專利名稱：一種烷基酚類藥物通用人工抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種烷基酚類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
烷基酚類化合物(Alkyl Phenol，APs)，屬于內(nèi)分泌干擾物質(zhì)中重要的一種，具有 明顯的環(huán)境雌激素效應(yīng)。該類化合物多為脂溶性有機化合物，化學(xué)穩(wěn)定性較強，一旦攝入就 不易降解排出，有生物累積性，危害性較大，即使微量也可對生物產(chǎn)生影響。同時其在環(huán)境 中分布也十分廣泛，并且含量較低。烷基酚類化合物Ah是重要的精細(xì)化工原料，在表面活 性劑、潤滑油添加劑、油溶性酚醛樹脂及絕緣材料、紡織印染、造紙助劑、農(nóng)藥乳化劑、工業(yè) 用洗滌劑、橡膠塑料的防老抗氧劑、油田及煉油廠化學(xué)品等領(lǐng)域具有廣泛用途。APs中最重 要的是壬基酚(Nonyl Phenol, NP)和辛基酚(Octyphenol，OP)，二者只在長碳鏈相差一個 甲基，它們同屬于聯(lián)合國UNEP制訂的持久性有毒化學(xué)污染物。NP和OP等APs內(nèi)分泌干擾 物主要為烷基酚聚環(huán)氧乙烷醚(Alkylphenolethoxylater，ΑΡΕ0)在環(huán)境降解過程中的中 間產(chǎn)物。一般隨著APEO的排放進入環(huán)境，并且在環(huán)境中分布比較廣泛。Ah類化合物可以 對生物體形成外因性雌性激素作用，其中又以O(shè)P為最強，NP次之，而其它APs類化合物則 依照親水端鏈從短到長，作用程度依次削減。Ah類化合物是促乳房癌細(xì)胞活性化與增殖現(xiàn) 象的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。同時烷基酚類化合物對細(xì)胞的DNA有明顯的損傷作用，并且DNA 的損傷程度與化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，苯酚環(huán)中增加其他基團，可使致突變活性增強，并且 隨著苯酚環(huán)中氯原子數(shù)的增加，致突變活性也增強；隨著苯酚對位碳原子數(shù)增多，其致突變 活性也增高等。因此，APs類物質(zhì)也逐步被列入強制性禁用范圍，一些國家紛紛制定法規(guī)限 制APs的生產(chǎn)和使用。歐盟第2003 / 53 / EC號指令規(guī)定紡織品中NP和NPEO含量均不 能高于0. 1%。這些措施成為我國紡織品出口歐盟面臨的又一大技術(shù)貿(mào)易壁壘，因此對APs 檢測方法的研究提上日程?，F(xiàn)今烷基酚主要的分析方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、 LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS等?，F(xiàn)有的儀器檢測法雖然有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點，但是 樣品前處理復(fù)雜，所需的儀器昂貴，成本高，檢測時間長，因此有必要研究特異性強，靈敏度 高同時價格低廉，能快速簡便的免疫檢測技術(shù)。這就需要合成能產(chǎn)生簇特異性抗體的免疫 原。目前為止，國內(nèi)外尚沒有針對烷基酚結(jié)構(gòu)多殘留的免疫檢測方法的報道，為此設(shè)計合成 了以烷基酚的降解產(chǎn)物壬基酚NP為半抗原的用于烷基酚類結(jié)構(gòu)檢測的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種烷基酚類藥物通用人工抗原的合成方法。所制備的產(chǎn)品 用于烷基酚類結(jié)構(gòu)的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了更好的必需的人工抗原。本發(fā)明的技術(shù)方案一種烷基酚類藥物通用人工抗原的合成方法，以壬基酚為半 抗原，用活性酯法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。 步驟為(1)人工抗原的合成壬基酚、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、碳二亞胺、牛血清白蛋白控制 摩爾比為80 120 136 1的比例反應(yīng)，壬基酚溶液溶于含二甲基吡啶的戊二酸酐的無 水乙醇和吡啶混合溶液中，65°C攪拌反應(yīng)24h后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提純，再加N，N- 二甲基甲 酰胺DMF溶劑溶解后，加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和碳二亞胺攪拌反應(yīng)6h，為A液；牛血 清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，為B液；將A液逐滴加入B液中，室溫下攪拌反應(yīng)3h，離心 取上清液得壬基酚-BSA混合液，即為烷基酚類藥物通用人工抗原混合液；
透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；
將人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS溶液透析2次，再用每次 2L的去離子水透析2次，共透析3天；最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，得壬基 酚-BSA偶聯(lián)物，即是烷基酚類藥物通用人工抗原；
(2)人工抗原的鑒定壬基酚-BSA偶聯(lián)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其偶聯(lián)比。偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖 然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的 原理建立起來的。凝膠電泳法是依據(jù)合成的人工抗原的分子量來鑒定合成的人工抗原。 SDS-聚丙烯酰胺電泳利用遷移率只與分子量有關(guān)，而與所帶電荷、分子形狀無關(guān)，可以利用 SDS-聚丙烯酰胺電泳來確定人工抗原的分子量從而確定偶聯(lián)比。本發(fā)明采用10%的分離 膠，5%的壓縮膠，對牛血清白蛋白BSA、偶聯(lián)物NP-BSA進行電泳鑒定。利用FR980生物電泳 凝膠成像系統(tǒng)軟件得出偶聯(lián)比r ^ 23。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?min，每個濃 度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清白蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原 溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定壬基酚-牛血清白蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上 得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明計算得抗原溶液的蛋白濃度為10. 96mg · mL—1。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了烷基酚類藥物通用人工抗原壬基酚-BSA 偶聯(lián)物，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的 途徑，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。


圖1 壬基酚NP-BSA等的電泳圖。圖2利用間接ELISA方法測得的壬基酚-BSA偶聯(lián)物的抑制曲線。
具體實施例方式實施例1
(1)人工抗原的制備
取 220.;35mg (Immol )壬基酚 NP 和 1. 140g (IOmmol )戊二酸酐，以及 22. 4mg (0.2 mmol ) 二甲基吡啶DMAP到圓底燒瓶里，然后再加入9mL無水乙醇和ImL無水吡啶，最后放 入65°C水浴反應(yīng)Mh。產(chǎn)物溶液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提純，再加入DMF溶液溶解以備下一步反 應(yīng)。取0. 5mL含有IOmg (0. 04538 mmol )壬基酚NP衍生物的N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液到棕色小瓶中，再加入14. 77mg (0. 06807 mmol )N_羥基硫代琥珀酰亞胺Sulf-NHS和 14. 78mg (0.07715 mmol )碳化二亞胺 EDC，室溫反應(yīng) 6h，為 A 液。將 37. 55mg (0. 56725 umol )牛血清白蛋白BSA溶解到0.01M、pH7. 4的磷酸鹽PBS緩沖液中，為B液。然后將 A液緩慢滴加到B液中，室溫反應(yīng)3h，離心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min,保存在4°C去離子水中備用。將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0. OlM的磷酸鹽PBS溶液和2X2L 的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原壬基 酚NP-牛血清蛋白。(2)壬基酚人工抗原的鑒定
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然測定 方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立 起來的.凝膠電泳法是依據(jù)合成的人工抗原的分子量來鑒定合成的人工抗原。SDS-聚丙烯 酰胺電泳利用遷移率只與分子量有關(guān)，而與所帶電荷、分子形狀無關(guān)，可以利用SDS-聚丙 烯酰胺電泳來確定人工抗原的分子量從而確定偶聯(lián)比。本實驗采用10%的分離膠，5%的壓 縮膠，對牛血清白蛋白BSA、偶聯(lián)物NP-BSA進行電泳鑒定。利用FR980生物電泳凝膠成像系 統(tǒng)軟件得出偶聯(lián)比r ^ 23。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?min，每個濃 度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶 液按一定比例稀釋，在595nm處測定壬基酚-牛血清蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上得到 抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白濃度為10. 96mg · mL—1。試驗結(jié)果表明我們制得的壬基酚-牛血清白蛋白偶聯(lián)物產(chǎn)生了針對烷基酚類藥 物是非常好的抗體，相關(guān)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1和圖2。表1不同兔子血清的抗體效價
免疫原血清編碼效價工作濃度包被原濃度抗血清稀釋濃度1號1號兔子抗血清180001:3000 1:80001號2號兔子抗血清220001:4000 1:8000
權(quán)利要求
1. 一種烷基酚類藥物通用人工抗原的合成方法，其特征在于以壬基酚為半抗原，用活 性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯(lián)物的偶聯(lián) 比；步驟為(1)人工抗原的合成壬基酚、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、碳二亞胺、牛血清白蛋白控制 摩爾比為80 120 136 1的比例反應(yīng)，壬基酚溶液溶于含二甲基吡啶的戊二酸酐的無 水乙醇和吡啶混合溶液中，65°C攪拌反應(yīng)24h后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提純，再加N，N- 二甲基甲 酰胺DMF溶劑溶解后，加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和碳二亞胺攪拌反應(yīng)6h，為A液；牛血 清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，為B液；將A液逐滴加入B液中，室溫下攪拌反應(yīng)池，離心 取上清液得壬基酚-BSA混合液，即為烷基酚類藥物通用人工抗原混合液；透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS溶液透析2次，再用每次 2L的去離子水透析2次，共透析3天；最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，得壬基 酚-BSA偶聯(lián)物，即是烷基酚類藥物通用人工抗原；(2)人工抗原的鑒定壬基酚-BSA偶聯(lián)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其偶聯(lián)比。
全文摘要
一種烷基酚類藥物的通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以壬基酚NP為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，制得壬基酚-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，即為烷基酚類藥物通用人工抗原；用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了烷基酚類藥物的通用人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。
文檔編號G01N33/53GK102120767SQ201010604420
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉麗強, 宋珊珊, 李灼坤, 王利兵, 胥傳來, 邢常瑞 申請人:江南大學(xué)