R-122 對間質轉化（EMT)的差異影響。
[0087] (a)相應處理后對Huh7細胞的鈣黏蛋白和波形蛋白的免疫印跡分析。！fepG2和 !fepG2-122分別代表Η印G2和Η印G2-122細胞的培養(yǎng)上清液。定量分析結果在圖右側，η = 3〇
[0088] (b)使用鈣黏蛋白和波形蛋白作為Huh7細胞的ΕΜΤ標簽，DAPI浸染細胞核。比例 尺：50 μ m〇
[0089] (c)相應處理后對Huh7細胞的鈣黏蛋白和波形蛋白的免疫印跡分析。Hepal-6和 !fepal-6-122 Sp分別代表Η印al-6和Η印al-6-122sp細胞的培養(yǎng)上清液。定量分析結果在 圖右側，η = 3。
[0090] (d)使用鈣黏蛋白和波形蛋白作為Huh7細胞的ΕΜΤ標簽，DAPI浸染細胞核。比例 尺：50 μ m〇
[0091] 實施例4
[0092] 參照附圖4。體內miR-122缺失導致人和小鼠肝癌不同的腫瘤迀移效應。
[0093] (a)皮下注射表達miRNA或者對照發(fā)卡結構（NC)的細胞到免疫缺陷的小鼠體內， 5周后，測量腫瘤的體積。
[0094] (b)相應組織的血管數(shù)量統(tǒng)計結果。η = 7。
[0095] (c)皮下注射60天后對原發(fā)性腫瘤進行蘇木精伊紅染色。對小鼠皮下注射能穩(wěn)定 表達NC、miR-122或者共表達miR-122和TGF β 1 (122-TGF β 1)的！fepG2細胞，能穩(wěn)定表達 NC 或 miR-122 海綿（122sp)的！fepal-6 細胞。N = 7,比例尺：50 μ m。
[0096] (d)皮下注射相應的細胞后取小鼠的肺部進行蘇木精伊紅染色。N = 7,比例尺： 50 μ m〇
[0097] (e)敲入HBx基因的轉基因小鼠的肝腫瘤和正常肝臟組織（η = 8)以及人肝癌腫 瘤與正常癌旁組織的miR-122 (η = 6)表達水平分析。
[0098] (f)組織的TGFi3 1和TGFi3 R1免疫印跡分析結果。相關代表性圖片在插圖中展 不。
[0099] (g)使用⑶31浸染相關組織對血管數(shù)量定量分析。
[0100] (h)相關肝癌細胞組（肝癌研究所和中山醫(yī)院）的Kaplan-Meier生存曲線。表達 值=log2of RMA-calculated信號強度，miR-122表達值>0.39表示高表達組，而miR-122 表達值<-〇· 58表示低表達組。η = 165 ;P值經(jīng)過Mantel-Cox log-rank檢驗。
[0101] (i)相關肝癌細胞組（肝癌研究所和中山醫(yī)院）的Kaplan-Meier生存曲線。表達 值=log2ofRMA-calculated信號強度，TGF β 1表達值< 4表示低表達組，而TGF β 1表達 值> 5表示高表達組。η = 244 ;Ρ值經(jīng)過Mantel-Cox log-rank檢驗。
[0102] 誤差線，土SD*P < 0· 05 ;**P < 0· 01 ;***P < 0· 001，雙側 t 檢驗。ND :無差別。
[0103] 實施例5
[0104] 參照附圖5。特異性靶向mml-mir-122a的TALEN的體外活性檢測。
[0105] (a)根據(jù)mml-mir-122前體序列設計TALEN結合位點，分別為：GTCTAAACTATCAAACG 和 GCCTAGTAGTAGCTATT ;
[0106] (b)根據(jù)現(xiàn)有TALEN合成規(guī)則在pCS2載體上組裝TALEN ;同時把TALEN靶位點序 列（TGTCTAAACTATCAAACGCCATTATCACACTAAATAGCTACTACTAGGC)構建到 pSSA 上；
[0107] (c)為了檢測TALEN結合效率，TALEN質粒和SSA載體共轉染到293T細胞中。轉 染24h之后，裂解液裂解細胞，用Promega公司的雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶基 因的表達水平，從而得出TALEN的效率。
[0108] 實施例6
[0109] 參照附圖6。特異性靶向mml-mir-122a的gRNA的體外活性檢測。
[0110] (a)根據(jù)mml-mir-122前體序列設計gRNA結合位點，分另丨」為： AGAGCTGTGGAGTGTGACAA 和 GTAGCTATTTAGTGTGATAAo
[0111] (b)設計合成含有T7啟動子的引物（序列如下）以含有gRNA骨架的質粒為模板 PCR，回收得到gRNA轉錄模板，用T7體外轉錄試劑盒進行體外轉錄，回收得到gRNA ;
[0112]
[0113] 其中 NNNNNNNNNNNNNN 是 gRNA 靶點，
[0114] (c)設計引物，以基因組DNA為模板進行擴增，跑膠回收得到活性檢測底物DNA
[0115] ⑷將體外轉錄得到的gRNA，底物DNA和cas9蛋白在反應液中充分混勾，37攝氏 度反應0. 5小時，65攝氏度5分鐘，跑瓊脂糖凝膠電泳檢測gRNA活性。
[0116] 表S1.不同靈長類中保守的TGFf3 1 5' UTR序列。
[0117] 表 S1
[0118]
[0119] 表S2.相天基因的PCK引物。汪
：具澩相天的TGF μ 1和TGF β R1的3' UTR與 5' UTR都按照GenBank上對應的序列合成。
[0120] 表 S2
[0121]
【主權項】
1. 一種構建靈長類動物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步驟： a) 將特異性靶向miR-122的gRNA序列插入到適宜的載體中，構建出體外轉錄miR-122 的模板載體； b) 將cas9基因的序列插入到適宜的載體中，構建出體外轉錄cas9基因的模板載體； c) 以步驟a)中的載體為模板進行PCR擴增，得到體外轉錄miR-122的gRNA的模板； d) 用限制性內切酶將步驟b)中的模板載體線性化，得到體外轉錄cas9基因的模板； e) 以步驟c)和d)中的產(chǎn)物為模板分別進行體外轉錄，得到特異性靶向miR-122的 gRNA 和 cas9 基因的 mRNA ; f) 將步驟e)中的gRNA和mRNA注射到所述靈長類動物的受精卵細胞中，或者先注射 到所述靈長類動物的卵母細胞中，再與所述靈長類動物的精子進行體外受精得到受精卵細 胞； g) 將步驟f)中的受精卵細胞移植入所述靈長類動物的子宮中，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的敲除 miR-122的靈長類動物子代。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述靈長類動物為猴。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述猴為恒河猴、獼猴、豚尾猴、食蟹猴或 絨猴。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a)中所述模板載體含有特異性靶向 miR-122 的 gRNA 序列。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b)中所述模板載體含有cas9基因的 序列。6. -種構建靈長類動物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步驟： a) 將特異性靶向miR-122的TALEN序列插入到適宜的載體中，構建出體外轉錄特異性 靶向miR-122的TALEN的模板載體； b) 用限制性內切酶將步驟a)中的模板載體線性化，得到體外轉錄TALEN基因的模板； c) 以步驟b)中的產(chǎn)物為模板進行體外轉錄，得到特異性靶向miR-122的TALEN基因的 mRNA ； d) 將步驟C)中的mRNA注射到所述靈長類動物的受精卵細胞中，或者先注射到所述靈 長類動物的卵母細胞中，再與所述靈長類動物的精子進行體外受精得到受精卵細胞； e) 將步驟d)中的受精卵細胞移植入所述靈長類動物的子宮中，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的敲除 miR-122的靈長類動物子代。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述動物為猴。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述猴為恒河猴、獼猴、豚尾猴、食蟹猴或 絨猴。9. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于步驟a)中所述模板載體含有特異性靶向 miR-122的TALEN基因的序列。10. 根據(jù)前述任一權利要求所述的方法構建的靈長類動物模型。11. 根據(jù)權利要求1-9的任一項所述的方法構建的靈長類動物模型，其特征在于隨著 年齡增加，該模型會出現(xiàn)肝硬化、原位肝癌、肝癌轉移等癥狀。12. 權利要求10或11所述靈長類動物模型的用途，其特征在于所述動物模型用于研究 人類相應的癥狀。13. -種利用權利要求10或11所述靈長類動物模型篩選藥物的方法，其特征在于，對 所述動物模型施用待篩選的藥物，然后檢測所述待篩選藥物對所述動物模型所起的作用。14. 一種利用權利要求10或11所述靈長類動物模型篩選藥物的方法，其特征在于，對 所述動物模型施用待篩選的藥物，然后檢測所述待篩選藥物在所述動物模型體內的藥物代 謝動力學、毒性及有效性。
【專利摘要】構建靈長類動物肝癌模型的方法，包括以下步驟：a)將特異性靶向miR122的gRNA序列插入到適宜的載體中，構建出體外轉錄miR122的模板載體；b)將cas9基因的序列插入到適宜的載體中，構建出體外轉錄cas9基因的模板載體；c)以步驟a)中的載體為模板進行PCR擴增，得到體外轉錄miR122的gRNA的模板；d)用限制性內切酶將步驟b)中的模板載體線性化，得到體外轉錄cas9基因的模板；e)以步驟c)和d)中的產(chǎn)物為模板進行體外轉錄，得到特異性靶向miR122的gRNA和cas9基因的mRNA；f)將步驟e)中的gRNA和mRNA注射到所述動物的受精卵細胞中，或者注射到卵母細胞中，再與所述動物的精子進行體外受精得到受精卵細胞；g)將步驟f)中的受精卵細胞移植入所述動物的子宮中，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的敲除miR122的動物子代。
【IPC分類】A61K49/00, C12N15/873, A01K67/027
【公開號】CN105624195
【申請?zhí)枴緾N201410593647
【發(fā)明人】席建忠, 孫常宏
【申請人】北京大學
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月30日