一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法。具體步驟如下：（1）將功能單體4?氰基苯硼酸與疊氮基修飾的硅膠溶于溶劑中，磁力攪拌混合均勻；（2）加入適量催化劑并在80℃溫度下，恒溫反應(yīng)10?70小時。反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用10%EDTA水溶液，水，甲醇等溶劑進行沖洗。洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的親水性的苯硼酸親和材料。
【專利說明】
一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖蛋白作為一類重要的翻譯后修飾蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫及腫瘤發(fā)生等生物學(xué) 過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的發(fā)現(xiàn)與鑒定在疾病的診斷和蛋白質(zhì)組學(xué) 領(lǐng)域意義重大。目前，用于N連接糖肽富集的主要方法有凝集素、酰肼、親水作用色譜、硼酸 親和色譜等。對于具有1，2_順式二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖型，苯硼酸可以與其形成可逆的五元或 者六元環(huán)的酯，同時苯硼酸具有親水性，能夠與糖肽選擇性結(jié)合。硼酸材料對糖肽的富集選 擇性集親和和親水作用力為一體，不僅能夠避免糖鏈結(jié)構(gòu)遭到破壞，而且所富集的產(chǎn)物與 質(zhì)譜兼容，對于研究糖蛋白糖基化位點信息及糖型結(jié)構(gòu)歸屬較為方便。因此，苯硼酸在糖肽 的選擇性富集領(lǐng)域受到了人們的關(guān)注。而由苯硼酸為鍵合相開發(fā)的親和材料也在糖蛋白或 糖肽選擇性富集中起到了越來越重要的作用。
[0003] 點擊化學(xué)指的是一類轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)率高，操作簡便，綠色環(huán)保的化學(xué)反應(yīng)，廣泛的 應(yīng)用在生物，藥物等領(lǐng)域。我們課題組曾經(jīng)將點擊化學(xué)(Click Chemistry)用于合成硅膠基 質(zhì)的色譜固定相，相應(yīng)的文章發(fā)表在國際知名期刊上（Journal of Chromatography A 2009, 1216: 257-263；Chemical Communications 2007, 2491-2493；Chemical Communications 2006, 4512-4514；Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011， 399,3359-3365; Talanta, 78 (2009) 916-921; Journal of separation science, 33: 9 (2010) 1224-1230; Analytical Method, 2012,4, 1244-1251)。這些方法采用的均是 銅催化的點擊化學(xué)反應(yīng)，雖然得到較高的反應(yīng)效率，但是反應(yīng)過程中引入銅這個重金屬，會 給色譜分離帶來影響，因此有必要加以改進。無銅催化的點擊化學(xué)以其高轉(zhuǎn)化率，高產(chǎn)率， 以及避免銅的引入，引起了研究人員的重視。以亞鐵鹽催化的疊氮基和氰基生成四唑環(huán)的 點擊化學(xué)方法就是一種無銅催化的點擊化學(xué)反應(yīng)(Angew. Chem. 2007，119，8592 -8596)，相比較而言，合成轉(zhuǎn)化率高，且沒有銅離子的引入，是一種理想的化學(xué)反應(yīng)。然而這 種方法目前沒有引入到色譜填料制備中，而且用于苯硼酸親水硅膠材料的制備也未見報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種親水性的基于無銅催化的苯硼酸硅膠材料的制 備方法，具體步驟如下： (1) 將功能單體4-氰基苯硼酸與疊氮基硅膠溶于溶劑中，磁力攪拌混合均勻； (2) 加入適量催化劑并在80 °C溫度下，恒溫反應(yīng)10-70小時。反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用 砂芯漏斗抽濾，并分別用10%EDTA水溶液，水，甲醇等溶劑進行沖洗。洗滌后產(chǎn)物干燥，即得 本發(fā)明的苯硼酸親水材料。
[0005] 在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟1中所述的材料為疊氮基硅膠材料，為實驗室自 制，制備和表征方法均參照文獻(Chem Comun，2006，43: 4512);溶劑為二甲基甲酰胺與 甲醇的混合物。
[0006] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述二甲基甲酰胺與甲醇的重量比為10: 1~3， 優(yōu)選為9:1。
[0007] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，4-氰基苯硼酸、疊氮基硅膠材料與溶劑的重量比 為1:1~5:10~100,優(yōu)選為1:2:60。
[0008] 在本發(fā)明再一個實施方案中，步驟(2)中所述催化劑為醋酸亞鐵，4-氰基苯硼酸與 催化劑的重量比為1 〇: 1，反應(yīng)溫度優(yōu)選為80 °C，反應(yīng)時間為48小時。
【具體實施方式】
[0009] 下面將進一步的來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要 求保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所 附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準。
[0010] 實施例1 (1)將4-氰基苯硼酸(0.5 g)溶解于疊氮基硅膠（lg)的二甲基甲酰胺與甲醇(9:1)混懸 溶液30 mL中，并于室溫下進行磁力攪拌。
[0011] (2)混懸均勻后，加入醋酸亞鐵(0.05 g)并在80°C下攪拌48小時。反應(yīng)完成以后， 用砂芯漏斗抽濾，分別用10%EDTA水溶液(500 ml)，水（1000 ml)，甲醇（100 ml)。洗滌后產(chǎn) 物于真空干燥箱中干燥，即得苯硼酸親和硅膠材料。
[0012] 實施例2 將實施例1制備的苯硼酸親水硅膠材料和分散溶液甲醇以一定比例（1:1.5，v:v)混合 后超聲分散5 min，倒入40 mL勻漿罐中，用填裝機于60 MPa將色譜填料裝填于不銹鋼管中 (150 mmX4.6 mm)，并使用丙酮作為頂替液，頂替15 min。制備出的色譜柱備用。
[0013] 實施例3 以極性較強的鳥苷為分離對象，考察實施例2制備的苯硼酸親水硅膠柱的柱效。高效液 相色譜條件為：進樣體積2 yL(標準品在50%甲醇水溶液的濃度為1 mg/mL)，流速1.0 mL/ min，檢測系統(tǒng)為紫外檢測器，波長設(shè)定為280 nm，色譜柱為實施例2所制備的苯硼酸親水硅 膠柱（150 mmX4.6 mm，5 mi)。流動相為95%乙腈水溶液，柱溫為30°C。測量峰面積和保留時 間，并計算柱效。
[0014] 另外，本發(fā)明還設(shè)定了以下對比例，具體如下： 對比例1:溶劑中不添加甲醇，其他同實施例2; 對比例2:溶劑中二甲基甲酰胺與甲醇的重量比為10:0.5,其他同實施例2; 對比例3:4-氰基苯硼酸、疊氮基硅膠材料與溶劑的重量比為1:1:30，其他同實施例2; 對比例4:4-氰基苯硼酸、疊氮基硅膠材料與溶劑的重量比為1:1:10，其他同實施例2; 對比例5:催化劑為醋酸鐵，其他同實施例2; 對比例6:催化劑為硫酸亞鐵，其他同實施例2。
[0015]結(jié)果表明，實施例制備的苯硼酸親水硅膠柱的色譜行為，具體柱效及相同親水條 件下鳥苷的保留時間詳見表1: 表1.實施例和對比例HPLC條件下色譜行為結(jié)果
實施例4 進行糖肽選擇性富集實驗，采用基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)質(zhì)譜以辣根過氧化物酶 (HRP)酶解物作為分離對象，進行糖肽選擇性富集，富集條件為:稱量10 mg苯硼酸親水硅膠 材料(實施例1中所制備的材料），懸浮于80%ACN(乙腈)/ 0.1%甲酸溶液（1 mL)中。配成10 mg/mL的懸浮液。將50 yL的懸浮液裝入80%ACN(乙腈)/0.1%甲酸溶液(200此）中渦旋震蕩5 min后，6000轉(zhuǎn)離心，棄除上清液(操作2次）。采用糖蛋白酶解物HRP作為對象進行親水富集： 取HRP( lmg/mL)(2此)與材料懸浮液混合，再加入80%ACN(乙腈)/1%甲酸溶液(200此)進行 混合，孵化30 min后，6000轉(zhuǎn)離心，棄除上清液，分別用上樣緩沖液80%ACN(乙腈)/0.1%甲酸 水溶液(200 yL)清洗，淋洗緩沖液50%ACN(乙腈)/ 1%甲酸溶液(200 yL)洗脫。每次加液體 后震蕩富集30 min后，6000轉(zhuǎn)離心，取上清液保留，離心濃縮旋干備用。所得的樣品冷凍濃 縮干燥以后，用70% ACN/0.5%TFA(20此)重溶，用MALDI質(zhì)譜進行分析，采用DHB作為基質(zhì)。 并歸納實施例和對比例從HRP中富集出的糖肽數(shù)目，考察材料的糖肽富集選擇性。
[0016] 具體結(jié)果如表2顯示 表2實施例和對比例的糖肽選擇性富集結(jié)果
本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方 案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技 術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容 中具體記載一樣。
【主權(quán)項】
1. 一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，具體步驟如下： (1) 將功能單體4-氰基苯硼酸與疊氮基硅膠溶于溶劑中，磁力攪拌混合均勻； (2) 加入適量催化劑并在80°C溫度下，恒溫反應(yīng)10-70小時； 反應(yīng)結(jié)束以后，將產(chǎn)物采用砂芯漏斗抽濾，并分別用10%EDTA水溶液，水，甲醇等溶劑進 行沖洗;洗滌后產(chǎn)物干燥，即得本發(fā)明的苯硼酸親水硅膠材料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 所述的材料為疊氮基修飾的硅膠。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 溶劑為二甲基甲酰胺與甲醇的混合物，二甲基甲酰胺與甲醇的重量比為10:1~3。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 溶劑為二甲基甲酰胺與甲醇的混合物，二甲基甲酰胺與甲醇的重量比為9:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 4-氰基苯硼酸、疊氮基修飾的硅膠與溶劑的重量比為1:1~5:10~100。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟1中 4-氰基苯硼酸、疊氮基修飾的硅膠與溶劑的重量比為1:2:60。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于，步驟2中 所述催化劑為醋酸亞鐵。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯硼酸親水硅膠材料的制備方法，其特征在于4-氰基苯 硼酸與催化劑的重量比為10:1，反應(yīng)溫度優(yōu)選為80°C，反應(yīng)時間為48小時。
【文檔編號】B01J20/30GK106000363SQ201610461788
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】趙艷艷, 張麗媛, 王立恒, 董佩佩, 彭金詠
【申請人】大連醫(yī)科大學(xué)