本發(fā)明涉及核酸收集和儲(chǔ)存的領(lǐng)域，并且具體涉及核的收集和長(zhǎng)期儲(chǔ)存。本發(fā)明提供了一種裝置和方法，其可用于在周?chē)鷾囟认虏东@和儲(chǔ)存核，允許通過(guò)以清洗緩沖液的被動(dòng)清洗來(lái)隨后隔離核酸。本發(fā)明在核酸的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和容易處理中得到應(yīng)用，并且在基因分型、診斷和取證中為特別有用的。

背景技術(shù)：

將血液從資源有限的區(qū)域運(yùn)輸?shù)奶魬?zhàn)是公知的，并且促進(jìn)允許血樣的干燥和郵寄的紙基介質(zhì)的開(kāi)發(fā)。這被廣泛采用，包括世界衛(wèi)生組織，提供了HIV和其它人類(lèi)病原體和甚至感染鳥(niǎo)類(lèi)、動(dòng)物和植物的那些的流行病調(diào)查。核酸在濾紙或化學(xué)改性的基質(zhì)上的長(zhǎng)期儲(chǔ)存、運(yùn)輸和歸檔是用于在以在基因分析如聚合酶鏈反應(yīng)中使用的形式抽取和隔離DNA或RNA之前保存基因材料的公知技術(shù)。

EP1563091(Smith等人，Whatman)涉及用于儲(chǔ)存來(lái)自樣本如細(xì)胞或細(xì)胞溶解產(chǎn)物的核酸的方法。核酸在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)，在室溫和室內(nèi)濕度下隔離和儲(chǔ)存在多種過(guò)濾器和其它類(lèi)型的固體支承物或固相介質(zhì)上。此外，該文獻(xiàn)描述了用于將含核酸的樣本儲(chǔ)存在管、柱或多孔板中的寬范圍的固體支承基質(zhì)上的方法。

WO9003959(Burgoyne)描述了用于儲(chǔ)存DNA，包括血液DNA的基于纖維素的固體支承物，其包括具有防止并入到基質(zhì)中或吸收在基質(zhì)上的DNA的退化的化合物或成分的固體基質(zhì)。該文獻(xiàn)還公開(kāi)了用于使用固體介質(zhì)儲(chǔ)存DNA以及DNA的回收或原地使用的方法。

US5705345(Lundin等人)描述了核酸制備的方法，由此包含細(xì)胞的樣本溶解來(lái)釋放核酸，并且樣本以環(huán)糊精處理來(lái)中和提取物。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，其消除了除去溶解試劑所需的分離步驟的需要。

GB2346370(Cambridge Molecular Technologies有限公司)公開(kāi)了方法，其涉及將包含核酸的細(xì)胞樣本施加于過(guò)濾器、溶解細(xì)胞，接著將核酸固持在過(guò)濾器上同時(shí)除去污染物。

WO9618731(Deggerdal)描述了隔離核酸的方法，由此樣本粘合于固體支承物，并且樣本與清潔劑接觸，并且執(zhí)行后續(xù)步驟來(lái)隔離核酸。

WO0053807(Smith)公開(kāi)了用于可洗脫和分析的包含基因材料的樣本的儲(chǔ)存和溶解的介質(zhì)。介質(zhì)涂覆有溶解試劑，并且可選具有弱堿、螯合劑、表面活性劑或尿酸。

Nuclitip?(GE Healthcare；US5447864中所述，Kenrick等人)是一定數(shù)量的已知核捕獲裝置中的一種，并且由處理達(dá)到10ml的新鮮血液的移液管的末梢的微絲織物構(gòu)成。血液經(jīng)歷受控的溶解；細(xì)胞膜溶解，使大部分核膜完好。平面的處理的膜位于Nuclitip移液管末梢的外部上，完全覆蓋末梢的孔口，使得樣本在進(jìn)入到末梢中之前過(guò)濾，并且存在于樣本中的任何DNA和核粘合于過(guò)濾器。移液管末梢接著以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗來(lái)除去任何污染物。US5447864描述了使用nuclitip方法分離細(xì)胞的細(xì)胞組分的方法，以及在-20℃或更低下在膜上儲(chǔ)存核達(dá)較長(zhǎng)時(shí)段并且如果在4℃下保持，則儲(chǔ)存達(dá)短時(shí)段的可能性。該文獻(xiàn)并未公開(kāi)或提出細(xì)胞核在周?chē)鷾囟认碌拈L(zhǎng)期儲(chǔ)存。此外，該文獻(xiàn)提出了包括使用清潔劑來(lái)溶解核膜的標(biāo)準(zhǔn)核酸提取技術(shù)的使用。

生物樣本的常溫儲(chǔ)存看作是低溫下儲(chǔ)存的更好的備選方案。然而，常溫儲(chǔ)存并未廣泛替代目前生物樣本庫(kù)中如此典型的冷鏈運(yùn)輸和冷凍器儲(chǔ)存的使用。GE Healthcare的FTA?和903?紙介質(zhì)的應(yīng)用限于幾十或幾百微升的血液的儲(chǔ)存，其典型地僅提供分布在纖維素的大區(qū)之上的達(dá)到1μg的DNA。

一定數(shù)量的國(guó)際前瞻性研究招募了幾千參與者以圖調(diào)查出生活環(huán)境、生活方式和遺傳學(xué)與疾病的發(fā)作之間的關(guān)聯(lián)。例如，歐洲癌癥與營(yíng)養(yǎng)前瞻性調(diào)查和加拿大伙伴明日計(jì)劃。研究依靠在開(kāi)始對(duì)參與者的深入分析，以及未來(lái)的某時(shí)診斷出顯著威脅生命的疾病之后的隨后的DNA分析。在進(jìn)行大型群體研究時(shí)，需要4ml或更多的適度血量，以允許使用當(dāng)代和進(jìn)化的技術(shù)的樣本的基因分析。理想的樣本應(yīng)當(dāng)包含將允許其它重要分子的附加調(diào)查的材料，例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

此類(lèi)大型前瞻性基因篩查研究需要比使用FTA?和903?紙介質(zhì)可能的更多的每名患者的DNA。典型地，前瞻性基因篩查研究需要在10-200μg基因組DNA的區(qū)域中。許多團(tuán)體(group)勉強(qiáng)保持冷凍的Vacutainer?管。

共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朑B1313146.1教導(dǎo)了用于將細(xì)胞核在周?chē)鷾囟认聝?chǔ)存在可滲透膜上達(dá)延長(zhǎng)時(shí)段內(nèi)的方法。該方法涉及選擇性地溶解存在于細(xì)胞樣本中的細(xì)胞質(zhì)膜和小比例的核膜來(lái)使大比例的細(xì)胞核完好，接著將細(xì)胞樣本收集在可滲透的膜上，以及接著清洗可滲透的膜，以及在周?chē)鷾囟认聦⑼旰玫暮藘?chǔ)存在可滲透的膜上?？蓾B透的膜還可在儲(chǔ)存之前浸沒(méi)在有機(jī)溶劑，如乙醇或異丙醇中。該方法敘述為可應(yīng)用于處理具有大于10ml的體積的細(xì)胞樣本和達(dá)到20年的儲(chǔ)存時(shí)段。在實(shí)例中，2ml的人全血(收集在EDTA管中)加至溶解緩沖液，并且核使用多個(gè)Nuclitips?捕獲，在周?chē)鷾囟认虑逑床⑶覂?chǔ)存達(dá)60天，其中核酸質(zhì)量在儲(chǔ)存時(shí)段內(nèi)被保持。

盡管實(shí)現(xiàn)較大量的核酸的周?chē)鷾囟葍?chǔ)存，但專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朑B1313146.1中的利用多個(gè)Nuclitips?的例舉方法為相對(duì)麻煩的。因此，所需的是針對(duì)目前和未來(lái)的分析研究在周?chē)鷾囟认聝?chǔ)存大體積的細(xì)胞核的改進(jìn)手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種裝置(1)，其包括：

(i)容器(2)，其具有開(kāi)口的上端(3)和密封的下端(4)，以及由室壁(6)限定在其間的室(5)；

(iii)插棒(7)，其包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本體(8)，其中所述壁(9)具有對(duì)應(yīng)于所述室(5)的形狀和小于所述室(5)的直徑，密封所述插棒本體(8)的頂端(11a)的隔膜蓋(10)，以及跨越所述插棒本體(8)的直徑(d)的固體支承物(12)。

在本發(fā)明的裝置(1)的一個(gè)實(shí)施例中，所述容器(2)包括中空管(13)和可除去的底座(14)。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述室容納溶解試劑。用于在本發(fā)明的背景下使用的特定溶解試劑是紅細(xì)胞溶解緩沖液，其非限制性實(shí)例是包含非離子表面活性劑的緩沖液，如，蔗糖-聚氧乙烯醚類(lèi)緩沖液，即，包含蔗糖和Triton X-100(聚氧乙烯辛基苯酚)的緩沖液。此類(lèi)紅細(xì)胞溶解緩沖液是在本發(fā)明的裝置用于下文中所述的本發(fā)明的方法中的情況下所需的，其中引入到容器中的細(xì)胞樣本是全血樣本。溶解試劑可為水，其中本發(fā)明的裝置用于本發(fā)明的方法中，其中細(xì)胞樣本為唾液樣本。在一個(gè)實(shí)施例中，溶解試劑為陰離子表面活性劑，其非限制性實(shí)例包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂醇硫酸酯銨鹽、月桂醇醚硫酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉和硬脂酸鈉。

在本發(fā)明的裝置(1)的一個(gè)實(shí)施例中，所述室(5)還包含收集緩沖液。

在裝置(1)的一個(gè)實(shí)施例中，所述固體支承物(12)為可滲透的膜，其例如選自由聚酯膜、聚酰胺膜、聚碳酸酯膜和纖維素膜構(gòu)成的組。在特定實(shí)施例中，所述固體支承物為聚酯膜。

在本發(fā)明的裝置(1)的一個(gè)實(shí)施例中，所述固體支承物(12)位于所述插棒本體(8)的底端(11b)處。在裝置(1)的特定實(shí)施例中，所述插棒本體(8)的所述底端(11b)密封所述容器(2)的上端(3)，并且其中所述室(5)包括真空。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種方法，其包括：

(i)將細(xì)胞樣本(15)引入到容器(2)中，其中所述容器(2)具有開(kāi)口的上端(3)和密封的下端(4)，以及由室壁(6)限定在其間的室(5)，其中所述容器(2)容納收集緩沖液，其包括溶解試劑，該溶解試劑在足以選擇性地溶解存在于細(xì)胞樣本(15)中的細(xì)胞質(zhì)膜和小比例的核膜并且使大比例的細(xì)胞核完好的濃度下；

(ii)將插棒(7)插入到所述容器(2)的上端(3)中，其中所述插棒(7)包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本體(8)，其中所述壁(9)具有對(duì)應(yīng)于所述室(5)的形狀和小于所述室(5)的直徑，密封所述插棒本體(8)的頂端(11a)的隔膜蓋(10)，以及跨越所述插棒本體(8)的直徑(d)的固體支承物(12)；

(iii)朝所述容器(2)的所述下端(4)壓制所述插棒(7)，以使所述固體支承物(12)穿過(guò)所述細(xì)胞樣本(15)，并且細(xì)胞核和其它細(xì)胞組分粘合于固體支承物，留下濾液；以及

(iv)除去所述濾液。

在本發(fā)明的方法的各種實(shí)施例中，所述溶解試劑和所述固體支承物如下文中關(guān)于本發(fā)明的裝置的各種實(shí)施例限定。

在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞樣本(15)具有大于1ml，特別是大于5ml并且更特別是大于10ml的體積。

在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述完好的細(xì)胞核包含核酸。所述核酸具體包括脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法還包括在周?chē)鷾囟认聦⑼旰玫暮藘?chǔ)存在固體支承物(12)上的步驟(v)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括在所述清洗步驟(iv)之后和所述儲(chǔ)存步驟(v)之前將固體支承物(12)浸沒(méi)在有機(jī)溶劑中的附加步驟。有機(jī)溶劑可為酒精。適合的酒精的非限制性實(shí)例包括乙醇和異丙醇。

在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述固體支承物(12)在所述儲(chǔ)存步驟(v)之前被空氣干燥。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括從完好的核回收核酸的附加步驟(vi)。在特定實(shí)施例中，所述回收步驟包括溶解固體支承物(12)上的完好的核。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述回收步驟包括在完好的核的溶解之后的離心分離(具體是使用微型離心機(jī))。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述回收步驟前接被動(dòng)清洗所述固體支承物(12)。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞樣本(15)直接從受驗(yàn)者引入到所述容器(2)中。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種套件，其包括本發(fā)明的裝置和用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的指令。下文中所述的本發(fā)明的方法和裝置的所有實(shí)施例適用于本發(fā)明的套件。

附圖說(shuō)明

圖1示出了樣本可如何使用移液管(末梢由"p"指出)加至本發(fā)明的裝置(1)的容器(2)的室(5)。

圖2示出了本發(fā)明的裝置(1)和插棒(7)插入到圖1的容器(2)中。

圖3示出了圖2的裝置(1)，其中插棒(7)向下推入容器(2)的室(5)中。

圖4示出了來(lái)自圖2和3的裝置(1)，其中容器(2)的可除去的底座(14)被除去，容許了接近跨越插棒本體(8)的直徑(d)的固體支承物(12)。

圖5示出了本發(fā)明的裝置(1)，其中插棒(7)插入到容器(2)中，并且真空在容器(2)的室(5)內(nèi)產(chǎn)生(由箭頭指出)。

圖6示出了圖5的裝置(1)在真空在容器(2)的室(5)中產(chǎn)生之后收集細(xì)胞樣本(15)的使用。

圖7示出了圖5和6的裝置，其中插棒(7)向下推入容器(2)中，以使固體支承物(12)穿過(guò)收集的細(xì)胞樣本中的一些(15b)，并且在進(jìn)一步推動(dòng)時(shí)，將穿過(guò)其余的細(xì)胞樣本(15a)。

具體實(shí)施方式

為了更清楚且簡(jiǎn)明地描述和指出要求權(quán)利的本發(fā)明的主題，定義在下文中的描述中提供用于遍及本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求使用的特定用語(yǔ)。本文中的特定用語(yǔ)的任何例舉應(yīng)當(dāng)看作是非限制性實(shí)例。

用語(yǔ)"容器"是指適合于收集細(xì)胞樣本的任何容器。適合的容器由塑料制成，并且是大致圓柱形的。出于該目的的適合塑料的非限制性實(shí)例包括聚丙烯和聚碳酸酯。容器的室具有在2到10ml的范圍中，在一個(gè)實(shí)施例中在4到10ml的范圍中，并且在另一個(gè)實(shí)施例中在4到8ml的范圍中的容積。在某些實(shí)施例中，容器包括真空室。容器可包括連接于可除去的不透液體的底座的中空管。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置可按類(lèi)似于用于采血的已知Vacutainer?管的方式向最終使用者提供已經(jīng)存在于室中的真空。在該實(shí)施例中，真空使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在制造過(guò)程期間產(chǎn)生。隨著時(shí)間的過(guò)去，此類(lèi)裝置中的真空釋放，故在另一個(gè)實(shí)施例中，可提供本發(fā)明的裝置，其中最終使用者可在室中產(chǎn)生真空。在該后一實(shí)施例中，還可能在不在室中產(chǎn)生真空的情況下制造裝置，以使最終使用者產(chǎn)生真空，例如僅在使用裝置之前。用于最終使用者產(chǎn)生真空的一種方式可在插棒處于降低位置的情況下開(kāi)始，并且接著在向上拉插棒的同時(shí)閉合裝置上的任何端口。一旦產(chǎn)生真空，則將需要保持直至裝置的使用并且包括裝置的使用。保持真空的方法包括簡(jiǎn)單地保持插棒向上。作為備選，設(shè)想的是，裝置包括固持機(jī)構(gòu)，以一旦產(chǎn)生真空則保持插棒向上，但這可容易中斷，以允許裝置用于收集細(xì)胞樣本。適合的固持機(jī)構(gòu)的非限制性實(shí)例包括在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)內(nèi)的類(lèi)型的銷(xiāo)、套環(huán)和彈簧機(jī)構(gòu)。

用語(yǔ)"密封的"本文中意思是不透液體的，但不一定是永久地密封的。在一些實(shí)施例中，裝置充分地密封來(lái)保持室中的真空，例如，以一個(gè)或更多個(gè)密封環(huán)，如，置于室壁與插棒之間的空間中的O形環(huán)。

用語(yǔ)"插棒"是指本發(fā)明的裝置的構(gòu)件，其配合到容器中并且包括固體支承物，該固體支承物在下端處跨越整個(gè)內(nèi)徑，以使固體支承物在插棒壓下時(shí)穿過(guò)容器中的細(xì)胞樣本。插棒本體的壁理想地具有略小于容器的室的直徑的直徑。

"隔膜蓋"可理解為并入可刺穿的隔膜的任何蓋(例如，由硅橡膠制成)。隔膜蓋為插棒的集成部分，并且用于保持裝置內(nèi)的任何真空，以及容許樣本或?yàn)V液在需要的情況下除去。此外，隔膜蓋容許使用裝置用于以類(lèi)似于Vacutainer?管的方式直接從受驗(yàn)者收集細(xì)胞樣本，即，其中蝶形針具有刺破受驗(yàn)者的靜脈的一端處的針和另一端處的管座，包括室中的真空的本發(fā)明的裝置可插入到該管座中，以便收集細(xì)胞樣本。

如本文中使用的用語(yǔ)"固體支承物"包括但不限于基于纖維素的產(chǎn)品、纖維素、醋酸纖維素、玻璃纖維、聚酯、聚酰胺和聚碳酸酯或它們的任何組合。本發(fā)明的固體支承物可為多孔的。

用語(yǔ)"溶解試劑"是指可用于溶解細(xì)胞膜并且選擇性地溶解細(xì)胞樣本中的細(xì)胞的核膜的任何試劑。用語(yǔ)"溶解"在本文中用于描述使結(jié)構(gòu)(如，細(xì)胞或亞細(xì)胞膜(包括核膜))破裂、變性或刺破的過(guò)程。

如本文中使用的用語(yǔ)"收集緩沖液"是指適合于收集細(xì)胞樣本用于隨后處理核和/或核酸的任何緩沖液。適合的收集緩沖液的非限制性實(shí)例包括檸檬酸鹽、肝素、酸檸檬酸、右旋糖和乙二胺四乙酸(EDTA)。在特定實(shí)施例中，收集緩沖液為EDTA。

在本發(fā)明的裝置的一個(gè)實(shí)施例中，室容納溶解緩沖液，但不包含收集緩沖液。該實(shí)施例特別適合于使用本發(fā)明的裝置來(lái)直接從受驗(yàn)者收集細(xì)胞樣本。

在本發(fā)明的上下文中，"受驗(yàn)者"為包含核的任何適合的真核生物，如，人類(lèi)、動(dòng)物、植物、鳥(niǎo)類(lèi)、昆蟲(chóng)和魚(yú)。

在用于將細(xì)胞核收集到固體支承物上的已知方法中，細(xì)胞樣本在單獨(dú)的步驟中收集到采血管中，并且接著儲(chǔ)存在制冷溫度下直到處理。通常，此類(lèi)冷凍的樣本從收集地點(diǎn)運(yùn)輸至位于別處的處理地點(diǎn)。在該背景下，需要具有存在的收集緩沖液來(lái)避免樣本的退化，例如，全血樣本的凝結(jié)，這將阻礙隨后的處理。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，樣本直接從受驗(yàn)者在原地收集，并且收集到裝置中。就此而言，不存在對(duì)待存在的收集緩沖液的要求。新鮮細(xì)胞樣本立即收集到溶解試劑中，故細(xì)胞樣本的任何退化(例如，血樣的凝結(jié))沒(méi)有時(shí)間產(chǎn)生任何影響，并且因此不需要借助于收集緩沖液來(lái)抑制。細(xì)胞樣本可在體溫下收集到裝置的室中到溶解緩沖液中，并且相比于其中低溫樣本將花費(fèi)較久來(lái)開(kāi)始溶解的已知方法，相當(dāng)比例的血細(xì)胞將立刻溶解。以該方式，清楚地相比于其中單獨(dú)地收集細(xì)胞樣本的已知方法，收集和處理完全新鮮的細(xì)胞樣本。根據(jù)該實(shí)施例收集的細(xì)胞樣本不包括收集緩沖液，并且因此包含較少化學(xué)雜質(zhì)，繼而意味著細(xì)胞樣本中存在可干擾其成功處理的較少雜質(zhì)，以及為完全新鮮的。

如本文中使用的，用語(yǔ)"細(xì)胞樣本"在本文中用于表示包含細(xì)胞材料的流體樣本。細(xì)胞材料可源自如上文中限定的任何適合的受驗(yàn)者。例如，細(xì)胞材料可為血液、唾液、尿液、血漿。

如本文中使用的"核酸"是指所有形式的RNA(例如，mRNA, InRNA, miRNA等)和DNA(例如，基因組DNA、線粒體DNA)，以及重組的RNA和DNA分子或使用核苷酸類(lèi)似物生成的DNA或RNA的類(lèi)似物，或它們的混合物。核酸分子可為單鏈的或雙鏈的。在一個(gè)實(shí)施例中，用語(yǔ)核酸具體是指基因組核酸。

本發(fā)明中的用語(yǔ)"其它細(xì)胞組分"是指在使用溶解試劑溶解之后的除存在于細(xì)胞樣本中的細(xì)胞核之外的其它固體細(xì)胞組分。除其它已知組分以外，這些細(xì)胞組分將包括破壞的細(xì)胞膜、其它細(xì)胞器、來(lái)自血樣的血紅蛋白以及蛋白質(zhì)如組蛋白。

用語(yǔ)"濾液"是指在本發(fā)明的方法中在固相穿過(guò)細(xì)胞樣本之后留下的流體。在本發(fā)明的方法中，該濾液將為在固相穿過(guò)細(xì)胞樣本之后并未變得粘合于固相的細(xì)胞樣本的任何組分。

如本文中使用的，詞語(yǔ)"儲(chǔ)存"用于描述將核酸保持或保存在穩(wěn)定狀態(tài)中的過(guò)程。

如本文中使用的用語(yǔ)"有機(jī)溶劑"是指適合于在細(xì)胞核儲(chǔ)存在固體支承物上時(shí)使用的任何烴基溶劑。

如本文中使用的，用語(yǔ)"周?chē)鷾囟?意思是在10℃到30℃，優(yōu)選15℃到26℃，更優(yōu)選18℃到23℃的范圍中的溫度。

用語(yǔ)"空氣干燥"是指在不施加附加的熱或壓力的情況下允許溶劑在周?chē)鷹l件下從固體支承物蒸發(fā)的過(guò)程。

用語(yǔ)"回收"是指大體上在儲(chǔ)存時(shí)段之后從固體支承物除去核酸的步驟。在該步驟中，粘合于固體支承物的任何細(xì)胞核被溶解，例如，由K蛋白酶消化或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它手段，并且接著從固體支承物除去從細(xì)胞核釋放的核酸(例如，使用離心分離)。

用語(yǔ)"被動(dòng)清洗"意思是將固體支承物浸泡在清洗緩沖液中，而不采用任何其它主動(dòng)步驟如振動(dòng)。被動(dòng)清洗可執(zhí)行為從固體支承物回收核酸的部分，并且可在儲(chǔ)存之前或之后執(zhí)行。在一個(gè)實(shí)施例中，被動(dòng)清洗在儲(chǔ)存之后和在粘合固體支承物的細(xì)胞核溶解來(lái)釋放核酸之后執(zhí)行。釋放的核酸具有高分子量，并且粘性高，因此保持結(jié)實(shí)地附接于固體支承物。因此，被動(dòng)清洗作用成從固體支承物釋放其它細(xì)胞組分，同時(shí)使釋放的核酸仍粘合。清洗緩沖液通過(guò)傾析或通過(guò)移液在浸泡之后連同其中的其它細(xì)胞組分除去。用語(yǔ)"清洗緩沖液"是指適合于從固體支承物除去其它細(xì)胞組分的任何緩沖溶液。適合的清洗緩沖液的非限制性實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和TE^-1(TE^-1為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、典型地包括10mM TRIS和1mM EDTA的10倍稀釋的TE緩沖液)。可執(zhí)行被動(dòng)清洗的一個(gè)或更多個(gè)步驟。

用語(yǔ)"離心分離"在本文中是指使用離心力來(lái)從固體支承物除去選擇的組分。當(dāng)具有細(xì)胞核的固體支承物經(jīng)受短的離心分離自旋時(shí)，這用于除去粘合于固體支承物的任何流體中的大多數(shù)，并且可用作本發(fā)明的方法的所述除去步驟的部分。離心分離還可用作在儲(chǔ)存、溶解細(xì)胞核和被動(dòng)清洗之后從固體支承物回收核酸的部分。典型地，微型離心機(jī)足以執(zhí)行用于本發(fā)明的離心分離。

用語(yǔ)"套件"是指收集一起提供的組分和試劑以便執(zhí)行本發(fā)明的方法。

圖1示出了適合于本發(fā)明的裝置(1)的容器(2)，其具有開(kāi)口的上端(3)和密封的下端(4)，其中室(5)由室壁(6)限定在其間。所示容器包括中空管(13)和可除去的底座(14)。可除去的底座(14)形成圍繞中空管(13)的不透液體的密封，以便產(chǎn)生適合于細(xì)胞樣本在容器(2)中的儲(chǔ)存和處理的室(5)。細(xì)胞樣本可單獨(dú)地收集在采血管(例如，EDTA管)中，并且樣本接著使用移液管(圖1中所示的移液管末梢"p")加至容器(2)。

圖2示出了與插棒(7)相關(guān)聯(lián)來(lái)形成本發(fā)明的裝置(1)的圖1的容器(2)。室(2)的構(gòu)件如上文針對(duì)圖1所述。插棒(7)包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本體(8)，其中這些壁(9)構(gòu)造成以使插棒本體(8)與容器(2)的室(5)相容地配合，并且可向下推入室(5)中，而不施加太大的力。插棒本體(8)的直徑(d)因此應(yīng)當(dāng)僅小于室(5)的直徑。在頂端(11a)處，插棒(7)包括隔膜蓋(10)。固體支承物(圖2中不可見(jiàn))定位在插棒的底端(11b)處。

圖3示出了圖2的裝置(1)，其中插棒(7)推入容器(2)的室(5)中。插棒本體(8)的底端(11b)鄰近容器(2)的下端(4)，在使固體支承物(圖3中不可見(jiàn))穿過(guò)收集在所述容器(2)中的細(xì)胞樣本(圖3中不可見(jiàn))之后將所處的位置。該位置還將為用于裝置(1)的儲(chǔ)存的位置。底座(14)可除去來(lái)容易接近粘合于固體支承物的核酸和/或核。圖4示出了在底座(14)除去的該狀態(tài)中的裝置(1)。

圖5示出了本發(fā)明的裝置(1)的真空收集實(shí)施例。箭頭示出了容器(2)的室(5)中的真空的產(chǎn)生。在所示實(shí)施例中，容器(2)包括中空管(13)和底座(14)，其中中空管(13)包括將室(5)連接于裝置(1)的外部的端口(13a)。端口(13a)如圖5中所示用于產(chǎn)生真空(以箭頭示出)，并且還如圖6中所示用于使細(xì)胞樣本(15)進(jìn)入到室(5)中。作為備選，當(dāng)側(cè)端口未使用時(shí)，圖2中所示的標(biāo)準(zhǔn)裝置(1)可使用，其中當(dāng)隔膜蓋(10)和容器(2)密封時(shí)，插棒(7)的拉動(dòng)產(chǎn)生負(fù)壓，并且接著插棒(7)升高。

圖6為如圖5中所示，但在真空在室(5)中產(chǎn)生之后，并且在將細(xì)胞樣本(15)經(jīng)由端口(13a)收集到室(5)中的過(guò)程中的同一裝置(1)。插棒(7)在本發(fā)明的方法的該階段處仍處于升高位置。圖7示出了方法的下一個(gè)階段，其中細(xì)胞樣本(15)被收集，并且插棒(7)向下壓入室(5)中，以使固體支承物(12)穿過(guò)細(xì)胞樣本(15)。

本發(fā)明利用了已知的能力來(lái)從幾毫升血液收獲細(xì)胞核，以用于典型地需要10到200μg基因組DNA的前瞻性基因篩查研究。相比于FTA?紙，核捕獲實(shí)現(xiàn)了80倍的提高。這是由于僅捕獲為高度密集的核染質(zhì)組的核。很可能的是，亞鐵血紅素和其它污染物的減輕的負(fù)擔(dān)將向基因組DNA提供更好質(zhì)量用于下游的處理。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置為Mini-UniPrep?類(lèi)型的裝置(GE Healthcare)，其設(shè)計(jì)成能夠充分地密封來(lái)耐受內(nèi)部負(fù)壓，并且允許血樣從受驗(yàn)者抽取，如一般利用Vacutainer?采血管(Becton Dickinson)的。本發(fā)明的該實(shí)施例包括特殊的緩沖液來(lái)溶解紅細(xì)胞，并且允許將白細(xì)胞或白細(xì)胞核捕獲在膜上。另外，本發(fā)明的實(shí)施例包括可除去的頂部和底座來(lái)允許接近捕獲的核。

在本發(fā)明的方法中，在以血液填充裝置并且與紅細(xì)胞溶解緩沖液傾覆地混合之后，插棒向上和向下移動(dòng)，以在想起(reminiscent)使用Nuclitip?和移液管來(lái)將流體來(lái)回泵送橫跨膜(US5447864中詳述)的過(guò)程中將細(xì)胞捕獲在膜上。一旦這執(zhí)行，則裝置開(kāi)啟，并且除去細(xì)胞或核的血液倒至廢物，并且由PBS和/或100%乙醇(或備選溶劑)以規(guī)定方式替換，以清洗和快速干燥捕集的細(xì)胞/核。

如共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朑B1313146.1中陳述的原理實(shí)驗(yàn)的證據(jù)顯示出干燥的核可在周?chē)鷾囟认卤３?周以上，而不影響DNA質(zhì)量，并且可預(yù)計(jì)到DNA的質(zhì)量將在許多年內(nèi)都很好。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，液體-FTA緩沖液(具有包括SDS、尿酸、TRIS和EDTA的典型成分的已知緩沖液)可在細(xì)胞核收集在固體支承物上之后施加于固體支承物，后接干燥，或者干有機(jī)溶劑如乙醇或工業(yè)變性酒精或異丙醇或類(lèi)似物可加入，以將管永久地保持在周?chē)鷾囟认?，直到可能在收集之后的幾十年，需要樣本。生物?biāo)本儲(chǔ)存在酒精中遍及自然歷史博物館使用，并且是認(rèn)可的方法。

根據(jù)本發(fā)明的方法處理的保存的核可在周?chē)鷾囟认逻\(yùn)輸并且接著放置來(lái)長(zhǎng)期儲(chǔ)存或置于生物樣本庫(kù)中。

當(dāng)樣本將處理時(shí)，存在兩個(gè)模式：

1. 整體制備。執(zhí)行簡(jiǎn)單SDS K蛋白酶消化和除去污染物來(lái)產(chǎn)生高產(chǎn)量的優(yōu)異質(zhì)量的基因組DNA用于所有下游分子生物應(yīng)用。這很可能需要裝置短暫離心分離來(lái)回收很大粘性的高分子量的基因組DNA。

2. 單個(gè)樣本的子部分。倒置管(干的或包含溶劑)，擰開(kāi)管的底座來(lái)露出核/細(xì)胞捕集在其中的膜的外頂面，并且使用小鏟或研磨棒，扭轉(zhuǎn)或刮擦來(lái)人工地或通過(guò)自動(dòng)系統(tǒng)除去附連的細(xì)胞或核的子部分。所述除去的樣本可進(jìn)一步處理或分配至生物樣本庫(kù)的客戶(hù)，同時(shí)大量原料可返回儲(chǔ)存(一旦端蓋放回原位并且管倒置在儲(chǔ)存位置)。猜想達(dá)到200個(gè)樣本(假定每次采樣100μg和0.5μg)可從一個(gè)裝置使用該方法獲得。

附圖中所述和所示的裝置可與自動(dòng)系統(tǒng)對(duì)接，以提供至常溫儲(chǔ)存庫(kù)中的成百上千的樣本的無(wú)人監(jiān)管的存取。裝置將具有與理想儲(chǔ)存密度和根據(jù)關(guān)鍵意見(jiàn)領(lǐng)袖的需要的所需產(chǎn)量相稱(chēng)的外徑。相比于運(yùn)營(yíng)基于低溫或液氮的生物樣本庫(kù)所需的大量金錢(qián)，該途徑是備選方法，以該方式，可在最小花費(fèi)下使用和維護(hù)基因儲(chǔ)存庫(kù)。作為維護(hù)成本的實(shí)例，當(dāng)代的生物樣本庫(kù)可預(yù)計(jì)每年花費(fèi)幾百萬(wàn)英鎊來(lái)擴(kuò)展它們的運(yùn)轉(zhuǎn)，花費(fèi)電力來(lái)用于低溫儲(chǔ)存和維護(hù)，以及具有氮的超低溫杜瓦瓶。該解決方案提供了剝離這些設(shè)施的運(yùn)營(yíng)成本中的一些同時(shí)保持儲(chǔ)存的采樣材料的完整性的機(jī)會(huì)。關(guān)于使用FTA?的限制利用本發(fā)明可行地解決，這是用于血液和生物樣本的儲(chǔ)存手段的可行解決方案。

本文中提供的設(shè)計(jì)和描述允許了在資源有限的區(qū)域中現(xiàn)場(chǎng)收集和預(yù)先處理血液，以及在周?chē)鷾囟认碌倪\(yùn)輸和生物樣本庫(kù)中的管理。