一種(s)?1?(2,6?二氯?3?氟苯基)乙醇的生物制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種(S)?1?(2,6?二氯?3?氟苯基)乙醇的生物制備方法，所述方法包括以下步驟：將共表達(dá)全細(xì)胞、2,6?二氯?3?氟苯乙酮、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合后反應(yīng)，在pH＝5～8、溫度為30～40℃下反應(yīng)，經(jīng)后處理得到目標(biāo)產(chǎn)物，其中共表達(dá)全細(xì)胞為含羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所采用的方法無需添加外源性輔酶，催化劑與反應(yīng)液極易分離，極大地簡化了工藝，降低生產(chǎn)成本，同時產(chǎn)物收率及ee值均較高，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】
-種(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的生 物制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 克挫替尼(Cr i Z 01 i n i b)是由輝瑞公司研制的抑制ALK/ME T/R0S的ATP競爭性的多 祀點蛋白激酶抑制劑，該藥在ALK、R0S和MET激酶活性異常的腫瘤患者中均被證實對人體有 顯著臨床療效。2011年克挫替尼被美國食品藥品管理局(抑A)批準(zhǔn)上市，2013年1月在我國 進口上市，商品名為"賽可瑞"，目前主要用于治療間變性淋己瘤激酶陽性的局部晚期和轉(zhuǎn) 移的非小細(xì)胞肺癌。其結(jié)構(gòu)式如下所示：
[000
[0004] (S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇是合成克挫替尼的關(guān)鍵中間體，國內(nèi)外對其制 備方法進行廣泛研究，目前制備方法包括化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法主要采用 手性催化劑不對稱還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬得到（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇 (CN103319311AXN201510820824等），該方法存在反應(yīng)條件苛刻、手性催化劑昂貴、產(chǎn)物手 性純度低及廢液處理成本高等問題。
[0005] 與化學(xué)合成法相比，生物合成法具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和立體選擇性強等 優(yōu)點。專利W02006021881、W02007066187、W02009036404公開了克挫替尼及關(guān)鍵中間體(S)- 1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的制備方法，主要是通過醋酶催化水解的方法合成關(guān)鍵中間 體，但該方法操作過程復(fù)雜，反應(yīng)時間長，收率低于50 %，難W實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 專利CN101851237報道了采用豬肝脂肪酶催化水解1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙基 醋酸醋進行選擇性拆分，該方法中原料1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙基醋酸醋需經(jīng)多步反應(yīng) 制備得到，催化工藝步驟較多，最終得率僅為49 %，后提取工藝復(fù)雜，不利于實現(xiàn)工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0007] 專利胖02006021885報道了不同生物催化劑還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬直接得到 (S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇，但反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率較低，當(dāng)用馬肝醇脫氨酶和輔酶NADH、 NADPH為催化劑時，轉(zhuǎn)化率為55 % ;當(dāng)用來源于化odutorula SP.的菌株Y2-UC2387為催化劑 時轉(zhuǎn)化率為57%，同時反應(yīng)時間較長高達(dá)7天，該方法目前難W實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[000引專利W02009036404報道了酬還原酶催化2,6-二氯-3-氣苯乙酬得到（S)-1-(2,6- 二氯-3-氣苯基）乙醇的方法，轉(zhuǎn)化率為94%。該方法中使用了兩種氧化還原酶酶粉W及外 源性輔酶NADP，反應(yīng)體系復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。此外，W酶粉作為催化劑時后處理過程乳化嚴(yán) 重，對提取效率和操作過程具有不利的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺陷，本發(fā)明公開了一種(S)-1-(2,6-二氯-3-氣 苯基)乙醇的生物制備方法，W此提高該產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
[0010] 具體工藝路線如下所示：
[0011；
[0012]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[OOU] 1)將能夠還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬到（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的酬還 原酶編碼基因與葡萄糖脫氨酶的編碼基因串聯(lián)插入同一表達(dá)載體中，構(gòu)建共表達(dá)重組菌， 通過兩種酶的共表達(dá)和細(xì)胞自帶的輔酶實現(xiàn)底物還原和輔酶循環(huán)的催化體系，無需添加外 源性輔酶；
[0014] 2)將上述共表達(dá)游離細(xì)胞或固定化全細(xì)胞、2,6-二氯-3-氣苯乙酬、葡萄糖、緩沖 液按一定比例混合，在pH=5~8、溫度為30~40°C下反應(yīng)1~48h。反應(yīng)混合液中共表達(dá)游離 細(xì)胞濃度為25~50g/L或者固定化全細(xì)胞濃度為100~200g/L、2,6-二氯-3-氣苯乙酬的濃 度為100~200g/L、葡萄糖濃度為100~200g/L和緩沖液的濃度為50~lOOmM。反應(yīng)結(jié)束后離 屯、或過濾回收細(xì)胞，用乙酸乙醋萃取、濃縮和結(jié)晶，目標(biāo)產(chǎn)物（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基） 乙醇摩爾收率大于90%、ee值大于99.9%。
[0015] 進一步說，所述幾基還原酶為高加索乳桿菌來源的酬還原酶突變體，所述葡萄糖 脫氨酶為枯草芽抱桿菌來源的葡萄糖脫氨酶突變體。
[001W 進一步說，緩沖液為憐酸鹽緩沖液或醋酸鋼緩沖液，優(yōu)選為憐酸鹽緩沖液。
[0017] 進一步說，所述基因工程菌選自重組大腸桿菌或重組畢赤酵母菌，其中優(yōu)選為重 組大腸桿菌化2UDE3)。
[0018] 進一步說，共表達(dá)細(xì)胞W游離細(xì)胞或固定化全細(xì)胞的形式加入，優(yōu)選W固定化全 細(xì)胞加入。
[0019] 進一步說，所述固定化全細(xì)胞制備方法為:將共表達(dá)游離細(xì)胞與固定劑混合、干燥 成型。
[0020] 進一步說，所述固定劑為聚乙二醇、聚丙締酷胺、聚乙締醇或海藻酸巧中的一種或 它們的組合，其中優(yōu)選為聚乙締醇。
[0021 ]進一步說，所述共表達(dá)游離細(xì)胞與所述固定劑的質(zhì)量比為1:1~1: 2。
[0022] 進一步說，所述固定化全細(xì)胞經(jīng)過濾后可W回收套用，套用次數(shù)為1~5次。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：（1)利用共表達(dá)細(xì)胞作為催化劑，無需添加 外源性輔酶，極大地簡化了工藝，降低生產(chǎn)成本；（2)利用固定化細(xì)胞進行催化反應(yīng)，細(xì)胞與 反應(yīng)液易分離，操作過程簡單，催化劑可重復(fù)利用，提高了生產(chǎn)效率；（3)反應(yīng)條件溫和，產(chǎn) 物收率及ee值均較高，反應(yīng)過程中W葡萄糖作為氨供體，價格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，便于工業(yè)化 生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024] 圖巧本發(fā)明實施例3中檢測的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的HPLC圖譜。
[0025] 圖2為本發(fā)明實施例3中檢測的產(chǎn)物ee值的手性HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作進一步的闡述，其目的是為了更好的 理解本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0027] 實施例1共表達(dá)重組菌的構(gòu)建
[00%]將全合成的KRED182基因作為模板進行PCR擴增并在兩端引入酶切位點（正向引物 引入Ncol酶切位點，反向引物引入化ndlll酶切位點），使用Nco巧肌indin對其酶切，并回 收得到KR抓基因片段。同時，提取pRSF-Duet載體的質(zhì)粒，也對其進行化〇1和化ndin酶切， 并回收酶切后的載體片段。將KR抓基因片段和載體片段使用T4連接酶進行連接，并轉(zhuǎn)化入 E. CO1 i BL21 (DE3)中，涂布Kan抗性平板，于37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待轉(zhuǎn)化子長出后，挑取若干單 克隆進行菌落PCR驗證，選取驗證結(jié)果為陽性的單克隆進行后續(xù)實驗，將該菌種命名為 KRED-1菌。然后提取KR抓菌質(zhì)粒，再使用Nde巧日趾〇1對其進行酶切，回收該載體片段；另一 方面，對GDH105基因進行PCR擴增，W全合成的基因為模板，并在兩端引物酶切位點化向引 物加入Ndel酶切位點，反向引物加入趾〇1酶切位點）回收后，也使用Nde巧日化〇1對其進行酶 切，并將GDH基因片段和KRED-1菌質(zhì)粒片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli BL2UDE3)中，涂布Kan抗性 平板，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌落長出后挑取單克隆進行菌落PC閲金證，選取陽性單克隆，即 得到共表達(dá)重組菌。
[0029] 實施例2共表達(dá)重組菌游離細(xì)胞及固定化全細(xì)胞的制備
[0030] 共表達(dá)游離細(xì)胞可W經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得，發(fā)酵培養(yǎng)基使用2YT培養(yǎng)基，含有16g/L 蛋白腺，lOg/L酵母粉，5g/L化Cl，2g/L甘油。具體步驟如下:首先將該菌種接種于裝有50mL 培養(yǎng)基的小搖瓶(容量250ml)中，于37°C搖床培養(yǎng)12h對菌種進行活化，然后將活化后的菌 體接種入裝有400mL培養(yǎng)基的大搖瓶（容量1L，帶擋板）中，接種量8ml，于37°C搖床培養(yǎng)至 0D600nm達(dá)到0.6-1.0時，加入IPTG至終濃度為0.1 mM，于25°C搖床誘導(dǎo)表達(dá)20h后離屯、收集 共表達(dá)細(xì)胞，即為游離細(xì)胞。
[0031] 稱取300g聚乙締醇加入3.化水中，升溫至90-95 °C，攬拌直至聚乙締醇完全溶解后 降溫至25-30°C。向上述溶液中加入200g共表達(dá)細(xì)胞，攬拌化后，用蠕動累和塑料排槍吸取 混合液注在平面上形成圓片狀，干燥箱30°C干燥比，移入0.1M化2S化溶液穩(wěn)定化后濾干，清 水洗涂兩次，得到800g固定化全細(xì)胞。
[0032] 實施例3共表達(dá)游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0033] 于25mL反應(yīng)容器中加入lOOmM的憐酸鹽緩沖液（lOmL，抑= 6.0)、葡萄糖（3.0g)及 底物2，6-二氯-3-氣苯乙酬(3. Og)，定容至15mL，攬拌均勻后共表達(dá)游離細(xì)胞(750mg)，35°C 下磁力攬拌反應(yīng)，化20)3(20%，w/v)控制反應(yīng)抑在6.0左右，TLC檢測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后 離屯、去除細(xì)胞，等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干即得產(chǎn) 品（S)-1-(2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇2.84g，產(chǎn)物摩爾收率為94%、ee值大于99.9 % dHPLC檢 測轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物ee值，轉(zhuǎn)化率>99%，S型產(chǎn)物ee值>99%，檢測結(jié)果分別見圖1(底物保留時 間為6.7min，產(chǎn)物保留時間為4. Omin)和圖2 (S型產(chǎn)物保留時間為16.3min，R型產(chǎn)物保留時 間為 17.6min)。
[0034] 實施例4共表達(dá)游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0035] 于25mL反應(yīng)容器中加入70mM的憐酸鹽緩沖液（10血，抑=8.0)、葡萄糖(2g)及底物 2,6-二氯-3-氣苯乙酬(2g)，定容至15血，攬拌均勻后共表達(dá)游離細(xì)胞(375mg)，35°C下磁力 攬拌反應(yīng)，化20)3(20%，w/v)控制反應(yīng)抑在8.0左右，TLC檢測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后離屯、去 除細(xì)胞，等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干即得產(chǎn)品（S)- 1-( 2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇1.88g，產(chǎn)品純度為97 %，產(chǎn)物摩爾收率為93 %、ee值大于 99.9%。
[0036] 實施例5固定化全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0037] 于25mL反應(yīng)容器中加入lOOmM的憐酸鹽緩沖液（lOmL，抑=6.5)、葡萄糖（3.0邑)及 底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（3.0g)，定容至15mL，攬拌均勻后加入固定化全細(xì)胞(3g)，30°C 下磁力攬拌反應(yīng)，化20)3(20%，w/v)控制反應(yīng)抑在6.5左右，TLC檢測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后 過濾回收固定化全細(xì)胞，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干 燥，減壓旋干即得產(chǎn)品（S)-1-(2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇2.89g，產(chǎn)品純度為96%，產(chǎn)物摩爾 收率為95 %、ee值大于99.9 %。
[0038] 實施例6公斤級(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的制備
[0039] 向帶夾套的玻璃反應(yīng)蓋(2化）中加入50mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=6.0)、葡萄糖 (3.0kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（3.0kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入固定化全細(xì)胞 (3kg)，35 °C攬拌反應(yīng)，化0H(0.5M)控制反應(yīng)抑在6.0左右，TLC檢測轉(zhuǎn)化率達(dá)到99 %后結(jié)束 反應(yīng)，過濾回收固定化全細(xì)胞。濾液調(diào)節(jié)抑至2.0左右，60 °C保溫化，加入娃藻±攬拌15min 后過濾，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干，即得 產(chǎn)品2.8kg，摩爾收率為92 %，產(chǎn)品純度為97 %，產(chǎn)物ee值>99.9 %。
[0040] 實施例7公斤級(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇的制備
[0041 ]向帶夾套的玻璃反應(yīng)蓋(2化）中加入80mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=7.0)、葡萄糖 (2kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（1.5kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入固定化全細(xì)胞 (1.54肖），35°(：攬拌反應(yīng)，化細(xì)(0.51)控制反應(yīng)抑在7.0左右，化(：檢測轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%后結(jié) 束反應(yīng)，過濾回收固定化全細(xì)胞。濾液調(diào)節(jié)pH至2.0左右，60°C保溫化，加入娃藻±攬拌 15min后過濾，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取S次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋 干，即得產(chǎn)品1.38kg，摩爾收率為91 %，產(chǎn)品純度為98 %，產(chǎn)物ee值>99.9 %。
[0042] 實施例8用回收固定化全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0043] 向帶夾套的玻璃反應(yīng)蓋(2化）中加入50mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=6.0)、葡萄糖 (3.0kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬(3.0kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入實施例6回收套 用的固定化全細(xì)胞(3kg)，35°C攬拌反應(yīng)，化0H(0.5M)控制反應(yīng)pH在6.0左右，TLC檢測轉(zhuǎn)化 率達(dá)到99 %后結(jié)束反應(yīng)，過濾回收固定化細(xì)胞。濾液調(diào)節(jié)pH至2.0左右，60°C保溫化，加入娃 藻±攬拌15min后過濾，濾液等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓 旋干，即得產(chǎn)品2.73kg，摩爾收率為90 %，產(chǎn)品純度96 %，產(chǎn)物ee值>99.9 %。
[0044] 將實施例6的固定化細(xì)胞進行依次回收套用，反應(yīng)條件及后處理過程同實施例6， 套用效果如下表所示：
[0045]
[0046]
【主權(quán)項】
1. 一種(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇的生物制備方法，其特征在于:將共表達(dá)全細(xì) 胞、2,6_二氯-3-氟苯乙酮、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合后反應(yīng)得到產(chǎn)物，所述共表達(dá) 全細(xì)胞為含羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述共表達(dá)全細(xì)胞為固定化全細(xì)胞，反應(yīng)中 所述固定化全細(xì)胞濃度為100~200g/L。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述共表達(dá)全細(xì)胞為游離細(xì)胞，反應(yīng)中所述 游離細(xì)胞濃度為25~50g/L。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述羰基還原酶為高加索乳桿菌來源的酮還 原酶突變體，所述葡萄糖脫氫酶為枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶突變體。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述2,6_二氯-3-氟苯乙酮的濃度為100~ 200g/L、所述葡萄糖濃度為100~200g/L、所述緩沖液的濃度為50~100mM，反應(yīng)在pH=5~ 8、溫度為30~40 °C下進行。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或醋酸鈉緩沖 液。7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述游離細(xì)胞由基因工程菌發(fā)酵得到，所述 基因工程菌選自大腸桿菌或酵母菌。8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述固定化全細(xì)胞的制備方法為將共表達(dá)游 離細(xì)胞與固定劑混合、干燥成型，所述共表達(dá)游離細(xì)胞與所述固定劑的質(zhì)量比為1:1~1: 2。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述固定劑為聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯 醇或海藻酸鈣中的一種或它們的組合。
【文檔編號】C12N11/08GK106047950SQ201610504004
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】竺偉, 高新星, 胡集鋮, 吳會
【申請人】尚科生物醫(yī)藥（上海）有限公司