在山梨醇、甘露醇中生長(zhǎng)于10小時(shí)后， 更要明顯好于在山梨糖中，并在25小時(shí)達(dá)到最高生物量（菌體密度達(dá)到5. 20、4. 90)，相比 在山梨糖中培養(yǎng)要分別提高40. 72%和62. 97%。由此可W想到，在相同的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng) 條件下，使用山梨醇/甘露醇的種子培養(yǎng)將比使用山梨糖的培養(yǎng)方式獲得的菌體量高1. 5 倍及W上，為后續(xù)的發(fā)酵提供更為優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵菌種。如果從獲得同樣的菌種量來(lái)考慮，在山 梨醇、甘露醇中培養(yǎng)5小時(shí)均已達(dá)到在山梨糖中培養(yǎng)25小時(shí)的最高生物量，大大縮短種子 培養(yǎng)的時(shí)間，至少10小時(shí)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0018] 圖1示酬古龍酸桿菌在不同碳源下的生長(zhǎng)及底物消耗情況；其中，A示酬古龍酸桿 菌在不同碳源下的生長(zhǎng)曲線巧示酬古龍酸桿菌在不同碳源下的底物消耗；…，…示k山梨 糖；示D-山梨醇；示D-甘露醇；.哪^示D-葡萄糖；示D-果糖；
[0019] 圖2示酬古龍酸桿菌單糖轉(zhuǎn)化相關(guān)內(nèi)酶；
[0020]圖3示對(duì)數(shù)期不同碳源培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酸性產(chǎn)物的含量；其中，圖3(A)示心山 梨糖；圖3做示2-酬基-L古龍酸；圖3似示2-酬基-D-葡糖酸；圖3 (D)示k葡糖酸； 圖3似示D-葡糖酸；圖3 (巧示葡糖二酸；圖3似示甘露酸；
[0021]圖4示不同碳源的標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置；其中，圖4(A)示甘露醇；圖4度）示山梨糖； 圖4(C)示山梨醇；圖4(D)示葡萄糖；圖4膽)示果糖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)酬古龍酸桿菌的培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文 內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí) 施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法 和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0023] (1)酬古龍酸桿菌種子培養(yǎng)方法：
[0024]玉米漿l-5g/l，酵母粉l-5g/l，牛肉膏l(xiāng)-5g/L蛋白腺l-20g/l，尿素 0. 2-2g/L， 憐酸二氨鐘0.l-2g/l，硫酸儀0. 01-lg/L，碳酸巧0.l-2g/L，抑調(diào)至6. 5-7. 5,121°C，滅菌 20min，制成種子培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基另加20g/L的瓊脂粉。
[002引分別配置山梨糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、果糖20g/100ml，115°C，滅菌20min，在 種子培養(yǎng)過(guò)程中添加至質(zhì)量濃度15~45g/L。
[0026] 將在固體平板上活化好的酬古龍酸桿菌接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行48小時(shí)種子培養(yǎng)， 30°C，250r/min，觀測(cè)不同碳源下的生長(zhǎng)比對(duì)。
[0027] 似產(chǎn)物檢測(cè)：
[0028] 菌濃度測(cè)定：使用75-6型紫外分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中菌體生長(zhǎng)曲線，波長(zhǎng)采 用 600nm，即 0D600。
[0029] 底物消耗情況測(cè)定：高效液相色譜檢測(cè)，采用AminexHPX-87H色譜柱，示差檢測(cè) 器。0. 5mM硫酸作流動(dòng)相，柱溫65°C，檢測(cè)器溫度50°C。
[0030] 對(duì)五種碳源配置20克/升的標(biāo)品進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)獲得，定量物質(zhì)的峰位置 即對(duì)應(yīng)保留時(shí)間。其中10. 295min的峰為山梨醇，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間9. 427min的峰為山梨糖， 對(duì)應(yīng)保留時(shí)間10. 162min的峰為甘露醇，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間9. 184min的峰為葡萄糖，對(duì)應(yīng)保留 時(shí)間9. 660min的峰為果糖。分別得到峰面積與質(zhì)量濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而， 檢測(cè)不同時(shí)段發(fā)酵液中底物的濃度，獲得隨時(shí)間的消耗曲線。
[0031] (3)代謝組學(xué)萃取方法與分析
[0032] 1.胞內(nèi)代謝物提取：取適量發(fā)酵液，置于40%冷甲醇溶液中（-40°C)，快速中止細(xì) 胞代謝反應(yīng)。600化pm，4°C離屯、lOmin。棄掉上清液，加水洗細(xì)胞兩次，再次離屯、，棄掉上清 液。加入預(yù)冷的水/甲醇（體積比1: 1，-40°C)混合液1血，并在液氮中反復(fù)凍融3次W提 取胞內(nèi)代謝物。200μL提取物中添加50μL0. 040mg/mL気標(biāo)記的班巧酸作為內(nèi)標(biāo)，真空干 燥。
[003引 2.衍生化：將樣品冷凍干燥后溶于50化20mg/血甲氧基胺鹽酸鹽/化晚溶 液中，40°C90min進(jìn)行朽化反應(yīng)；再添加80μΙN-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷）Ξ氣乙酷胺， 37°C30min進(jìn)行Ξ甲基硅烷化反應(yīng)，獲得經(jīng)衍生化的胞內(nèi)代謝物。
[0034] 3.代謝物的檢測(cè)：使用GC-TOF-MS測(cè)定，所用色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)具體色譜條 件為：1μL樣品按照1:10的分流比進(jìn)樣，經(jīng)DB-5MS毛細(xì)色譜柱分離；進(jìn)樣后柱溫箱程序 升溫，按照先70°C2min、再