專利名稱：一種免疫層析快速試劑盒及其生產(chǎn)制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種免疫層析試紙條、其制備方法及含有所述試紙條的試劑盒。具 體而言，本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，采用凍干法生產(chǎn)所述免疫 層析試紙條的生產(chǎn)方法，以及包含所述免疫層析試紙條的檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及了應(yīng) 用上述生產(chǎn)方法生產(chǎn)的用于檢測甲胎蛋白、C反應(yīng)蛋白的免疫層析試紙條及其試劑盒。
背景技術(shù)：
中國專利申請200410034104. 0中記載了一種被稱為上轉(zhuǎn)發(fā)光材料(UCP)的物質(zhì) 以及應(yīng)用該材料作為標(biāo)記物的免疫層析試紙條。雖然上轉(zhuǎn)發(fā)光材料具有高靈敏性、高穩(wěn)定性、高簡易性、高靈活性和高安全性等諸 多優(yōu)點(diǎn)，使其在作為生物標(biāo)記物方面具有廣泛的應(yīng)用前景。但是至今仍然沒有一種商品化 的上轉(zhuǎn)發(fā)光法定量檢測試紙可以供臨床使用，原因是在于現(xiàn)有的基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法的免疫層 析試紙條無法滿足對定量檢測試紙的生產(chǎn)質(zhì)量要求。如中國專利申請200410034104. 0所 述，以往UPT (上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)，Up-Converting Phosphor Technology)快速試紙的制備方法 中結(jié)合墊或結(jié)合物釋放墊是采用烘干方法。由于UCP顆粒容易團(tuán)聚，導(dǎo)致烘干結(jié)合墊后裁 剪的變異過大，批內(nèi)精密度低，變異系數(shù)(CV)大于15%。變異系數(shù)CV常被用于表示精密 度，包括批內(nèi)和批間變異系數(shù)兩種(分別對應(yīng)于批內(nèi)精確度和批間精確度)，CV越小精密度 越高。批間精密度的CV值一般大于批內(nèi)，低含量標(biāo)本的CV值一般大于高含量標(biāo)本。最常 見的精密度評價(jià)是對穩(wěn)定的樣品作多次測定，求這些重復(fù)測定值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差s，以及變 異系數(shù)CV。重復(fù)次數(shù)一般要求10-20次。若在一批內(nèi)的重復(fù)測定，這是批內(nèi)精密度；衛(wèi)生 部發(fā)的《臨床化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量檢驗(yàn)總則》WS/T124-1999中有這方面的檢測和計(jì)算 方法的規(guī)定。一般臨床免疫試劑的批內(nèi)和批間CV均應(yīng)該< 15%。醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對病人標(biāo)本檢測時(shí)，由于該行業(yè)的沿襲特點(diǎn)，一直是對每份標(biāo)本只作 一次檢測發(fā)出報(bào)告。因此國際上將精密度性能列為實(shí)驗(yàn)方法、儀器或試劑盒分析性能的第 一位。檢測結(jié)果必須具重現(xiàn)性，也即具有良好的精密度。因此急需開發(fā)出具有較高精密度 的基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法技術(shù)的免疫層析試紙條。甲胎蛋白(α -Fetoprotein, AFP)是 1956 年 Bergstrandh 和 Czar 在人胎兒血清 中發(fā)現(xiàn)的一種專一性的甲種球蛋白，是胚胎早期的主要蛋白質(zhì)，來源于胎兒肝臟和卵黃囊。 胎兒的AFP濃度非常高，可達(dá)l-10mg/ml，但在出生后迅速下降，生后2個(gè)月只有痕量AFP可 檢測到，并幾乎完全被血清白蛋白所替代。甲胎蛋白是原發(fā)性肝細(xì)胞癌(PHC)較為特異的 腫瘤標(biāo)志物，70%以上的患原發(fā)性肝細(xì)胞癌病人早期血清中AFP含量升高。同時(shí)在其它一 些惡性腫瘤中也能發(fā)現(xiàn)AFP水平升高，如睪丸癌。對血清中AFP含量的檢測可以用作肝癌 高發(fā)區(qū)普查以及肝癌的早期臨床診斷，同時(shí)也可以評定肝癌的治療效果和判斷預(yù)后。C-反應(yīng)蛋白(CRP)是參與炎癥的主要時(shí)機(jī)反應(yīng)蛋白，在各種急性炎癥、組織損傷、 心肌梗塞、手術(shù)創(chuàng)傷、放射性損傷等疾病發(fā)作后數(shù)小時(shí)迅速升高，并有成倍增長之勢。病變 好轉(zhuǎn)時(shí)，又迅速降至正常，其升高幅度與感染的程度呈正相關(guān)。C-反應(yīng)蛋白還可用于細(xì)菌和病毒感染的鑒別診斷。一旦發(fā)生炎癥，C-反應(yīng)蛋白水平即升高，而病毒性感染C-反應(yīng)蛋白 大都正常。近年來發(fā)現(xiàn)C-反應(yīng)蛋白濃度甚至在正常范圍內(nèi)的輕度升高都與心血管疾病發(fā)生 的危險(xiǎn)性增加有關(guān)，可以推測以后心肌梗死事件發(fā)生的可能性。超敏C-反應(yīng)蛋白是心腦血 管疾病中的一項(xiàng)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測指標(biāo)，可以敏感地預(yù)測糖尿病合并心、腦血管事件的危險(xiǎn)發(fā)生率。AFP和CRP都是常見的POCT檢測指標(biāo)。應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)開發(fā)AFP及 CRP快速檢測免疫層析試紙條應(yīng)用于床旁快速檢測(POCT)領(lǐng)域有臨床應(yīng)用價(jià)值，但是批內(nèi) 精密度(CV)應(yīng)不高于15%才能滿足臨床使用需要。因此需要具有可以應(yīng)用于POCT檢測的 高精密度，基于上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)的成品AFP及CRP快速檢測免疫層析試劑條及試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)的采用 經(jīng)凍干法制備的結(jié)合墊或結(jié)合物釋放墊的免疫層析試紙條，具有精密度高即變異系數(shù) CV^ 15%的特點(diǎn)。本發(fā)明的試紙條是檢測原理是通過一系列表面修飾與活化，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 UCP (Up-Converting Phosphor, UCP)顆粒可與生物活性分子相結(jié)合，利用UPT生物傳感器， 對在層析過程中通過特異免疫反應(yīng)結(jié)合于特定區(qū)域(檢測帶與質(zhì)控帶)的UCP顆粒進(jìn)行掃 描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精確定量或定性。具體地，本發(fā)明提供了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，其特征在于 含有上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCP)-生物分子顆粒的結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊是經(jīng)凍干的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫層析試紙條的分析膜為硝酸纖維素膜。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔、結(jié) 果判讀窗口和終點(diǎn)指示窗口，如圖2B所示。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果 判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點(diǎn)指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的終點(diǎn)指示 帶，如圖2B所示。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物分子選自AFP抗體、CRP抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫特羅(瘦肉精)抗 體、鹽酸萊克多巴胺抗體、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗體、乙肝表面抗原 抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。優(yōu)選地，所述上述抗體均為單抗。本發(fā)明還提供了一種制備上述免疫層析試紙條的方法，其中在制備結(jié)合墊或結(jié)合 物稀釋墊的過程中，所述結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊是經(jīng)凍干的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述所述制備結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊的過程包括a)將UCP-生物分子懸濁液離心并棄上清；b)向a)步驟得到的UCP-生物分子沉淀物中加入U(xiǎn)CP保存液，吹打混勻；c)向b)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加入凍干液；d)將C)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加于玻璃纖維上；e)將玻璃纖維放于_80°C下，預(yù)凍時(shí)間0. 5小時(shí)，真空凍干2小時(shí)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述UCP保存液為pH7. 2的0. 15M的磷酸緩沖液，含 有2wt% BSA和0. 05wt% NaN3，所述凍干液為ρΗ7· 2的0. 15Μ的磷酸緩沖液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1.氨酸。本發(fā)明還提供了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析快速試劑盒，包括本發(fā)明的 上述免疫層析試紙條。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述試劑盒中試紙條的生物分子選自AFP抗體、CRP抗 體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫特 羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗 體、乙肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。優(yōu)選地，所述上述抗體均為單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有上述AFP-UPT快速檢測免疫層析試劑 條的試劑盒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有上述CRP-UPT快速檢測免疫層析試 劑條的試劑盒。本發(fā)明克服了以往烘干法生產(chǎn)上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙條碰到的精密度低，變異系 數(shù)cv%過大的問題，克服了上轉(zhuǎn)發(fā)光法免疫層析試紙條產(chǎn)業(yè)化當(dāng)中的極其重要的問題。使 得上轉(zhuǎn)發(fā)光法免疫層析試紙條可以應(yīng)用于臨床。


圖1為兩個(gè)光子激發(fā)UCP產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的過程。圖2為附圖為本發(fā)明凍干法上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫定量檢測免疫層析試紙條免疫層析試 紙條的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。其中圖2A中1為樣品墊、2為結(jié)合墊、3為分析膜、4為吸水墊、5 為粘性低襯、6為UCP結(jié)合物、7為檢測帶T線、8為質(zhì)控帶C線。圖2B中9為加樣孔、10為 結(jié)果判讀窗口、11為終點(diǎn)指示窗口。圖3為對比烘干法和凍干法方法差別。圖4為烘干法和凍干法制備的免疫層析試紙條的測量變異對比。圖5為本發(fā)明AFP-UPT試劑盒的對AFP定量標(biāo)準(zhǔn)品線性檢測結(jié)果。圖6為本發(fā)明AFP-UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光檢測試劑盒和AFP電化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒測定 AFP臨床樣本比較。圖7本發(fā)明CRP-UPT試劑盒對CRP定量標(biāo)準(zhǔn)品的線性檢測結(jié)果。圖8為為本發(fā)明CRP-UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光檢測試劑盒和免疫比濁法貝克曼CRP試劑盒測 定CRP臨床樣本比較。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本 發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要 求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法技術(shù)的免疫層析試紙條制備過程中采用烘干法和采用 凍干法時(shí)的差別及其對CV的影響A)對比烘干法和凍干法方法差別(如圖3所示)
凍干結(jié)合墊的制備UCP顆粒采購自上海科潤光電技術(shù)有限公司，玻璃纖維、纖維 素膜采購自Millipore公司、塑料卡和吸水墊購買自上海金標(biāo)生物科技有限公司，塑料卡 購買自深圳市金燦華實(shí)業(yè)有限公司。a)將50ml UCP標(biāo)記物(UCP-生物分子)懸濁液，以12000rpm在4°C下離心30min，
棄去上清液；b)在UCP沉淀物中加入5ml的保存液(pH = 7. 2的0. 15M磷酸緩沖液，含2wt% BSA 和 0. 05wt% NaN3)，吹打混勻；c)加入 45ml 的凍干液(pH = 7. 2 的 0. 15M 磷酸緩沖液，含 4. 2wt% BSA,5. 6wt% 海藻糖和1.5wt%甘氨酸)；d)將UCP標(biāo)記物懸濁液按12. 5ml/cm2加于玻璃纖維上；e)將玻璃纖維在-80°C下，預(yù)凍0. 5h ；真空凍干2h ；f)裁剪玻璃纖維，裝塑料卡烘干法制備結(jié)合墊的步驟a) d)與凍干結(jié)合墊的制備相同，e):將玻璃纖維在37°C的鼓風(fēng)干燥箱中2小時(shí)。f)裁剪玻璃纖維，裝塑料卡B)兩種生產(chǎn)方法的成品(C反應(yīng)蛋白CRP上轉(zhuǎn)發(fā)光法免疫層析試紙條)進(jìn)行CV檢 測對比取高、低濃度血清各一份，用兩種方法制備的試紙條測量，同一份血清用每種試紙 條各測10次，計(jì)算10次測量結(jié)果的變異系數(shù)(CV)。結(jié)果如圖4及表1和表2所示表1高濃度血清測量結(jié)果(單位ng/ml)
權(quán)利要求
1.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條，其特征在于含有上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 (UCP)-生物分子顆粒的結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊是經(jīng)凍干的。
2.權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于分析膜為硝酸纖維素膜。
3.權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其中所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括 加樣孔、結(jié)果判讀窗口和終點(diǎn)指示窗口。
4.權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其中通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品 墊上；結(jié)果判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點(diǎn)指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的 終點(diǎn)指示帶。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條，其中所述生物分子選自AFP抗體、CRP 抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫 特羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗體、乙肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。
6.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條的方法，其中在制備結(jié)合墊或 結(jié)合物稀釋墊的過程中，所述結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊是經(jīng)凍干的。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述制備結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊的過程包括a)將UCP-生物分子懸濁液離心并棄上清；b)向a)步驟得到的UCP-生物分子沉淀物中加入U(xiǎn)CP保存液，吹打混勻；c)向b)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加入凍干液；d)將c)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加于玻璃纖維上；e)將玻璃纖維放于_80°C下，預(yù)凍時(shí)間0.5小時(shí)，真空凍干2小時(shí)。
8.權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述UCP保存液為pH7.2的0. 15M的磷酸緩沖液， 含有2wt% BSA和0. 05wt%NaN3,所述凍干液為pH7. 2的0. 15M的磷酸緩沖液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1. 氨酸。
9.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析快速試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1-4任 一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述免疫層析試紙條中的生物分子選自AFP抗體、 CRP抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克 倫特羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗體、乙肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種免疫層析試紙條的生產(chǎn)方法及應(yīng)用這種生產(chǎn)方法而制備的甲胎蛋白快速定量免疫層析試紙條和C反應(yīng)蛋白快速定量免疫層析試紙條。該層析試紙條采用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物。其結(jié)構(gòu)主要包括樣品墊、結(jié)合墊或結(jié)合物稀釋墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料卡組成。本發(fā)明涉及了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)這種上轉(zhuǎn)發(fā)光法免疫層析試紙條的方法、使用方法。應(yīng)用該上轉(zhuǎn)發(fā)光檢測免疫層析試紙條可快速、簡便、定量的測定被檢測物的含量，準(zhǔn)確的對疾病進(jìn)行，為疾病的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/52GK102116770SQ20091026278
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者周蕾, 李華柏, 楊瑞馥, 林長青 申請人:北京熱景生物技術(shù)有限公司, 周蕾, 楊瑞馥