專利名稱：檢測(cè)氟化物或氟化氫的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢出和/或測(cè)定樣品中氟化物(F-)或氟化氫(HF)濃度的方法，以及實(shí)施這一方法的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明使得對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行有效且靈敏的檢測(cè)成為可能。本發(fā)明所基于的方法是全新的并且易于實(shí)施。
背景技術(shù)：
氟化氫是一種無(wú)機(jī)強(qiáng)酸，無(wú)色，極易溶于水，溶于水后形成氫氟酸。HF是一種氣體，被廣泛用于工業(yè)中，特別是用于生產(chǎn)聚合物、制冷劑和滅火劑，可用于精制鋁，制作核燃料和用于制造電子元件。此外，在煤、家庭或工業(yè)廢棄物以及塑料的燃燒過(guò)程中也釋放出氟化氫。
每106升空氣中HF含量大于3×10-2升(30ppm)即有毒。HF是一種強(qiáng)刺激劑，與皮膚/粘膜接觸后可造成灼傷，同時(shí)造成上呼吸道和下呼吸道發(fā)炎。此外，體內(nèi)吸入HF可導(dǎo)致新陳代謝紊亂。
另外，HF對(duì)于多種材料如鐵、青銅和玻璃具有強(qiáng)腐蝕性。
因此，為保護(hù)人類、環(huán)境以及工業(yè)生產(chǎn)裝置，需要建立監(jiān)測(cè)HF濃度的方法，特別是需要對(duì)工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室廢水以及這些設(shè)施附近的大氣進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便當(dāng)HF濃度超過(guò)危險(xiǎn)濃度時(shí)，能夠采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行處理。
許多國(guó)家已經(jīng)建立了大氣HF可接受濃度的標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每106升空氣中HF含量在5×10-5至5×10-41之間(0.05至0.5ppm)。
在以下的發(fā)明描述中，方括號(hào)[]中的數(shù)字與發(fā)明書末尾所附參考文獻(xiàn)相對(duì)應(yīng)。
目前，已經(jīng)發(fā)展并公開了多種測(cè)定HF或氟離子的方法。概括而言，這些方法基于化學(xué)、電化學(xué)、光譜和光學(xué)檢測(cè)法。大量可用于HF檢出和測(cè)定的裝置是可以購(gòu)買到的。
本發(fā)明所附參考文獻(xiàn)[1]中描述了多種用于檢出和測(cè)定樣品中HF的量的電化學(xué)、光譜和色譜方法。
在OSHA網(wǎng)站(參考文獻(xiàn)[2])中描述了一種代號(hào)為ID-110的方法，其中采用選擇性電極進(jìn)行檢測(cè)。雖然該方法的靈敏度為1.2×10-2升HF/106升空氣(12ppb)，但是該方法為實(shí)驗(yàn)室方法，難以用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。就有關(guān)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法而言，其方法靈敏度要低得多，量級(jí)為0.2升HF/106升空氣(200ppb)。
另一種方法使用了一種基于碳化硅基質(zhì)的檢測(cè)器(金屬-絕緣體-半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)MIS)。例如，這種方法在參考文獻(xiàn)[3]中有描述。不同制造商提出了多種用于HF檢測(cè)的電子檢測(cè)儀器。其實(shí)例有Bionics儀器公司生產(chǎn)的OEM氟傳感器(注冊(cè)商標(biāo))，在其網(wǎng)站中有描述(參考文獻(xiàn)[4])，或NORSK ELEKTRO OPTIKK A/S公司生產(chǎn)的LaserGas(注冊(cè)商標(biāo))。
這些儀器的檢測(cè)限表示為百萬(wàn)分之(ppm)或十億分之(ppb)(對(duì)于氣體樣品)或每毫升納克或微克(ng/ml或μg/ml，對(duì)于含水介質(zhì))。概括而言，對(duì)于最好的儀器，檢測(cè)限的量級(jí)為10-4升HF/106升空氣(0.1ppm)，對(duì)溶液而言，檢測(cè)限的量級(jí)為1至1000ng HF/ml。
不幸的是，這些方法和儀器占地大，難以移動(dòng)，有時(shí)難以實(shí)施并且通常價(jià)格昂貴。
一種“理想的檢測(cè)HF的裝置”應(yīng)該具備以下特點(diǎn)-靈敏度檢測(cè)限至少為10-4升HF/106升空氣(0.1ppm)；-成本成本不應(yīng)過(guò)高，使得在需要時(shí)可以容易地增加檢測(cè)器的數(shù)目；-實(shí)用性很多已發(fā)表的技術(shù)在市場(chǎng)上得不到，特別是當(dāng)方法難以實(shí)施時(shí)；-機(jī)動(dòng)性為適于在不同地點(diǎn)使用，應(yīng)該易于移動(dòng)；-實(shí)施的快速性，以及利用測(cè)定結(jié)果的快速性。
顯然，現(xiàn)有技術(shù)中的方法或裝置無(wú)法滿足上述所有要求。
因此，對(duì)于盡可能結(jié)合上述“理想檢測(cè)方法”的特點(diǎn)的新型檢測(cè)技術(shù)存在現(xiàn)實(shí)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
具體而言，本發(fā)明所要實(shí)現(xiàn)的目的是提供一種檢測(cè)HF的方法和試劑盒，該方法和試劑盒結(jié)合了上述所有特點(diǎn)，而且不受上述的現(xiàn)有方法和裝置的缺點(diǎn)的困擾。
該目的通過(guò)一種檢出和/或測(cè)定樣品中氟化物(F-)或氟化氫(HF)濃度的方法得以達(dá)成，該方法包括以下步驟-在水溶液中將所述樣品與甲硅烷基化的有機(jī)化合物接觸，以此得到測(cè)量溶液，所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物在氫氟酸或氟化物的存在時(shí)發(fā)生去甲硅烷基化，使得可以分別檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物和去甲硅烷基化的有機(jī)化合物；-在所述測(cè)量溶液中檢出和/或測(cè)定去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失，如果樣品中存在氟化物或氟化氫，則發(fā)生去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失。
在以下的描述中，氟化物(F-)、氟化氫(HF)或氫氟酸用術(shù)語(yǔ)“氟”或“氟及其衍生物”指代。氟化物被理解為氟的鹽。
氟是一種親核性極強(qiáng)的原子，因此，它可以參與親核取代反應(yīng)。更具體而言，它可以按以下化學(xué)反應(yīng)方程式特異性地進(jìn)攻硅氧鍵(Si-O) 甲硅烷基化的化合物R4氟化氫 甲硅烷基 化合物R4(化合物R4為去甲硅烷基化的)HF和Si-O鍵反應(yīng)(去甲硅烷基化)的一般性機(jī)制在這一化學(xué)反應(yīng)方程式中，R1、R2和R3為Si的取代基并與后者構(gòu)成本發(fā)明有機(jī)化合物R4的甲硅烷基。
R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自C1至C6烷基。例如，R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基和丁基。
在這一化學(xué)反應(yīng)方程式中，-R4代表實(shí)施本發(fā)明方法過(guò)程中被甲硅烷基化(方程式左邊)或去甲硅烷基化(方程式右邊)的有機(jī)化合物。為了能夠被甲硅烷基化，該化合物至少含有一個(gè)可以被甲硅烷基化的羥基。優(yōu)選地，該化合物為一種化合物，以便在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)化合物本身有助于被檢測(cè)。一般而言，尤其是考慮到溶解度因素，以及氟檢出和/或測(cè)定結(jié)果的靈敏度和重現(xiàn)性，化合物的分子量為250至200000g/mol，例如，分子量為250至1500g/mol。該化合物是一種羥基化合物，可選自如雌二醇，肽，如含有3至50氨基酸殘基的肽高香草酸，兩性霉素，甾體，細(xì)胞因子和花生四烯酸或這些化合物的衍生物。
例如，可用于本發(fā)明的肽在參考文獻(xiàn)[5]中有描述；例如，可用于本發(fā)明的高香草酸及其衍生物在參考文獻(xiàn)[6]和[7]中有描述例如，可用于本發(fā)明的兩性霉素在參考文獻(xiàn)[8]至[10]中有描述；例如，可用于本發(fā)明的甾體及甾體衍生物在參考文獻(xiàn)[11]至[17]中有描述；例如，可用于本發(fā)明的細(xì)胞因子及其衍生物在參考文獻(xiàn)[18]至[20]中有描述；例如，可用于本發(fā)明的花生四烯酸及其衍生物在參考文獻(xiàn)[21]至[24]中有描述。
重要的是甲硅烷基化的有機(jī)化合物和去甲硅烷基化的有機(jī)化合物可以被分別檢出和/或測(cè)定，使得有可能檢出和/或測(cè)定測(cè)量溶液中這些化合物中的一個(gè)化合物的消失，和/或另一個(gè)化合物的出現(xiàn)。因此，本發(fā)明的方法基于對(duì)甲硅烷基化的有機(jī)化合物或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的檢測(cè)，或同時(shí)分別檢測(cè)這兩個(gè)化合物。
在本發(fā)明中，可采用任何適用的試劑在所選有機(jī)化合物上連接甲硅烷基(甲硅烷基化)，只要甲硅烷基化的化合物在氟或其衍生物的簡(jiǎn)單作用下可以原封不動(dòng)地回復(fù)成去甲硅烷基化的化合物或有機(jī)化合物的原始形式即可?？捎玫募坠柰榛蚬倌軋F(tuán)如以上化學(xué)反應(yīng)方程式所述。
例如，為達(dá)到實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可用于對(duì)羥基化有機(jī)化合物進(jìn)行甲硅烷基化的試劑如下N，O-二(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(或BTSFA)、N-甲基-N-(叔丁基二甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(或MTBSTFA)、三甲基甲硅烷基(或TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(或t-BDMS)、N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(或BSA)、六甲基二硅氮烷(或HMDS)、N-甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(或MTSFA)、三甲基氯硅烷(或TMCS)、三甲基甲硅烷基咪唑(或TMSI)等。
例如，在參考文獻(xiàn)[25]至[30]中可以找到其他的可用于實(shí)施本發(fā)明方法的甲硅烷基化試劑及操作模式。
一般而言，這些試劑使用簡(jiǎn)便并且易得，可以將一個(gè)硅烷基(其中含有一個(gè)硅原子)轉(zhuǎn)移至所選化合物的羥基上。
為了解釋本發(fā)明發(fā)明者們?cè)诒景l(fā)明中已經(jīng)證明的另外一個(gè)事實(shí)，即所采用的硅烷基不同，則檢出和/或測(cè)定氟的靈敏度和選擇性也有所不同，應(yīng)該特別注意以下兩個(gè)化合物-BTSFA，在所選化合物的羥基上連接一個(gè)三甲基甲硅烷基(-Si(CH3)3)；-MTBSTFA，在所選化合物的羥基上連接一個(gè)二甲基叔丁基甲硅烷基(-Si(CH3)2C(CH3)3)。
BTSFA的優(yōu)點(diǎn)在于，轉(zhuǎn)移至羥基化合物上的硅烷基疏水性不是特別的強(qiáng)，因而使得甲硅烷基化的有機(jī)化合物具有相對(duì)較好的溶解性。但是，當(dāng)實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，HF對(duì)于所得甲硅烷基化的化合物轉(zhuǎn)化為去甲硅烷基化的化合物的反應(yīng)并不總能夠表現(xiàn)出特異性。甲硅烷基化的化合物也可以被樣品中存在的其他酸轉(zhuǎn)化成去甲硅烷基化的化合物。因此，當(dāng)不需要考慮氟檢測(cè)的特異性或者樣品中其他酸的濃度足夠低以至于不能干擾氟檢出或測(cè)定時(shí)，優(yōu)選使用這種試劑。
MTBSTFA向羥基化合物轉(zhuǎn)移一個(gè)疏水性更強(qiáng)的硅烷基，所得甲硅烷基化的化合物在水性介質(zhì)中的溶解度要比采用BTSFA制得的甲硅烷基化的化合物差。另一方面，同時(shí)也是特別出人意料的是，如實(shí)施例所證明的那樣，采用MTBSTFA進(jìn)行甲硅烷基化時(shí)，所得化合物對(duì)于HF的特異性要優(yōu)于其他受測(cè)試的酸。因此，當(dāng)要求考慮氟檢測(cè)的特異性時(shí)，如當(dāng)樣品中其他酸的含量顯著時(shí)，優(yōu)選采用這種試劑檢測(cè)樣品中的氟化氫。
因此，特別是通過(guò)使用這些試劑，本發(fā)明的發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氟進(jìn)攻Si-O鍵的特異性也依賴于連接在硅和氧原子上的基團(tuán)。因此，當(dāng)甲硅烷基化基團(tuán)選擇恰當(dāng)時(shí)，采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品中其他無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和鹽不干擾檢測(cè)。例如，當(dāng)采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用-Si(CH3)3時(shí)HF和HCl去甲硅烷基化的活性基本相同，當(dāng)采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用-Si(CH3)2C(CH3)3時(shí)HF去甲硅烷基化的活性高約1000倍(HF和HCl作比較)。
如上述化學(xué)反應(yīng)方程式所示，在氟或其衍生物的作用下，甲硅烷基化的有機(jī)化合物向去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化與樣品中HF的含量成正比。因此，本發(fā)明的方法可以對(duì)樣品中的氟或其衍生物一次且同時(shí)進(jìn)行檢出和測(cè)定。采用一個(gè)測(cè)量甲硅烷基化的有機(jī)化合物和未甲硅烷基化(去甲硅烷基化)的有機(jī)化合物之間的差異的測(cè)量方法，進(jìn)而對(duì)氟催化的去甲硅烷基化反應(yīng)進(jìn)行檢出/測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氟化物和/或氟化氫的檢測(cè)，這正是本發(fā)明的基本特點(diǎn)和發(fā)明實(shí)質(zhì)。
可以將樣品和甲硅烷基化的有機(jī)化合物混合至水溶液中完成發(fā)生接觸的步驟。混合可以是簡(jiǎn)單地將樣品和氟添加至溶液中，或者通過(guò)主動(dòng)性混合，如利用機(jī)械或磁力攪拌器、超聲等手段將樣品和氟混合至溶液中，其目的在于促進(jìn)樣品中可能存在的氟和甲硅烷基化的有機(jī)化合物之間的相互作用，以確保相互發(fā)生反應(yīng)。
樣品可以是液體、固體或氣體樣品。當(dāng)樣品為非液體時(shí)，使樣品和本發(fā)明方法中甲硅烷基化的有機(jī)化合物在水溶液中進(jìn)行接觸的步驟包括將樣品溶解在水溶液中，例如，當(dāng)樣品為氣體時(shí)通過(guò)鼓泡的方法，當(dāng)樣品為固體時(shí)通過(guò)混合或攪拌溶解的方法，溶解的目的在于氣體或固體中的氟進(jìn)入到用于接觸的水溶液中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，溶解的方法是眾所周知的。
本發(fā)明的發(fā)明者們已經(jīng)證明向所述用于接觸的水溶液中添加與水混溶的有機(jī)溶劑可以顯著提高本發(fā)明方法檢出和/或測(cè)定氟的靈敏度。例如，有機(jī)溶劑可選自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、乙醇或甲醇或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的等效有機(jī)溶劑。因此，當(dāng)使用這些溶劑時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明者們測(cè)得靈敏度的增加幅度為100倍，甚至為500倍。例如，當(dāng)使用DMSO時(shí)，檢測(cè)靈敏度被擴(kuò)展至0.001μg/ml。
有機(jī)溶劑可能具有幾種不同的作用提高甲硅烷基化的有機(jī)化合物的溶解度，促進(jìn)去甲硅烷基化或降低檢出中的干擾(特別是在免疫檢測(cè)中所涉及的)。無(wú)論如何，這些作用中的任何一個(gè)均不足以解釋在有機(jī)溶劑存在下檢出靈敏度驚人地顯著增加。以用于接觸的水溶液的體積計(jì)，有機(jī)溶劑的含量為1至99％，優(yōu)選為50至95％，其余為水。
優(yōu)選地，溶劑的來(lái)源為回收甲硅烷基化的有機(jī)化合物的溶劑，即有機(jī)化合物被甲硅烷基化后對(duì)其進(jìn)行回收的溶劑。此后，通過(guò)含氟的水溶液和含甲硅烷基化的有機(jī)化合物的有機(jī)溶液的混合完成接觸步驟?；蛘?，有機(jī)溶劑可分別加到用于接觸的溶液中。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何方法檢測(cè)消失的甲硅烷基化的有機(jī)化合物或出現(xiàn)的去甲硅烷基化的有機(jī)化合物，這些方法能夠分別證明這些化合物中的一個(gè)或另一個(gè)的存在。例如，這些方法可以是一種氣相色譜檢出和/或測(cè)定方法，或免疫學(xué)檢出和/或測(cè)定方法。
為了進(jìn)行檢測(cè)，按照通常的做法，首先利用本發(fā)明方法和已知量的氫氟酸或氟，或利用已知量的甲硅烷基化或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物測(cè)定一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)簡(jiǎn)單的外推，可以利用這一系列標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定樣品中氟、氟化氫或氫氟酸的含量。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，利用氣相色譜進(jìn)行檢出和/或測(cè)定。這是因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)可以分別檢出和/或測(cè)定本發(fā)明有機(jī)化合物的甲硅烷基化形式或去甲硅烷基化形式，從而檢出和/或測(cè)定可能存在的氟?？墒褂玫纳V技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，在參考文獻(xiàn)[31]至[33]中描述的技術(shù)。
可用于該第一個(gè)實(shí)施方案中的有機(jī)化合物可以是上述的羥基化有機(jī)化合物。甲硅烷基化試劑及技術(shù)也可以是上述的試劑及技術(shù)。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地，利用免疫檢測(cè)法檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)，即利用甲硅烷基化的有機(jī)化合物或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的抗體進(jìn)行檢出和/或測(cè)定?，F(xiàn)有技術(shù)中未曾報(bào)道過(guò)這種方法。此外，與現(xiàn)有技術(shù)相比，這一實(shí)施方案檢測(cè)靈敏度更高。
按照通常的做法，抗體是蛋白，它能夠以非常高的特異性識(shí)別并結(jié)合被稱為抗原的結(jié)構(gòu)，形成可檢測(cè)的抗體/抗原復(fù)合物。但是，由于HF分子非常小，不可能生成其抗體。由于不能夠生成直接針對(duì)HF的抗體，本發(fā)明的發(fā)明者們采取了一種創(chuàng)新性的方法，該方法基于上述氟的化學(xué)性質(zhì)并且利用了特殊的甲硅烷基化的有機(jī)化合物，這些甲硅烷基化的有機(jī)化合物的特點(diǎn)在于注射入動(dòng)物體內(nèi)可以生成抗體。
可用于該第二個(gè)實(shí)施方案的有機(jī)化合物為含有一個(gè)或多個(gè)羥基的有機(jī)化合物，其中羥基能夠與本發(fā)明硅烷基連接，注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)以后，這些化合物可誘導(dǎo)出甲硅烷基化的有機(jī)化合物或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物抗體的特異性生成。這些有機(jī)化合物的分子量一般在250至200000g/mol之間，例如，分子量在250至1500g/mol之間。例如，有機(jī)化合物可選自上述羥基化有機(jī)化合物，例如，選自雌二醇，肽，例如含3至50個(gè)氨基酸殘基的肽，如參考文獻(xiàn)[5]所述的四肽—乙酰化Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP)，高香草酸，兩性霉素，甾體，細(xì)胞因子和花生四烯酸或這些化合物的衍生物。例如，有機(jī)化合物可以是參考文獻(xiàn)[5]至[24]中所述的化合物。
作為一個(gè)示例性實(shí)施例，有可能使用雌二醇或其衍生物。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雌二醇”例如指1，3，5-雌三烯-3，17μ或17μ-二醇或其衍生物，或其他等價(jià)化合物，只要注射入動(dòng)物如小鼠體內(nèi)能夠形成抗體，并且能夠被本發(fā)明方法甲硅烷基化即可。
以下描述本發(fā)明的發(fā)明者們已經(jīng)得到的，而且可以被用于本發(fā)明的甲硅烷基化雌二醇的實(shí)例。如下所述，雌二醇含有-OH基，通過(guò)Si-O鍵可以連接硅烷基(例如，與附

圖1所示的原始雌二醇(Es)作比較)。
有關(guān)本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案中的有機(jī)化合物的甲硅烷基化試劑，可以是上述試劑，如BTSFA或MTBSTFA。
可用于本發(fā)明這一實(shí)施方案中的抗體具有區(qū)分甲硅烷基化的有機(jī)化合物和未甲硅烷基化的有機(jī)化合物的特點(diǎn)。這些抗體可以是單克隆抗體?？梢岳弥苽溥@種類型抗體的常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行制備，例如，對(duì)小鼠注射甲硅烷基化的有機(jī)化合物或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物以獲得僅對(duì)這兩種化合物中的一個(gè)顯示特異性的小鼠抗體。為了實(shí)施本發(fā)明方法，可以對(duì)不同批次的抗體進(jìn)行試驗(yàn)，從中篩選出僅對(duì)兩種化合物中的一個(gè)(甲硅烷基化或未甲硅烷基化)顯示特異性的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉抗體制備的技術(shù)。
可用于本發(fā)明的甲硅烷基化雌二醇的實(shí)例例如，參考文獻(xiàn)[34]至[38]中描述了適于制備可用于本發(fā)明的抗體的方法。
例如，參考文獻(xiàn)[5]至[24]以及[39]至[42]中還描述了可用于本發(fā)明的抗體，其中有機(jī)化合物為選自上述化合物的甲硅烷基化的化合物。
在附圖1所示的實(shí)施例中，當(dāng)雌二醇被甲硅烷基化之后(以下也稱為“經(jīng)修飾的雌二醇”)，所篩選出的用于免疫檢測(cè)的雌二醇抗體不再識(shí)別雌二醇或識(shí)別力顯著降低(即，識(shí)別力的差異大到足以檢測(cè))。氟對(duì)經(jīng)修飾的雌二醇的作用是進(jìn)攻Si-O鍵(去甲硅烷基化反應(yīng))，從而使原始雌二醇重新出現(xiàn)，此后原始雌二醇可以被它的特異性抗體(以下稱為“第一抗體”)所識(shí)別。
任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于檢測(cè)抗原/抗體識(shí)別的方法均可用于本發(fā)明，以用于檢測(cè)抗體對(duì)去甲硅烷基化的有機(jī)化合物(“原始有機(jī)化合物”)的識(shí)別或者抗體對(duì)甲硅烷基化的有機(jī)化合物的識(shí)別。這就是為什么在本發(fā)明中采用術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)第一抗體和未甲硅烷基化的有機(jī)化合物間相互作用的方法”的原因。利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的操作條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，參考文獻(xiàn)[5]至[24]以及[39]至[42]中描述了適用的試驗(yàn)規(guī)程、試劑、緩沖液和操作條件。
可以采用“競(jìng)爭(zhēng)”型或“非競(jìng)爭(zhēng)”型免疫試驗(yàn)，如常用的免疫學(xué)檢出方法和/或免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行該實(shí)施方案的檢測(cè)。
作為本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案的第一種變體，例如，檢測(cè)手段可以是一種被稱為“示蹤劑”的標(biāo)記分子，對(duì)于第一抗體而言，它與甲硅烷基化或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物，如甲硅烷基化或未甲硅烷基化雌二醇構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)。這種標(biāo)記分子可以是用于檢測(cè)的酶，如乙酰膽堿酯酶；熒光標(biāo)記；發(fā)光標(biāo)記；或放射性同位素。
此時(shí)甲硅烷基化或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物的免疫檢測(cè)(或免疫學(xué)檢測(cè))被稱為“競(jìng)爭(zhēng)性”檢測(cè)這種方法利用存在于標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中針對(duì)甲硅烷基化或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物如甲硅烷基化或未甲硅烷基化雌二醇的抗體，以及一種與本發(fā)明化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的示蹤劑，如雌二醇，其上攜帶有信號(hào)(標(biāo)記)，如酶、熒光、發(fā)光、放射性信號(hào)。在上述雌二醇的實(shí)例中，例如，可以將雌二醇和一種酶如乙酰膽堿酯酶偶聯(lián)構(gòu)成示蹤劑。
附圖2或3圖示了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的“競(jìng)爭(zhēng)性”檢測(cè)。在這些附圖中所采用的有機(jī)化合物為雌二醇。標(biāo)記分子或示蹤劑用符號(hào)“T”表示，未甲硅烷基化(未修飾)雌二醇用符號(hào)“Es”表示，甲硅烷基化(修飾)雌二醇用符號(hào)“Es-M”表示。例如，第一抗體為小鼠抗體(sAb)。附圖2中顯示抗體(sAb)不能識(shí)別經(jīng)修飾的雌二醇(這種不能識(shí)別用叉號(hào)標(biāo)記)，當(dāng)HF存在時(shí)，經(jīng)修飾的雌二醇(Es-M)轉(zhuǎn)化成能夠被第一抗體(sAb)識(shí)別的原始雌二醇(Es)。此后原始雌二醇(Es)進(jìn)入與示蹤劑(T)(標(biāo)記的雌二醇)的競(jìng)爭(zhēng)。因此可以檢測(cè)HF的存在。在這種方法中，結(jié)合抗體的示蹤劑的數(shù)量與樣品中存在的雌二醇的數(shù)量呈反比。
在這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法中，檢測(cè)第一抗體和未甲硅烷基化的有機(jī)化合物間相互作用的方法(或檢測(cè)第一抗體和甲硅烷基化的有機(jī)化合物間相互作用的方法)可以包含第二種抗體(gAb)。例如，第二抗體(gAb)可以是一種山羊抗體(gAb)或兔抗體，它是上述小鼠抗體(sAb)(第一抗體)的抗體。附圖2圖示了使用第二抗體的檢測(cè)。第二抗體(gAb)可以被結(jié)合至容器(R)，如微孔板的底部。
因此，在這個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)包含了待測(cè)示蹤劑和雌二醇針對(duì)有限數(shù)量的抗體分子間的競(jìng)爭(zhēng)。反應(yīng)結(jié)束后，在除去未與抗體結(jié)合的示蹤劑以后，就可以對(duì)結(jié)合抗體的示蹤劑的信息進(jìn)行測(cè)定了。
當(dāng)示蹤劑包含一種酶如乙酰膽堿酯酶(圖2中用白色方塊表示)時(shí)，檢測(cè)手段還可以包括一種酶指示劑。在上述采用乙酰膽堿酯酶的實(shí)施例中，酶指示劑可包含一種乙酰膽堿和二硫代硝基氟苯(dithionitrofluorobenzene)的混合物。這種指示劑轉(zhuǎn)化成一種黃色物質(zhì)，可以用裸眼進(jìn)行觀測(cè)或利用光度計(jì)在414nm處進(jìn)行定量檢測(cè)。事實(shí)上，為了實(shí)施本發(fā)明的方法，采用這種指示劑是為了進(jìn)行Ellman比色檢出和測(cè)定。例如，這種方法在參考文獻(xiàn)[43]中有描述。
在本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案的第二種變體中，本發(fā)明檢出和/或測(cè)定氟的方法采用了“非競(jìng)爭(zhēng)性”的免疫檢測(cè)法。與競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)法相比，非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)法的困難在于所選有機(jī)化合物應(yīng)具有兩種化學(xué)性質(zhì)能夠偶聯(lián)至固相上以及能夠被甲硅烷基化。此外，在偶聯(lián)至固相上以后，有機(jī)化合物應(yīng)當(dāng)能夠如液相反應(yīng)一樣進(jìn)行去甲硅烷基化。這種變體可應(yīng)用于上述羥基化有機(jī)化合物。例如，可應(yīng)用于上述雌二醇衍生物，如雌二醇-3-羧甲基醚，或肽，如上述的AcSDKP。
在這種變體中，甲硅烷基化的化合物被偶聯(lián)至一種固相，例如一種載體，如現(xiàn)行用于實(shí)驗(yàn)室的微孔板之上。樣品可以和固定于微孔板之上的甲硅烷基化的化合物接觸，并且可以原位進(jìn)行檢出和/或測(cè)定。
可以采用適當(dāng)?shù)?、本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于將上述甲硅烷基化的有機(jī)化合物連接至載體之上同時(shí)保持甲硅烷基化的化合物對(duì)于氟離子反應(yīng)活性的方法，將甲硅烷基化的化合物固定化或偶聯(lián)至載體之上。所有這一切均有賴于載體和本發(fā)明所選用的甲硅烷基化的有機(jī)化合物的化學(xué)性質(zhì)。例如，可以通過(guò)共價(jià)鍵實(shí)施連接。載體可以是官能化的載體，這種載體中的化學(xué)基團(tuán)有助于接枝甲硅烷基化的有機(jī)化合物的連接。例如，載體可以是一種含有氨基的板，如一種Nunc-NH2板，或者當(dāng)所選甲硅烷基化的有機(jī)化合物是一種上述的雌二醇衍生物，如雌二醇-3-羧甲基醚，或肽，如上述的AcSDKP時(shí)，載體為一種用聚賴氨酸活化的板。
在與可能存在于樣品中的氟離子反應(yīng)后，連接于載體之上的甲硅烷基化的化合物被轉(zhuǎn)化成一種未甲硅烷基化的化合物。然后采用免疫檢測(cè)法，如在特異性識(shí)別未甲硅烷基化的化合物的第一抗體存在下進(jìn)行檢出和/或測(cè)定。
可以采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，如通過(guò)對(duì)第一抗體作標(biāo)記證明第一抗體對(duì)未甲硅烷基化的化合物的識(shí)別，同時(shí)也可以采用可識(shí)別第一抗體并且?guī)в袠?biāo)記的第二抗體(此時(shí)第二抗體為一種示蹤劑)證明這種識(shí)別。標(biāo)記可以是任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的，例如酶標(biāo)記。例如，第二抗體可以是一種山羊抗體或兔抗體(gAb)，它是上述鼠抗體(sAb)(第一抗體)的抗體。
圖18圖示了一種“非競(jìng)爭(zhēng)性”測(cè)定的方法。該附圖中所采用的有機(jī)化合物為雌二醇羧甲基醚(EstCME)。所采用的第一種抗體是一種抗雌二醇抗體(如鼠抗體)，用符號(hào)“sAb”表示(示蹤劑)。未甲硅烷基化(未修飾)雌二醇用符號(hào)“Es”表示，甲硅烷基化(修飾)雌二醇用符號(hào)“Es-M”表示。加入對(duì)抗上述鼠抗體(sAb)的第二種山羊抗體或兔抗體(gAb)，例如，加到微孔板(R)的表面上。gAb抗體連有標(biāo)記，如一種酶，以構(gòu)成示蹤劑“T”。該附圖顯示抗體(sAb)不能識(shí)別經(jīng)修飾的雌二醇(Es-M)(這種不能識(shí)別用叉號(hào)標(biāo)記)，然而當(dāng)HF存在時(shí)，Es-M轉(zhuǎn)化成能夠被第一抗體(sAb)識(shí)別的原始雌二醇(Es)。因此可以檢測(cè)HF的存在。結(jié)合抗體(sAb)的示蹤劑(gAb+標(biāo)記)的數(shù)量與樣品中存在的去甲硅烷基化雌二醇的數(shù)量呈正比。
本發(fā)明的發(fā)明者們已經(jīng)確定了適于實(shí)施本發(fā)明方法的各種實(shí)施方案的操作條件。如果有必要，當(dāng)然可以根據(jù)所采取的其他的硅烷基、甲硅烷基化的有機(jī)化合物、或檢測(cè)手段對(duì)于這些操作條件作調(diào)整或改進(jìn)。這些操作條件特別適用于本發(fā)明的第二種實(shí)施方案。
因此，優(yōu)選地，本發(fā)明方法中的接觸步驟在54至64℃間進(jìn)行。這是因?yàn)楦邷囟认录坠柰榛挠袡C(jī)化合物將發(fā)生自發(fā)的去甲硅烷基化反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以毫無(wú)困難地根據(jù)所選有機(jī)化合物和檢測(cè)手段調(diào)整實(shí)施本發(fā)明方法的試驗(yàn)溫度。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法中在pH為4.5至6.5，優(yōu)選為pH5.5時(shí)進(jìn)行接觸，例如使用50mM磷酸鹽緩沖液或任何適用的緩沖液。這是因?yàn)閜H值更偏酸性時(shí)甲硅烷基化的有機(jī)化合物將發(fā)生自發(fā)的去甲硅烷基化反應(yīng)。同樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以毫無(wú)困難地根據(jù)所選有機(jī)化合物和檢測(cè)方法調(diào)整實(shí)施本發(fā)明方法的pH值。
在本發(fā)明中，測(cè)試溶液中甲硅烷基化的有機(jī)化合物，如雌二醇或其他具有等價(jià)分子量的化合物的濃度可依據(jù)有機(jī)化合物的分子量和所采用的檢出和/或測(cè)定手段作調(diào)整。一般而言，實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，濃度可以為1至2000ng/ml，如2至500ng/ml。
本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，所述試劑盒包含以下試劑一種在氟或氫氟酸存在下發(fā)生去甲硅烷基化的甲硅烷基化的有機(jī)化合物；以及一種檢測(cè)水溶液中去甲硅烷基化的有機(jī)化合物出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物消失的手段。
在氟或氫氟酸存在下發(fā)生去甲硅烷基化的甲硅烷基化的有機(jī)化合物如上所述。
檢測(cè)水溶液中去甲硅烷基化的有機(jī)化合物出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物消失的手段依據(jù)實(shí)施本發(fā)明方法的檢出和/或測(cè)定方法而定?？梢圆捎蒙鲜龇椒?。因此，檢出和/或測(cè)定手段包含以下一個(gè)或多個(gè)單元有色的指示劑，如上所述的標(biāo)記，酶，如上所述的測(cè)定手段，用于檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化和/或未甲硅烷基化的有機(jī)化合物的抗體等。
例如，試劑盒可包含用于進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定所需的試劑和抗體，或者可包含用于進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定所需的試劑和抗體。試劑盒可包含一種或多種抗體，例如對(duì)抗未甲硅烷基化或甲硅烷基化的有機(jī)化合物或?qū)辜坠柰榛挠袡C(jī)化合物的鼠抗體。它可另外包含一種或多種對(duì)抗上述抗體的一種或多種抗體，如山羊或兔抗體。它也可以包含一種示蹤劑，用于證明已經(jīng)發(fā)生的免疫性反應(yīng)。
在本發(fā)明中，試劑盒還可包含一種用于接受試劑的載體，例如一種聚苯乙烯片，其上具有一個(gè)或多個(gè)孔，這些孔作為本發(fā)明方法中接觸步驟和/或檢出和/或測(cè)定步驟的容器。因此，測(cè)定和/或檢出可方便地在微孔板的孔中進(jìn)行。在這種載體上，如上述聚苯乙烯片上，孔可以涂布有抗體，如山羊或兔抗體，這些抗體是抗雌二醇鼠抗體的抗體。甲硅烷基化雌二醇也可以結(jié)合至孔的底部。
作為本發(fā)明的一項(xiàng)成果，本發(fā)明的發(fā)明者們成功地開發(fā)出了一種實(shí)用和快速檢驗(yàn)HF的方法，其中溶液中HF的濃度可以達(dá)到0.001μg/ml。
本發(fā)明方法的靈敏度使其可以面對(duì)任何工業(yè)應(yīng)用，特別是最為有用的大氣中氫氟酸測(cè)定的挑戰(zhàn)。在這種情況下，檢測(cè)的量級(jí)可以輕易地達(dá)到1×10-2升HF/106升空氣(10ppb)。因此，該方法的效能要優(yōu)于現(xiàn)有的檢測(cè)限在幾百個(gè)ppb水平的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)。
概括而言，依據(jù)樣品和所采用測(cè)定手段的特性，本發(fā)明能夠在約1/2至4小時(shí)內(nèi)得到一個(gè)測(cè)定結(jié)果。雖然所消耗的時(shí)間要比某些現(xiàn)有方法更長(zhǎng)，但本發(fā)明的方法要更為靈敏。
本發(fā)明的方法適用于任何含有氫氟酸或氟離子的樣品大氣樣品，食品、植物或生物介質(zhì)。在各個(gè)情況下，取樣和制備樣品的條件與其他任何測(cè)試氫氟酸或氟離子的方法相同。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其操作簡(jiǎn)單。這一方法與免疫檢測(cè)的特點(diǎn)相同如，采用一種現(xiàn)成的試劑，易于分發(fā)，結(jié)構(gòu)緊湊，易于運(yùn)輸和重新定位，操作時(shí)有可能不需要外加能量，可以通過(guò)裸眼進(jìn)行讀數(shù)或利用簡(jiǎn)易的便攜式光度計(jì)比色讀數(shù)。
通過(guò)閱讀以下描述性的，不起定界作用的，采用附圖作參照的發(fā)明描述能夠理解本發(fā)明的其他用途和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示雌二醇分子(Es)被其抗體(Ab)所識(shí)別的部分。雌二醇分子中被抗體識(shí)別部分的羥基結(jié)合硅原子后阻礙了抗體對(duì)分子的識(shí)別。
圖2為本發(fā)明方法第一實(shí)施方案檢測(cè)HF的總圖，其中檢測(cè)為競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。
圖3顯示競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)(圖左側(cè))和對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)的信號(hào)進(jìn)行測(cè)量(圖右側(cè))。S(％)表示結(jié)合抗體(Ab)的示蹤劑(T)所發(fā)射的信號(hào)；而[Es](M)代表原始雌二醇的摩爾濃度(mol/l)。
圖4顯示以下實(shí)施例2的免疫檢測(cè)中不同有機(jī)酸對(duì)于三甲基甲硅烷基雌二醇的去甲硅烷基化的作用效能，其中三甲基甲硅烷基雌二醇采用BTSFA制備(B/Bo為HF存在下的信號(hào)(B代表結(jié)合)和HF不存在時(shí)的信號(hào)(Bo代表不結(jié)合)間的比例)。[H+](M)表示圖中所示酸的摩爾濃度。
圖5顯示雌二醇去甲硅烷基化反應(yīng)條件的研究溫度，50mM磷酸鹽(P)緩沖液的pH值(B/Bo信號(hào)的測(cè)量如圖4)。
圖6顯示在采用50mM磷酸鹽(P)緩沖液、pH為5.5的條件下，不同酸對(duì)于甲硅烷基化雌二醇的去甲硅烷基化的作用效能，[H+](M)表示圖中所示酸的摩爾濃度。鹽酸、硝酸或硫酸的數(shù)據(jù)基本類似(B/Bo信號(hào)的測(cè)量如圖4)。
圖7顯示與其他親核性物質(zhì)及鹵素相比，本發(fā)明方法檢測(cè)HF的特異性，[P](M)表示圖中所示鹵素或親核性物質(zhì)的摩爾濃度(B/Bo信號(hào)的測(cè)量如圖4)。
圖8顯示在不同鹽的存在下，本發(fā)明方法檢測(cè)HF的特異性，[X+F-](M)表示圖中所示氟鹽的摩爾濃度(B/Bo信號(hào)的測(cè)量如圖4)。
圖9顯示對(duì)受氟污染的大氣樣品作檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明方法測(cè)定(d)的氟濃度[F](μmol/l)和理論濃度([F]th)間的相關(guān)性。
圖10至14圖示了非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)中有關(guān)特異性抗體對(duì)于未甲硅烷基化雌二醇識(shí)別的試驗(yàn)結(jié)果。其中圖10顯示不同雌二醇濃度(μg/ml)下，雌二醇羧甲醚(EstCME)與含有氨基的微孔板(氨基化Nunc板)偶聯(lián)所得的信號(hào)(S)(moD)。
圖11和12顯示不同聚賴氨酸濃度(μg/ml)下，雌二醇羧甲醚與聚賴氨酸(poly-Lys)活化的微孔板偶聯(lián)所得的信號(hào)(S)(moD)(測(cè)量414nm處的吸光度)。
圖13顯示采用MTSBTFA對(duì)雌二醇羧甲醚甲硅烷基化的試驗(yàn)在不同MTSBTFA的稀釋度(1/5；1/2；1/1)以及攝氏溫度(℃)下，以信號(hào)(S)(moD)的增加測(cè)量甲硅烷基化的效率。
圖14顯示雌二醇羧甲醚甲硅烷基化后所進(jìn)行的免疫檢測(cè)在HF存在或不存在下，測(cè)量信號(hào)(S)(moD)。圖中Bo指HF不存在下的信號(hào)(對(duì)照值)。
圖15顯示實(shí)施本發(fā)明方法所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中采用甲硅烷基化的四肽AcSDKP在414nm處測(cè)量信號(hào)。進(jìn)行兩個(gè)系列的試驗(yàn)一個(gè)系列采用被第一種甲硅烷基化試劑(MTSBTFA)甲硅烷基化的四肽，另一個(gè)系列采用被第二種甲硅烷基化試劑(BSTFA)甲硅烷基化的四肽。每個(gè)系列進(jìn)行三次試驗(yàn)22℃、37℃和70℃，每次試驗(yàn)于10、30和60分鐘進(jìn)行測(cè)量。
圖16顯示了本發(fā)明方法在不同去甲硅烷基化溫度下(T(℃))測(cè)量氟的效能在414nm處測(cè)量信號(hào)(S(moD))。甲硅烷基化的化合物為圖15所示用MTSBTFA制備的化合物。
圖17顯示實(shí)施本發(fā)明方法所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中甲硅烷基化的有機(jī)化合物為雌二醇的衍生物在不同氟濃度[F](μmol/ml)下，于414nm處測(cè)量信號(hào)(S(moD))。
圖18圖示出可用于本發(fā)明方法檢測(cè)步驟的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)的機(jī)理。
圖19顯示在二甲亞砜(DMSO)存在下本發(fā)明方法檢測(cè)氟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果B/Bo為HF存在下的信號(hào)和HF不存在時(shí)的信號(hào)之間的比例，而[F-](M)為氟離子的摩爾濃度。
具體實(shí)施例方式
以下描述本發(fā)明方法的不同方面雌二醇免疫檢測(cè)法的建立，甲硅烷基化修飾雌二醇的反應(yīng)條件試驗(yàn)，通過(guò)質(zhì)譜確定甲硅烷基化的有機(jī)化合物，甲硅烷基化的化合物與HF反應(yīng)的檢驗(yàn)，甲硅烷基化衍生物化學(xué)性質(zhì)的優(yōu)化，試劑濃度的優(yōu)化，檢測(cè)靈敏度的提高，檢測(cè)方法對(duì)于酸的特異性的優(yōu)化，檢測(cè)方法可應(yīng)用性的檢驗(yàn)。以下列出這些實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果。
采用含氫氟酸的大氣樣品(實(shí)驗(yàn)室模擬樣)和含氟離子的水樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
為確定本發(fā)明方法的效能，本發(fā)明的發(fā)明者們定義了靈敏度參數(shù)。與HF不存在時(shí)所得信號(hào)相比，靈敏度為產(chǎn)生具有顯著性差異的信號(hào)所需HF的數(shù)量。在本發(fā)明的方法中，存在于樣品中待檢測(cè)的原始(未甲硅烷基化)雌二醇的數(shù)量依賴于氟的數(shù)量，其中氟能夠?qū)⒉荒鼙粰z出的甲硅烷基化雌二醇轉(zhuǎn)化成能夠被檢出的未甲硅烷基化雌二醇。因此，在HF的檢測(cè)中，靈敏度被定義為在二甲基叔丁基甲硅烷基雌二醇存在下，能夠顯著降低抗體和酶示蹤劑結(jié)合的氟的需要量。
實(shí)施例1本發(fā)明方法在競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢出和測(cè)定氟中的應(yīng)用在這個(gè)實(shí)施例中，所選有機(jī)化合物為β17-雌二醇。
1)抗雌二醇抗體的制備特別地，采用由β17-雌二醇衍生的化合物制備試驗(yàn)用抗體，其中，為達(dá)到在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體的目的，化合物與牛白蛋白偶聯(lián)。
所采用的制備方法如參考文獻(xiàn)[39]所示。
2)利用抗雌二醇抗體制備抗鼠抗體的抗體采用Immunotech公司(Lumigny)出售的抗鼠抗體的山羊抗體涂布96孔聚苯乙烯微孔板(Nunc)(濃度5μg/ml)。涂布后于4℃下將板保存在含0.5％白蛋白的緩沖液中。
通過(guò)簡(jiǎn)單的吸附實(shí)現(xiàn)與板的結(jié)合。溫育時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)以確保蛋白的結(jié)合。在本領(lǐng)域技術(shù)人員眼中這種制備方法為常規(guī)方法。
3)酶示蹤劑的制備將雌二醇和乙酰膽堿酯酶(AChE)偶聯(lián)制備酶示蹤劑。采用N-琥珀酰亞胺基-S-硫代乙酸乙酯向雌二醇中引入巰基。將如此修飾的雌二醇與AChE偶聯(lián)，其中AChE中引入了與雌二醇巰基反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基。通過(guò)凝膠過(guò)濾純化示蹤劑然后于-20℃下按份保存。
參考文獻(xiàn)[44]和[45]中描述了上述制備中的方法和酶示蹤劑，這些方法和酶示蹤劑在本發(fā)明中可以通用。
4)制品及其他試劑雌二醇來(lái)自Sigma Aldrich公司。甲硅烷基化試劑來(lái)自Perbio公司。
氫氟酸來(lái)自Merk-Eurolab公司。
所有試劑，即示蹤劑、抗體、雌二醇和樣品用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7)稀釋后使用，其中磷酸鹽緩沖液包含疊氮化物(0.01％w/v)(％w/v重量(g)和體積(100ml)比，即0.01g/100ml)、牛白蛋白(0.5％w/v)和NaCl(0.9％w/v)。
5)甲硅烷基化的雌二醇使用濃度的優(yōu)化針對(duì)與HF樣品接觸的甲硅烷基化雌二醇的濃度進(jìn)行優(yōu)化，其目的在于隨后能夠檢測(cè)去甲硅烷基化的雌二醇以及氟。
如果所采用的甲硅烷基化雌二醇濃度非常低，即使所有甲硅烷基化雌二醇均轉(zhuǎn)化成為雌二醇，也并不能總是保證檢測(cè)的精確度。
進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，以確定本發(fā)明方法中去甲硅烷基化所需的修飾雌二醇的最佳濃度。當(dāng)然，濃度需要根據(jù)所采用的試劑和操作條件作調(diào)整。
在本實(shí)施例中，濃度優(yōu)選為200ng/ml。
可以判斷這一濃度對(duì)于雌二醇或其衍生物而言是處于1至2000ng/ml，或優(yōu)選的2至500ng/ml之內(nèi)，這些濃度范圍僅具有象征意義，特別是在本實(shí)施例的條件下。
6)雌二醇的甲硅烷基化以體積計(jì)，將1份雌二醇(2mg/ml)和4份MTBSTFA混合，然后室溫下溫育30min至1hr。
所采用的甲硅烷基化試劑為BTSFA或MTBSTFA。這些產(chǎn)品的來(lái)源如上所述。
通過(guò)液相色譜和質(zhì)譜確定雌二醇已經(jīng)被甲硅烷基化。
甲硅烷基化后，投入使用前用100％二甲基甲酰胺(DMF)或100％二甲亞砜(DMSO)將雌二醇稀釋1000倍。
7)雌二醇的去甲硅烷基化將2.5μl 1M磷酸鹽緩沖液(pH＝5.5)和47.5μl樣品或已知濃度的HF溶液(標(biāo)準(zhǔn)溶液)加到50μl甲硅烷基化的雌二醇中。
振搖所得混合物，然后置于55-66℃水浴下1h將其蒸干。
用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7)稀釋反應(yīng)混合物以終止去甲硅烷基化反應(yīng)(稀釋40倍)，其中磷酸鹽緩沖液包含疊氮化物(0.01％w/v)(％w/v重量(g)和體積(100ml)比，即0.01g/100ml)、牛白蛋白(0.5％w/v)和NaCl(0.9％w/v)。
8)酶示蹤劑乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)量(Ellman法)該方法使用了一個(gè)假底物，即乙酰硫代膽堿(AcTCh)，其水解速度與乙酰膽堿相同。水解后生成能夠還原二硫代硝基苯(dithionitrobenzene)(DTNB)的硫代膽堿(TCh)。經(jīng)還原的DTNB在可見光范圍內(nèi)具有強(qiáng)烈的吸收(εm412nm＝13600mol-1·cm-1·1)，產(chǎn)生黃色。
考慮到被過(guò)量底物抑止的因素，AcTCh的濃度為AchE催化活性最強(qiáng)的濃度。此外，DTNB的用量小于AcTCh的用量，以避免所有底物被轉(zhuǎn)化后的比色檢測(cè)。相反，DTNB的用量要大于所生成的TCh的數(shù)量，以確保水解1分子AcTCh僅生成1分子的還原DTNB。
依據(jù)本發(fā)明所提供的信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何使用Ellman法，并且能夠毫無(wú)困難地尋找到最利于本發(fā)明方法實(shí)施的操作條件。
9)原始雌二醇的免疫檢測(cè)HF的定量將以上所制得的雌二醇萃取液稀釋40倍，分份加入含有示蹤劑和雌二醇抗體的檢測(cè)板中。反應(yīng)體積為200μl。
免疫反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1h。
清洗檢測(cè)板以除去未結(jié)合的示蹤劑，加入0.2ml指示劑溶液。
約1h后，黃色出現(xiàn)，用光度計(jì)測(cè)量光密度。
10)結(jié)果解釋利用系列標(biāo)準(zhǔn)溶液可以確定試驗(yàn)所測(cè)樣品中氟的含量，從而證明本發(fā)明方法的可行性。
實(shí)施例2MTBSTFA修飾的雌二醇和BTSFA修飾的雌二醇在HF檢測(cè)特異性方面的差別的研究在以下所有操作步驟中，去甲硅烷基化過(guò)程中所采用的甲硅烷基化雌二醇的濃度在指定試驗(yàn)的所有樣品中均相同。該濃度為200ng/ml。
其他試劑的濃度如下
鼠抗雌二醇抗體5μg/ml；乙酰硫代膽堿7×10-4M；5-5’-二硫代聯(lián)硝基苯甲酸7×10-4M；偶聯(lián)乙酰硫代膽堿的雌二醇約1ng/ml。
試驗(yàn)在具有300μl孔的聚苯乙烯板上進(jìn)行，方法與實(shí)施例1相同。
A)用BTSFA甲硅烷基化的雌二醇(具有三甲基甲硅烷基)被HF裂解(去甲硅烷基化反應(yīng))，從而回復(fù)成其原始形式。采用其他酸鹽酸(HCl)、硝酸(HNO3)、硫酸(H2SO4)和磷酸(H2PO4)也能觀察到裂解。結(jié)果列于附圖4中。
因此，采用這種甲硅烷基時(shí)，氟對(duì)去甲硅烷基化反應(yīng)并不總是具有特異性。所以只有在僅存在HF或其他酸不存在時(shí)，這種甲硅烷基化雌二醇才適用于檢測(cè)HF。
B)雖然在水性介質(zhì)中溶解度較差，但是MTBSTFA(所傳遞的硅烷基比BTSFA傳遞的硅烷基更為疏水)甲硅烷基化的雌二醇被HF特異性裂解(甲硅烷基化反應(yīng))，從而回復(fù)成其原始形式。如附圖6所示，在同樣反應(yīng)條件下所測(cè)試的酸不能裂解這種被修飾的雌二醇(參見以下實(shí)施例3)。
因此，本發(fā)明的發(fā)明者們?cè)谝韵碌膶?shí)施例中采用MTBSTFA甲硅烷基化雌二醇。
實(shí)施例3適用于本發(fā)明方法中去甲硅烷基化反應(yīng)的緩沖液的篩選由于某些酸對(duì)于MTBSTFA修飾的雌二醇仍具有去甲硅烷基化作用(參見實(shí)施例2)，本發(fā)明的發(fā)明者們對(duì)緩沖液進(jìn)行篩選，其目的在于提高氟對(duì)去甲硅烷基化作用的特異性，同時(shí)抑止其他可能存在的具有酸性的化合物的非特異性去甲硅烷基化作用。
濃度高時(shí)(用于緩沖高濃度的酸)，在酸不存在的情況下，堿如氫氧化鈉(NaOH)和氫氧化鉀(KOH)也可以誘導(dǎo)雌二醇的去甲硅烷基化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此不能采用。
對(duì)磷酸根離子濃度為50mM的磷酸鹽緩沖液(KH2PO4/K2HPO4)也進(jìn)行了測(cè)試并取得了好的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)這些溶液的pH進(jìn)行了篩選，以確保其酸性不至于導(dǎo)致甲硅烷基化雌二醇自發(fā)的去甲硅烷基化。
因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選在緩沖介質(zhì)中進(jìn)行，例如，當(dāng)樣品中含有其他能夠誘導(dǎo)有機(jī)化合物自發(fā)去甲硅烷基化的酸或堿使本發(fā)明方法檢出和/或測(cè)定靈敏度降低時(shí)。
而且，本發(fā)明的發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，去甲硅烷基化溫度過(guò)高可能導(dǎo)致經(jīng)修飾的雌二醇自發(fā)去甲硅烷基化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在不同溫度下對(duì)不同緩沖液進(jìn)行了研究。
附圖5顯示所得研究結(jié)果。圖中“E2M”代表二甲基叔丁基甲硅烷基雌二醇，“A.T.”代表室溫。
當(dāng)磷酸鹽緩沖液pH為5.5或6時(shí)，94℃下出現(xiàn)甲硅烷基化的雌二醇自發(fā)去甲硅烷基化，54℃下不發(fā)生自發(fā)去甲硅烷基化。
總之，甲硅烷基化雌二醇去甲硅烷基化的優(yōu)選條件如下在pH為5.5的50mM磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，溫度為54至64℃之間。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到這些條件是針對(duì)雌二醇和上述硅烷基以及上述操作條件確定的。
依據(jù)本發(fā)明所提供的信息，根據(jù)所選擇的甲硅烷基化的有機(jī)化合物、樣品以及實(shí)施本發(fā)明方法的條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠輕易地確定其他操作條件。
實(shí)施例4不同酸對(duì)于實(shí)施本發(fā)明方法的影響作用在上述實(shí)施例3所描述的條件下測(cè)試多種其他的酸對(duì)于去甲硅烷基化的影響作用。
測(cè)試結(jié)果列于圖6中。在該圖中，“F.ac”代表甲酸；“ac.ac”代表乙酸；“P.ac”代表磷酸；“OP.ac”代表正磷酸；“T.ac”代表三氟乙酸。
結(jié)果清楚地表明，除HF以外，這些酸對(duì)于MTBSTFA甲硅烷基化的雌二醇幾乎沒有作用。
因此，對(duì)于氟檢測(cè)的特異性而言，硅烷基的篩選起了重要的作用。當(dāng)待測(cè)樣品中含有除氟以外的其他成份，特別是這些成份能夠誘導(dǎo)所采用的有機(jī)化合物發(fā)生去甲硅烷基化時(shí)，應(yīng)該考慮這一情況。
實(shí)施例5與其他鹵素和親核性物質(zhì)作比較時(shí)氟檢測(cè)的特異性氟是一種鹵素并且具有親核性。為測(cè)試?yán)么贫既ゼ坠柰榛磻?yīng)檢測(cè)氟的特異性，在以上實(shí)施例所描述的操作條件下，采用MTBSTFA甲硅烷基化的雌二醇研究其他鹵素，如Bu4NBr、Bu4NCl、Bu4NI和KI，以及親核性試劑如4-硝基苯酚和4-硝基咪唑的影響作用。
附圖7顯示了本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果證明，與其他物質(zhì)相比，氟的檢測(cè)具有特異性。
顯然，與其他受試物質(zhì)相比，氟在雌二醇去甲硅烷基化反應(yīng)中特異性顯著。
實(shí)施例6HF和氟離子引發(fā)的裂解在這一實(shí)施例中，在以上實(shí)施例所描述的操作條件下，將多種氟鹽與MTBSTFA甲硅烷基化的雌二醇接觸。
附圖8對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了整理。在該附圖中，采用常規(guī)化學(xué)符號(hào)標(biāo)識(shí)所測(cè)試的不同氟鹽。
就裂解甲硅烷基化的雌二醇而言，氟離子的行為與HF類似，以此確認(rèn)該反應(yīng)對(duì)于氟具有特異性。
實(shí)施例7本發(fā)明方法的檢測(cè)能力以及添加有機(jī)化合物的效應(yīng)在以上實(shí)施例所描述的操作條件下，如圖7和8所示，將HF溶于水性介質(zhì)時(shí)，檢測(cè)HF的靈敏度約為5×10-5M(即1μg/ml)。
在進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)向水性去甲硅烷基化反應(yīng)的水性溶液中加入與水混溶的有機(jī)溶劑可以進(jìn)一步提高本發(fā)明方法的靈敏度。
采用二甲基甲酰胺(DMF)(參見雌二醇的甲硅烷基化)和二甲亞砜(DMSO)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
采用二甲亞砜(DMSO)作溶劑進(jìn)行本發(fā)明方法的去甲硅烷基化時(shí)，靈敏度可以提高500倍(約為10-7M，即0.001μg/ml)。
圖19顯示以用于接觸的水性溶液總體積計(jì)，二甲亞砜體積濃度為95％時(shí)進(jìn)行反應(yīng)所得的氟離子劑量—響應(yīng)曲線。并將所得結(jié)果與以上實(shí)施例所得結(jié)果作了比較。
因此，向所述用于接觸的水性溶液中添加有機(jī)溶劑可以顯著增加本發(fā)明方法檢出和/或測(cè)定氟的靈敏度。
實(shí)施例8本發(fā)明化合物為雌二醇衍生物時(shí)本發(fā)明方法的使用情況在本實(shí)施例中，實(shí)施本發(fā)明方法的有機(jī)化合物為雌二醇的O-甲基衍生物(E2OCH3)17β-雌二醇-3-甲醚，結(jié)構(gòu)式如下 所采用操作條件如以上實(shí)施例1和2所示。
所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果在附圖17中顯示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氟的存在下E2OCH3確實(shí)發(fā)生了去甲硅烷基化。
因此，這是本發(fā)明方法使用雌二醇衍生物的有說(shuō)服力的證據(jù)。
實(shí)施例9有機(jī)化合物為具有羥基的肽時(shí)本發(fā)明方法的使用情況在本實(shí)施例中，有機(jī)化合物為肽。這種肽為四肽，即乙?；腟er-Asp-Lys-Pro(AcSDKP)，結(jié)構(gòu)式如下 AcSDKP是一種具有羥基的肽，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有助于其同時(shí)被甲硅烷基化并且通過(guò)自身的羧基或氨基連接于固相之上。
首先研究這種肽的甲硅烷基化反應(yīng)，然后再研究甲硅烷基化的化合物在本發(fā)明方法中的使用情況。
于22℃、37℃或60℃下采用未經(jīng)稀釋的BSTFA或MTBSTFA對(duì)AcSDKP(1mg/ml)甲硅烷基化10、30或60分鐘。反應(yīng)后采用參考文獻(xiàn)[5]所描述的AcSDKP特異性競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)和兔多克隆抗體檢測(cè)甲硅烷基化的AcSDKP。在這種情況下，信號(hào)的增強(qiáng)指示免疫反應(yīng)活性已喪失，說(shuō)明甲硅烷基化反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。
如顯示所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的附圖15所示，60℃時(shí)MTBSTFA降低了AcSDKP的反應(yīng)性，說(shuō)明化合物已經(jīng)被甲硅烷基化。
此后依據(jù)本發(fā)明方法在HF存在下對(duì)甲硅烷基化的肽進(jìn)行去甲硅烷基化試驗(yàn)。附圖16對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了整理?？梢钥闯鯤F使肽去甲硅烷基化。硅烷基的喪失使得免疫反應(yīng)活性增加，信號(hào)減弱。如該附圖所示，在HF存在下信號(hào)減弱。
因此，本發(fā)明的方法可以采用羥基化的肽作為有機(jī)化合物。
實(shí)施例10溶液中氟的檢出和測(cè)定為了檢驗(yàn)本發(fā)明方法的有效性，作者檢測(cè)了多種氟含量已知的礦泉水。
實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1所述，所采用的有機(jī)化合物為MTBSTFA甲硅烷基化的雌二醇(二甲基叔丁基甲硅烷基雌二醇)。
下表1對(duì)本實(shí)施例所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了整理。結(jié)果顯示對(duì)各個(gè)樣品均檢出了氟的存在。
對(duì)于濃度最高的水樣，理論濃度和所檢出的濃度相符合。存在于樣品中的氟的特性可能是造成偏差的原因。
表I礦泉水中氟含量的測(cè)定

實(shí)施例11氣體介質(zhì)中氟的檢測(cè)HF常常以氣體形式被檢測(cè)，為進(jìn)行檢測(cè)，需要將氣體通入水溶液中。由于本發(fā)明的發(fā)明者們沒有受HF污染的氣體樣品，故在密封的容器中通過(guò)蒸發(fā)已知濃度的HF溶液制備人工樣品。HF被蒸發(fā)后，將其他泵入收集緩沖液(DMF)中并在其中鼓泡。
采用一個(gè)可以過(guò)濾100L氣體的體系(氣體中HF濃度為1.2×10-2升/106升空氣(12ppb))，得到HF濃度為10-5M的溶液(假設(shè)吸收率為100％)。
檢測(cè)氟的方法如實(shí)施例1所述，所采用的有機(jī)化合物為MTBSTFA甲硅烷基化的雌二醇(二甲基叔丁基甲硅烷基雌二醇)。
圖9顯示了各次檢測(cè)所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。氟的理論濃度和檢出濃度符合得相當(dāng)好。
因此，本發(fā)明檢測(cè)空氣中HF的方法可輕易地檢出濃度為10-2升/106升空氣(10ppb)的HF。
實(shí)施例12本發(fā)明方法在非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢出和測(cè)定氟中的應(yīng)用1)總的策略實(shí)驗(yàn)的目的是利用先前所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即有可能優(yōu)化針對(duì)HF和甲硅烷基化的化合物相互作用的免疫學(xué)識(shí)別。
與以上(競(jìng)爭(zhēng)性)實(shí)驗(yàn)方法相比，本免疫檢測(cè)方法包括通過(guò)共價(jià)鍵將甲硅烷基化的化合物固定于固體表面之上。與競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)中使信號(hào)消失相反，通過(guò)HF的轉(zhuǎn)化作用形成免疫反應(yīng)的活性形式，從而產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。
這種方法常常使檢測(cè)靈敏度更高，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的試劑使反應(yīng)熱力學(xué)更佳。此外，由于觀察或測(cè)量信號(hào)的出現(xiàn)要比信號(hào)的消失更容易，因此也方便讀數(shù)。
2)試劑和方案采用參考文獻(xiàn)[39]所描述的抗體。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行兔抗體的生物素化，抗生蛋白鏈菌素或抗體的乙酰膽堿酯酶標(biāo)記。
所有化學(xué)試劑和制品得自Sigma或Merk公司。化合物來(lái)自Sigma或Steraloids(就雌二醇衍生物而言)。
試驗(yàn)用緩沖液為0.05M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，其包含疊氮化物(0.01％)、牛白蛋白(0.5％)和NaCl(0.9％)。
酶指示劑由乙酰硫代膽堿和二硝基氟苯的混合物構(gòu)成。與示蹤劑反應(yīng)后產(chǎn)生黃色，可以裸眼觀測(cè)或采用光度計(jì)于414nm處定量檢測(cè)。
用于進(jìn)行試驗(yàn)，特別是用于連接雌二醇衍生物的板來(lái)自Nunc公司(Rochester，USA)。
所采用的甲硅烷基化試劑為BSTFA和MTBSTFA。
所使用的雌二醇如下所示。該化合物的優(yōu)點(diǎn)是可以采用以上競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)所開發(fā)出的抗體和基本檢測(cè)原理。
本發(fā)明的發(fā)明者們首次證實(shí)了所獲得的雌二醇抗體能夠識(shí)別未甲硅烷基化的這種化合物，但是不能識(shí)別甲硅烷基化的化合物(與雌二醇相比，與抗體發(fā)生53％的交叉反應(yīng))。檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。
雌二醇羧甲醚(EstCME)的結(jié)構(gòu)式此后，本發(fā)明的發(fā)明者們測(cè)試了這種雌二醇與兩種板的共價(jià)連接(結(jié)合)含有氨基的板(Nunc-NH2板)和聚賴氨酸(poly-Lys)活化的板。
3)雌二醇衍生物的連接實(shí)驗(yàn)在等摩爾濃度的、用于連接板上氨基和抗原中羧基的試劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)存在下，將EstCME在Nunc板中溫育3h。20℃下用100ng/ml抗雌二醇抗體處理4小時(shí)，然后22℃下用偶聯(lián)在乙酰膽堿酯酶上的抗兔抗體的山羊抗體(2個(gè)Ellman單位gAb-AchE/ml)處理2小時(shí)進(jìn)行顯色。加入作為AchE底物的Ellman試劑對(duì)酶活性進(jìn)行顯色。
所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果在附圖10中顯示。結(jié)果說(shuō)明雌二醇被有效地結(jié)合，而且在最高測(cè)試濃度(100μl/ml)下達(dá)到峰值。
采用預(yù)先吸附有聚賴氨酸(poly-Lys)(1至100μg/ml的磷酸鹽緩沖液的溶液)的板對(duì)以上初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)。
所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果在附圖11中顯示。在這種情況中，不論聚賴氨酸的濃度如何均取得了相同數(shù)量級(jí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這也證明了聚賴氨酸所攜帶的氨基更容易和所選雌二醇結(jié)合。
為了更詳細(xì)地研究聚賴氨酸濃度的影響作用，采用濃度范圍更寬的聚賴氨酸重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果在附圖12中顯示。結(jié)果顯示最佳聚賴氨酸濃度為1μg/ml。
上述兩個(gè)附圖證明，當(dāng)聚賴氨酸濃度為1μg/ml，雌二醇羧甲醚濃度為10μg/ml時(shí)，雌二醇衍生物和板產(chǎn)生有效的結(jié)合。
4)雌二醇衍生物的甲硅烷基化此外，本發(fā)明的發(fā)明者們?cè)O(shè)法尋找到上述化合物的最佳甲硅烷基化反應(yīng)條件。在兩個(gè)溫度(22℃或33℃)下，將雌二醇羧甲醚與不同濃度的MTBSTFA(1/5、1/2和1/1)反應(yīng)進(jìn)行甲硅烷基化，反應(yīng)時(shí)間為0至60分鐘。利用甲硅烷基化雌二醇的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)檢測(cè)甲硅烷基化反應(yīng)，其中甲硅烷基化的雌二醇喪失識(shí)別力。
附圖13顯示所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示在MTBSTFA濃度高的情況下雌二醇羧甲醚喪失免疫反應(yīng)活性。免疫反應(yīng)活性的喪失通過(guò)因識(shí)別力喪失所造成的信號(hào)增加加以證明。MTBSTFA被證明具有劑量依賴性。
綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即、綜合固相偶聯(lián)效能和甲硅烷基化效能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使得能夠在板上進(jìn)行以下的偶聯(lián)/去甲硅烷基化試驗(yàn)。
5)偶聯(lián)/去甲硅烷基化試驗(yàn)22℃下，在相同濃度MTBSTFA存在下將雌二醇羧甲醚(8.3mg/ml)反應(yīng)1h，此后用水稀釋至1μg/ml，然后于22℃下，在NHS存在下在涂布有聚賴氨酸(1μg/ml)的板上反應(yīng)1h。
在沒有HF或有1mM HF存在下，于22、37和64℃下進(jìn)行去甲硅烷基化反應(yīng)，時(shí)間為1小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖14中。如該圖所示，在HF存在下可以觀察到因甲硅烷基化雌二醇羧甲醚發(fā)生去甲硅烷基化所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)活性增加。
以此證明了當(dāng)甲硅烷基化的有機(jī)化合物結(jié)合至載體上時(shí)，本發(fā)明方法能夠檢測(cè)HF。
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權(quán)利要求
1.一種檢出和/或測(cè)定樣品中氟化物(F-)或氟化氫(HF)濃度的方法，其包括以下步驟-在水溶液中將所述樣品與甲硅烷基化的有機(jī)化合物接觸，以此得到測(cè)量溶液，所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物在氫氟酸或氟化物存在時(shí)發(fā)生去甲硅烷基化，使得能夠相互獨(dú)立地檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物和去甲硅烷基化的有機(jī)化合物；-在所述測(cè)量溶液中檢出和/或測(cè)定去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失，如果樣品中存在氟化物或氟化氫，則發(fā)生去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自C1至C6烷基，而R4為所述有機(jī)化合物。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基和丁基。
4.權(quán)利要求1、2或3之一所述的方法，其中所述有機(jī)化合物為羥基化合物，其分子量為250至200000g/mol。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述有機(jī)化合物為選自于以下組中的羥基化合物雌二醇、肽、高香草酸、兩性霉素、甾體、細(xì)胞因子和花生四烯酸或這些化合物的衍生物。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述檢測(cè)溶液中，利用氣相色譜法檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)。
7.權(quán)利要求1至6之一所述的方法，其中在所述檢測(cè)溶液中，利用免疫檢測(cè)法檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)，在該免疫檢測(cè)法中采用一種或多種針對(duì)未甲硅烷基化或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的抗體。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體為一種或多種單克隆抗體。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述免疫檢測(cè)法為競(jìng)爭(zhēng)型或非競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定。
10.權(quán)利要求1或7所述的方法，其中所述有機(jī)化合物為雌二醇或其一種衍生物。
11.權(quán)利要求1或7所述的方法，其中所述有機(jī)化合物選自雌-1，3，5-三烯-3，17μ或17μ-二醇或其衍生物。
12.上述權(quán)利要求之一所述的方法，其中所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物在接觸步驟中的使用濃度為1至2000ng/ml。
13.上述權(quán)利要求之一所述的方法，其中將接觸用水溶液緩沖至pH為4.5至5.5。
14.上述權(quán)利要求之一所述的方法，其中在54至64℃下進(jìn)行接觸。
15.一種檢出和/或測(cè)定樣品中氟化物(F-)或氟化氫(HF)濃度的試劑盒，其包含以下試劑一種在氟或氫氟酸存在下發(fā)生去甲硅烷基化的甲硅烷基化的有機(jī)化合物；以及一種檢測(cè)水溶液中去甲硅烷基化的有機(jī)化合物出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物消失的裝置。
16.權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)式如下 其中R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自C1至C6烷基，而R4為所述有機(jī)化合物。
17.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中R1、R2和R3相互獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基和丁基。
18.權(quán)利要求15、16或17之一所述的試劑盒，其中所述有機(jī)化合物為羥基化合物，其分子量為250至200000g/mol。
19.權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其中所述有機(jī)化合物為選自于以下組中的羥基化合物雌二醇、肽、高香草酸、兩性霉素、甾體、細(xì)胞因子和花生四烯酸或這些化合物的衍生物。
20.權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其中所述有機(jī)化合物為雌二醇或其一種衍生物。
21.權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述有機(jī)化合物選自雌-1，3，5-三烯-3，17μ或17μ-二醇或其衍生物。
22.權(quán)利要求15至21之一所述的試劑盒，其還包含一種或多種針對(duì)未甲硅烷基化或去甲硅烷基化的有機(jī)化合物或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的抗體。
23.權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中還包含用于進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定所需的試劑和抗體，或者用于進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定所需的試劑和抗體。
24.權(quán)利要求15、22或23所述的試劑盒，其還包含一種聚苯乙烯片，該片上具有一個(gè)或多個(gè)孔，作為接觸步驟和/或檢出和/或測(cè)定步驟的容器。
25.權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述孔中涂布有對(duì)抗鼠抗雌二醇抗體的抗體。
26.權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述甲硅烷基化的雌二醇結(jié)合于所述孔的底部。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢出和/或測(cè)定樣品中氟化物(F－)或氟化氫(HF)濃度的方法，其包括以下步驟在水溶液中將所述樣品與甲硅烷基化的有機(jī)化合物接觸，以此得到測(cè)量溶液，所述甲硅烷基化的有機(jī)化合物在氫氟酸或氟化物的存在時(shí)發(fā)生去甲硅烷基化，使得可以分別檢出和/或測(cè)定甲硅烷基化的有機(jī)化合物和去甲硅烷基化的有機(jī)化合物；在所述測(cè)量溶液檢出和/或測(cè)定去甲硅烷基化的有機(jī)化合物的出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物的消失，如果樣品中存在氟化物或氟化氫，則會(huì)出現(xiàn)去甲硅烷基化的有機(jī)化合物出現(xiàn)或甲硅烷基化的有機(jī)化合物消失這種現(xiàn)象。就氟化物或氟化氫的檢測(cè)而言，本發(fā)明的方法檢測(cè)的量級(jí)可以輕易地達(dá)到1×10
文檔編號(hào)G01N33/53GK1705881SQ200480001311
公開日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者埃里克·埃贊, 馬里-阿斯特麗·薩戈, 菲利普·普拉代勒 申請(qǐng)人:原子能委員會(huì)