一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法。具體步驟如下：（1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)中，將功能單體4?巰基苯硼酸與適量催化劑溶于溶劑中，磁力攪拌混合均勻；（2）加入炔基修飾的硅膠并在65℃溫度下，恒溫反應(yīng)10?70小時。反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用甲醇，水，甲醇三種溶劑進(jìn)行沖洗。洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的硼酸硅膠前處理材料。
【專利說明】
一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖蛋白作為一類重要的翻譯后修飾蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫及腫瘤發(fā)生等生物學(xué) 過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的發(fā)現(xiàn)與鑒定在疾病的診斷和蛋白質(zhì)組學(xué) 領(lǐng)域意義重大。目前，用于N連接糖肽富集的主要方法有凝集素、酰肼、親水作用色譜、硼酸 親和色譜等。對于具有1，2_順式二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖型，苯硼酸可以與其形成可逆的五元或 者六元環(huán)的酯，同時苯硼酸具有親水性，能夠與糖肽選擇性結(jié)合。硼酸材料對糖肽的富集選 擇性集親和和親水作用力為一體，不僅能夠避免糖鏈結(jié)構(gòu)遭到破壞，而且所富集的產(chǎn)物與 質(zhì)譜兼容，對于研究糖蛋白糖基化位點(diǎn)信息及糖型結(jié)構(gòu)歸屬較為方便。因此，硼酸在糖肽的 選擇性富集領(lǐng)域受到了人們的關(guān)注。而由硼酸為鍵合相開發(fā)的親和材料也在糖蛋白或糖肽 選擇性富集中起到了越來越重要的作用。
[0003] 點(diǎn)擊化學(xué)指的是一類轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)率高，操作簡便，綠色環(huán)保的化學(xué)反應(yīng)，廣泛的 應(yīng)用在生物，藥物等領(lǐng)域。我們課題組曾經(jīng)將點(diǎn)擊化學(xué)(Click Chemistry)用于合成硅膠基 質(zhì)的色譜固定相，相應(yīng)的文章發(fā)表在國際知名期刊上（Journal of Chromatography A 2009, 1216: 257-263；Chemical Communications 2007, 2491-2493；Chemical Communications 2006, 4512-4514；Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011， 399,3359-3365; Talanta, 78 (2009) 916-921; Journal of separation science, 33: 9 (2010) 1224-1230; Analytical Method, 2012,4, 1244-1251)。這些方法采用的均是 銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，雖然得到較高的反應(yīng)效率，但是反應(yīng)過程中引入銅這個重金屬，會 給色譜分離帶來影響，因此有必要加以改進(jìn)。無銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)以其高轉(zhuǎn)化率，高產(chǎn)率， 以及避免銅的引入，引起了研究人員的重視。以2,2'_偶氮二異丁腈催化的炔基和巰基反應(yīng) 的點(diǎn)擊化學(xué)方法就是一種無銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（J. AM. CHEM. S0C. 2009，131， 14673-14675)，相比較而言，合成轉(zhuǎn)化率高，且沒有銅離子的引入，是一種理想的化學(xué)反應(yīng)。 然而這種方法目前沒有引入到色譜填料制備中，而且用于硼酸硅膠前處理材料的制備也未 見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種基于無銅催化的硼酸硅膠前處理材料制備方法， 具體步驟如下： (1) 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2，2 偶氮二異丁腈加入功能單體4-巰基苯硼酸的甲醇溶液中磁力 攪拌混合均勻； (2) 在攪拌的溶液中加入炔基修飾的硅膠，并在65°C條件下將樣品反應(yīng)10-70小時； (3) 反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用甲醇，水，甲醇等溶劑進(jìn)行沖 洗。洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的硼酸硅膠前處理材料。
[0005] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，步驟2中所述的材料為炔基硅膠材料，為實(shí)驗(yàn)室自 制，制備和表征方法均參照文獻(xiàn)(Chem. Commun. 2007，2491-2493);溶劑為甲醇。
[0006] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，炔基硅膠材料、4-巰基苯硼酸與溶劑的重量比為 1:0 · 2~5:5~100，優(yōu)選為1:0 · 8:20。
[0007]在本發(fā)明再一個實(shí)施方案中，步驟(2)中所述催化劑為2,2'_偶氮二異丁腈，4-巰 基苯硼酸與催化劑的重量比為24:1，反應(yīng)溫度優(yōu)選為65°C，反應(yīng)時間為48小時。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面將進(jìn)一步的來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要 求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所 附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0009] 實(shí)施例1 (1) 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2,2'_偶氮二異丁腈(160 mg)加入功能單體4-巰基苯硼酸(3.8 g) 的甲醇溶液(50 mL)中磁力攪拌混合均勻； (2) 在攪拌的溶液中加入炔基修飾的硅膠，并在65°C條件下將樣品反應(yīng)24小時； (3) 反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用甲醇(500mL)，水(500mL)，甲醇 (200mL)進(jìn)行順序沖洗。洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的硼酸硅膠前處理材料。
[0010] 另外，本發(fā)明還設(shè)定了以下對比例，具體如下： 對比例1:不采用氮?dú)獗Ｗo(hù)，其他同實(shí)施例1; 對比例2:炔基硅膠材料、4-巰基苯硼酸與溶劑甲醇的重量比為1:0.2:20，其他同實(shí)施 例1; 對比例3:炔基硅膠材料、4-巰基苯硼酸與溶劑的重量比為1:5:50，其他同實(shí)施例1; 對比例4:催化劑為光催化，紫外可見光波長為254-470 nm，其他同實(shí)施例1; 實(shí)施例2 將實(shí)施例1制備的硼酸硅膠前處理材料1.5mg和50%乙腈/0.1%甲酸水溶液以一定比例 (1:1.5，v:v)混合后超聲分散5 min，裝填于GE Loader小柱中，并用50%乙腈/0.1%甲酸水溶 液(50 uL)清洗。備用。
[0011] 實(shí)施例3 進(jìn)行糖肽選擇性富集實(shí)驗(yàn)，采用基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)質(zhì)譜以辣根過氧化物酶 (HRP)酶解物作為分離對象，進(jìn)行糖肽選擇性富集，富集條件為:將實(shí)施例2中所制備的裝有 填料的GE Loader小柱，先用80%ACN(乙腈)/ 0.1%甲酸溶液(50 uL)清洗，棄除流出液。采用 糖蛋白酶解物HRP作為對象進(jìn)行親水富集：取HRP酶解液（lmg/mL) (2 yL)旋干后，加入80% ACN(乙腈)/0.1%甲酸溶液（20uL)重溶解，上樣GE Loader小柱。分別用上樣緩沖液80%ACN (乙腈)/0.1%甲酸水溶液(40 yL)清洗，淋洗緩沖液50%ACN(乙腈)/ 0.1%甲酸溶液(20 yL) 洗脫。所得的樣品冷凍濃縮干燥以后，用70% ACN/0.5%TFA(20 yL)重溶，用MALDI質(zhì)譜進(jìn)行 分析，采用DHB作為基質(zhì)。并歸納實(shí)施例和對比例從HRP中富集出的糖肽數(shù)目，考察材料的糖 肽富集選擇性。
[0012] 具體結(jié)果如下表顯示 表1實(shí)施例和對比例的糖肽選擇性富集結(jié)果
本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個或更多個技術(shù)方 案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技 術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容 中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，具體步驟如下： (1) 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2，2 偶氮二異丁腈加入功能單體4-巰基苯硼酸的甲醇溶液中磁力 攪拌混合均勻； (2) 在攪拌的溶液中加入炔基修飾的硅膠，并在65°C條件下將樣品反應(yīng)10-70小時； (3) 反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用甲醇，水，甲醇進(jìn)行順序沖洗； 洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的硼酸硅膠前處理材料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 催化劑為2,2'-偶氮二異丁腈。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟1 需要在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行反應(yīng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟2中 所述的材料為炔基修飾的硅膠。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 2，2偶氮二異丁腈與功能單體4-巰基苯硼酸的摩爾比為1:5~50。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟2中 炔基修飾的硅膠、4-巰基苯硼酸與溶劑的重量比為1:0.2~5:5~100。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟2中 炔基修飾的硅膠、4-巰基苯硼酸與溶劑的重量比為1:0.8:20。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 所述的功能分子為4-巰基苯硼酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于4-巰基苯 硼酸與催化劑的重量比為24:1，反應(yīng)溫度優(yōu)選為65°C，反應(yīng)時間為48小時。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硼酸硅膠前處理材料的制備方法，其特征在于步驟三， 采用甲醇，水，甲醇進(jìn)行順序沖洗。
【文檔編號】C08G77/398GK106008982SQ201610461770
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】趙艷艷, 張麗媛, 王立恒, 董佩佩, 彭金詠
【申請人】大連醫(yī)科大學(xué)