一種制備高載量親和層析介質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化分離介質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種制備高載量親和層析介質(zhì)的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，親和層析是生物制藥領(lǐng)域中分離純化生物活性物質(zhì)的一種重要方法，其分 離工藝的核心在于對分離介質(zhì)的選擇，親和層析過程中通過介質(zhì)上的配基與目標(biāo)分子之間 的特異性吸附和解離來實現(xiàn)純化目標(biāo)分子的目的，由于這種特異性的作用力，親和層析具 有高度選擇性、高活性回收等特點，對分離含量極少又不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效。
[0003] 隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，對疫苗、抗體類藥物的需求與日倶增，因此如何快速高 效地得到純度較高的生物制品一直是具有挑戰(zhàn)性的課題，現(xiàn)有技術(shù)方案中用于商品化的親 和層析介質(zhì)多以瓊脂糖為基質(zhì)，由于其為多糖基質(zhì)，質(zhì)地較軟、孔徑小，故機械強度差，難以 提高流速，因此成為實現(xiàn)快速、高效分離純化的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種制備高載量親和層析介質(zhì)的方法，該方法能顯著提高親 和配基的偶聯(lián)量，得到通透性好的高通量、高載量的親和層析介質(zhì)，滿足目前生化分離對快 速、高效、高通量的需求。
[0005] -種制備高載量親和層析介質(zhì)的方法，所述方法包括：
[0006] 在有機溶劑存在的條件下，將乙烯基單體通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方式引發(fā)接 枝聚合至聚苯乙烯類或其共聚物材料的表面；
[0007] 然后在一定溫度下，將親和配基偶聯(lián)至所得材料表面的間隔臂上，得到親和層析 介質(zhì)。
[0008] 所述有機溶劑包括二氧六環(huán)、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺中的一種或兩種的 混合物；
[0009] 且所述有機溶劑的質(zhì)量用量為發(fā)生反應(yīng)的聚苯乙烯類或其共聚物材料質(zhì)量的 10~20倍。
[0010] 所述乙烯基單體包括甲基丙烯醛、甲基丙烯酸縮水甘油醚和甲基丙烯酸中的一種 或兩種混合物；
[0011] 且其質(zhì)量用量為所述聚苯乙烯類或其共聚物材料質(zhì)量的1/2~5倍。
[0012] 在采用所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方式過程中，所用到的催化劑及配體體系為鹵 化物和含氮配體，其中：
[0013] 所述鹵化物包括氯化亞銅和溴化亞銅中的一種或兩種的混合物；
[0014] 所述含氮配體包括：聯(lián)二吡啶Bpy、四甲基乙二胺TMEDA、五甲基二亞乙基三胺 PMDETA和六甲基三亞乙基四胺HMETETA中的一種或多種的混合物；
[0015] 且所述鹵化物的加入比例為所述乙烯基單體摩爾數(shù)的1~10%，所述鹵化物與所 述含氮配體的摩爾比為1 :1。
[0016] 所述接枝聚合的反應(yīng)溫度為20~80°C，反應(yīng)時間為2~12h。
[0017] 在將親和配基偶聯(lián)至所得材料表面的間隔臂上時，所述一定溫度為4~30°C，且 反應(yīng)時間為5~24h。
[0018] 所述親和配基包括：Protein A、Protein G、乙肝抗體、人血清白蛋白中的一種或 兩種配基的組合物。
[0019] 所述親和配基的濃度范圍為2. 0~10mg/mL，其體積用量為被偶聯(lián)材料質(zhì)量的5~ 20倍，且親和配基溶液的體積與被偶聯(lián)材料質(zhì)量的比值范圍為5:1~20:1。
[0020] 所述聚苯乙烯類或其共聚物材料具體包括：聚乙烯基芐氯與二乙烯基苯共聚物材 料；或聚乙烯基芐氯材料。
[0021] 由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，該方法能顯著提高親和配基的偶聯(lián)量， 得到通透性好的高通量、高載量的親和層析介質(zhì)，滿足目前生化分離對快速、高效、高通量 的需求。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用 的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 附圖。
[0023] 圖1為本發(fā)明實施例所提供制備高載量親和層析介質(zhì)的方法流程示意圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整 地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒?發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施 例，都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施例作進一步地詳細描述，如圖1所示為本發(fā)明實施 例所提供制備高載量親和層析介質(zhì)的方法流程示意圖，所述方法包括：
[0026] 步驟11 :在有機溶劑存在的條件下，將乙烯基單體通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方 式引發(fā)接枝聚合至聚苯乙烯類或其共聚物材料的表面；
[0027] 在該步驟中，所述有機溶劑包括二氧六環(huán)、甲醇、二甲基亞砜（DMS0)、二甲基甲酰 胺（DMF)中的一種或兩種的混合物。且所述有機溶劑的質(zhì)量用量為發(fā)生反應(yīng)的聚苯乙烯類 或其共聚物材料質(zhì)量的10~20倍，即微球質(zhì)量：溶劑質(zhì)量=1:10~20 (g/g)。該有機溶 劑所起作用為原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP)提供溶劑環(huán)境，另外對大孔聚合物材料起到溶 脹作用，因此凡是能夠溶解乙烯基單體的溶劑均可，不限于以上所用幾種。
[0028] 所述乙烯基單體包括甲基丙烯醛（MALD)、甲基丙烯酸縮水甘油醚（GMA)和甲基丙 烯酸（MAC)中的一種或兩種混合物；且其質(zhì)量用量為所述聚苯乙烯類或其共聚物材料質(zhì)量 的1/2~5倍。
[0029] 另外，在采用所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方式過程中，所用到的催化劑及配體體 系為鹵化物和含氮配體，其中：
[0030] 所述鹵化物包括氯化亞銅和溴化亞銅中的一種或兩種的混合物；
[0031] 所述含氮配體包括：2, 2-聯(lián)二吡啶（Bpy)、四甲基乙二胺（TMEDA)、N，N， N，' N，"N，"' -五甲基二亞乙基三胺（PMDETA)和1，1，4,7，10，10' -六甲基三亞乙基四胺 (HMETETA)中的一種或多種的混合物；
[0032] 且所述鹵化物的加入比例為所述乙烯基單體摩爾數(shù)的1~10%，所述鹵化物與所 述含氮配體的摩爾比為1 :1。
[0033] 具體實現(xiàn)中，上述接枝聚合的反應(yīng)溫度范圍為20~80°C，反應(yīng)時間為2~12h。且 在接枝聚合反應(yīng)完畢后，減壓抽濾，并用去離子水進行洗滌去除其他可溶雜質(zhì)，然后在60°C 下真空干燥24h，以質(zhì)量法計算每克接枝后材料的（連接間隔臂后）表面的功能團的數(shù)量 (偶聯(lián)親和配基反應(yīng)位點數(shù)量），計算公式如下：
[0035] 另外，在本實例中，上述聚苯乙烯類或其共聚物材料具體可以包括：聚乙烯基芐氯 與二乙烯基苯共聚物材料；或聚乙烯基芐氯材料。上述材料均為大孔材料。
[0036] 步驟12 :然后在一定溫度下，將親和配基偶聯(lián)至所得材料表面的間隔臂上，得到 親和層析介質(zhì)。
[0037] 在該步驟中，在將親和配基偶聯(lián)至所得材料表面的間隔臂上時，所述一定溫度為 4~30°C，且反應(yīng)時間為5~24h。
[0038] 具體實現(xiàn)中，所述親和配基可以包括：Protein A、Protein G、乙肝抗體、人血清白 蛋白中的一種或兩種配基的組合物；但本發(fā)明實施例并不限于以上幾種親和配基，凡是帶 有氨基、羧基的親和配基均可實現(xiàn)。
[0039] 進一步的，所述親和配基的濃度范圍為2. 0~10mg/mL，其體積用量為被偶聯(lián)材料 質(zhì)量的5~20倍，且親和配基溶液的體積與被偶聯(lián)材料質(zhì)量的比值范圍為5:1~20:1 (mL/ g) 〇
[0040] 在具體實現(xiàn)中，所用的溶劑環(huán)境均為pH = 7. 0的20mM的磷酸緩沖液，除此之外根 據(jù)材料表面的間隔臂官能團的不同，還需要加入縮合劑，具體來說：如果間隔臂為聚甲基丙 烯醛或者聚甲基丙烯酸縮水甘油醚，則無需加入縮合劑，間隔臂上的醛基直接與親和配基 的氨基發(fā)生加成反應(yīng)即可；但如果間隔臂與親和配基的氨基或者羧基發(fā)生縮合反應(yīng)時，則 需要加入縮合劑Ν，Ν' -二異丙基碳二亞胺（DIC)，其加入摩爾量與間隔臂官能團摩爾量比 值為1:1。
[0041] 下面以具體的實例對上述制備工藝方法進行詳細說明：
[0042] 實施例一、
[0043] 1)將大孔PCMS-DVB微球接枝聚甲基丙烯醛間隔臂
[0044] 準(zhǔn)確稱取PCMS-DVB微球1. 0g放入50mL的三口瓶中，然后加入二氧六環(huán)10mL、 0. 5g甲基丙稀醛單體，加入催化劑0. 07g CuCl (0. 7mmol)和0. 12g