Rad)獲得。
[0036] 免疫組織化學(xué)
[0037] 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院完成。組織樣本在4%福爾馬林溶液中室 溫過(guò)夜固定，然后使用PBS和70%乙醇先后漂洗，再進(jìn)行石蠟包埋，切片后用蘇木精和伊紅 染色。在石錯(cuò)包埋的操作部分進(jìn)行抗⑶31第二抗體（BD biosciences)檢測(cè)。使用ImageJ 軟件計(jì)算血管數(shù)量。
[0038] 體外人工基底膜血管新生試驗(yàn)
[0039] 使用人工基底膜（BD Biosciences)鋪蓋24孔板，每孔接種5X104HUVEC細(xì)胞。6h 后，細(xì)胞貼壁并使用相應(yīng)的上清液培養(yǎng)細(xì)胞。剩余孔中加入重組TGFf3 l(Sino Biological Inc.)至終濃度2ng/ml作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)其他孔中加入新鮮的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。24h 后使用ImageJ軟件測(cè)量和計(jì)算血管長(zhǎng)度和分支點(diǎn)數(shù)量并成像。
[0040] 動(dòng)物模型和體內(nèi)成瘤試驗(yàn)
[0041] 構(gòu)建小鼠肝癌模型18。分別將Η印G2-NC、！fepG2-122和Η印G2-122-TGF細(xì)胞皮下 注射到裸鼠體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)成瘤試驗(yàn)。5周后，處理小鼠并取腫瘤稱重。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn) 操作都符合北京大學(xué)動(dòng)物中心的提供的操作流程進(jìn)行。
[0042] 數(shù)據(jù)分析
[0043] 使用Excel電子數(shù)據(jù)表格進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)。Ρ值< 0. 05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)上顯著地，*Ρ < 0. 05 ;**Ρ < 0. 01 ;***Ρ < 0. 001。誤差線代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖l.miR-122在人的細(xì)胞中直接靶向TGFI3 1，而在小鼠細(xì)胞中是TGF0R1。
[0045] 圖2. miR-122以一種非經(jīng)典的"種子區(qū)"堿基配對(duì)方式靶向于TGF0 1 5' UTR。
[0046] 圖3.分別靶向于TGF0 1或TGF0 R1導(dǎo)致了人和小鼠細(xì)胞中miR-122對(duì)間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)的差異影響。
[0047] 圖4.體內(nèi)miR-122缺失導(dǎo)致人和小鼠肝癌不同的腫瘤迀移效應(yīng)。
[0048] 圖5.特異性革巴向mml-mir_122a的TALEN的體外活性檢測(cè)。（a)為mml -mi r~1 22a. 前體序列，其中粉色標(biāo)識(shí)的堿基為mml-mir-122a的程序序列；(b)中所示的是SSA實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果。在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染TALEN質(zhì)粒和含有靶向序列的SSA報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染24小時(shí)之 后，進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)；圖中看出報(bào)告基因的表達(dá)量比負(fù)對(duì)照組（NC)提高了 10倍左 右，說(shuō)明TALEN剪切目的基因的效率很高。
[0049] 圖6.特異性革巴向mml-mir-122a的gRNA的體外活性檢測(cè)。（a)中為mml-mir-122a 前體序列，其中粉色標(biāo)識(shí)的堿基為mml-mir-122a的程序序列；(b)中所示的是用CRISPR系 統(tǒng)體外剪切實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在體外，把cas9蛋白和gRNA與含有靶位點(diǎn)的DNA片段混合，37度溫 浴lh，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。如圖中所示，cas9可以跟mm-mir-122a的兩條gRNA 能將目的基因的DNA片段剪切開(kāi)，剪切效率分別為63. 5%和52. 1 %，而負(fù)對(duì)照組（NC)沒(méi)有 切開(kāi)。
[0050] 圖 7. !fepG2、Huh7 和!fepal-6 細(xì)胞中的 miR-122 表達(dá)水平。η = 3
[0051] 圖8.過(guò)表達(dá)miR-122的!fepG2細(xì)胞中的miR-122的含量。轉(zhuǎn)染NC和miR-122海 綿后Huh-7細(xì)胞和!fepal-6細(xì)胞內(nèi)的miR-122含量。η = 3
[0052] 圖9.對(duì)PANC-l、MCF-7和ΝΙΤ-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒和miR-122表達(dá)載體后，免疫印 跡檢測(cè)TGFf3 1和TGFf3 R1水平，右側(cè)圖為定量分析。η = 3
[0053] 圖10.在Η印G2-122和!fepG2細(xì)胞中的TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3表達(dá)水平。
[0054] 圖11.不同3' UTR的熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建圖。
[0055] 圖12.不同5' UTR的熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建圖。
[0056] 圖13.轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體后的熒光素酶活力，將TGF0R1 5' UTR插入到載體的 promoter 部分。Hum ：Human ；Rhe ：Rhesus monkey ；Mou-Mouse〇 n = 6
[0057] 圖14.互換突變實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證miR-122在人的TGFf3 R1 5' UTR區(qū)的靶點(diǎn)位置。
[0058] 圖15.轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體后的熒光素酶活力，將不同物種對(duì)應(yīng)的TGFi3 R1 5' UTR序列 插入到pGL載體的promoter部分。η = 6
[0059] 圖16.Hela細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-122和相應(yīng)載體對(duì)應(yīng)的熒光成像圖，所有的目標(biāo)序 列都構(gòu)建到熒光素酶和eGFP的編碼區(qū)中間形成一個(gè)融合蛋白，載體的構(gòu)建方式如圖2E。η =3
[0060] 圖17. miR-122對(duì)人和小鼠的血管新生產(chǎn)生不同的影響。
[0061] (a，b)進(jìn)行相應(yīng)處理的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)圖像，右側(cè)定量圖顯示分支點(diǎn)數(shù)量和血管 長(zhǎng)度。誤差線：500 μπι，η = 3
[0062] (c)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)處理Η印G2和Η印al-6細(xì)胞中的VEGF含量。
[0063] ⑷熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-122并不是直接以VEGF作為靶點(diǎn)。誤差線，土SD*P < 0· 05 ;**P < 0· 01 ;***P < 0· 001，雙側(cè) t 檢驗(yàn)。ND :無(wú)差別。
[0064] 圖18.植入相應(yīng)的細(xì)胞后腫瘤的大小。η = 7
[0065] 圖19.⑶31浸染相應(yīng)處理后的癌癥組織。η = 7,誤差線：50 μ m，η = 3
[0066] 圖20.相關(guān)肝癌細(xì)胞組（肝癌研究所和中山醫(yī)院）的Kaplan-Meier生存曲線。表 達(dá)值=log2 of RMA-calculated信號(hào)強(qiáng)度，TGF β R1表達(dá)值< 4表示低表達(dá)組，而TGF β R1 表達(dá)值> 5表示高表達(dá)組。η = 244 ;Ρ值經(jīng)過(guò)Mantel-Cox log-rank檢驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 實(shí)施例1
[0068] 參照附圖1。miR-122在人的細(xì)胞中直接靶向TGF β 1，而在小鼠細(xì)胞中是TGF β R1。
[0069] (a)在！fepG2、Huh7 和！fepal-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-122 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（122)、miR-122 海綿（122sp)和NC，TGFf3 1和TGFf3 R1的免疫印跡分析。
[0070] (b)!fepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-122、NC和miR-122與TGF0 1的免疫印跡，分別為胞內(nèi)的 TGF β 1、Smad2和p-Smad2,定量分析結(jié)果在圖右側(cè)，η = 3。
[0071] (c)NIT-l細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-122、NC和miR-122與TGF0 R1的免疫印跡，分別為胞內(nèi) 的TGFP Rl、Smad2和p_Smad2,。定量分析結(jié)果在圖右側(cè)，η = 3。
[0072] (d)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的載體后測(cè)定熒光素酶活力。使用pGL質(zhì)粒構(gòu)建相應(yīng)的TGFi3 13'UTR 焚光素酶載體。Hum :Human ;Huml :長(zhǎng) 3'UTR ;Hum2 :短 3'UTR ;Rhe :恒河猴；Mou :小鼠 。η = 6〇
[0073] (e)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的載體后測(cè)定熒光素酶活力。使用pGL質(zhì)粒構(gòu)建相應(yīng)的TGF0R1 3'UTR熒光素酶載體。人的TGF0R1 3'UTR因太長(zhǎng)被分成兩段，H1和H2。n = 6。
[0074] (f)C5. 18(大鼠細(xì)胞）和LLC-PK1(豬細(xì)胞）轉(zhuǎn)染miR-122過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和NC之后， TGFi3 1和TGFi3 R1的表達(dá)量。定量分析結(jié)果在圖右側(cè)，η = 3。
[0075] 誤差線，土SD*P < 0· 05 ;**Ρ < 0· 01 ;***Ρ < 0· 001，雙側(cè) t 檢驗(yàn)。β-Actin 作為 對(duì)照。NC:陰性對(duì)照。
[0076] 實(shí)施例2
[0077] 參照附圖2。miR-122以一種非經(jīng)典的"種子區(qū)"堿基配對(duì)方式靶向于TGF0 1 5' UTR。
[0078] (a)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的載體后測(cè)定熒光素酶活力。將TGF β 1 5' UTR連接到pGL質(zhì)粒的 啟動(dòng)子區(qū)域。η = 6。
[0079] (b)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的載體后測(cè)定熒光素酶活力。將人的TGFi3 1 5' UTR截?cái)喑?個(gè)不 同的部分并且將每段連接到PGL質(zhì)粒的啟動(dòng)子區(qū)域。η = 6。
[0080] (C)圖示miR-122作用于TGFi3 1 5'UTR和突變區(qū)域。不同載體的熒光素酶活力 如下。
[0081] (d)miR-122在不同動(dòng)物TGFf3 1 5' UTR靶點(diǎn)位置的進(jìn)化軌跡。miR-122靶點(diǎn)的獲 得發(fā)生在海牛與人和其他靈長(zhǎng)類的共同祖先（黑色箭頭），在豬、狗、大鼠和小鼠中由于第 11位和第12位之間插入了數(shù)個(gè)堿基而導(dǎo)致了靶點(diǎn)的丟失（紅色箭頭）。點(diǎn)表示與人對(duì)應(yīng) 的位置堿基相同，紅線表示插入一個(gè)或多個(gè)堿基。
[0082] (e)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的載體后測(cè)定熒光素酶活力。目標(biāo)序列（表S1)被連接到熒光素酶 和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的⑶S中間。Rhes :恒河猴；PC :陽(yáng)性對(duì)照；NC :陰性對(duì)照。η = 6。
[0083] (f)miR-122在動(dòng)物TGF β R1⑶S區(qū)域的靶點(diǎn)位置的進(jìn)化軌跡。在靶點(diǎn)的獲得與缺 失的過(guò)程中有3個(gè)事件發(fā)生：G- > Α突變（紅色）；A- > G突變（藍(lán)色）和G- > Α突變 (綠色）。點(diǎn)表示與人對(duì)應(yīng)的位置堿基相同。
[0084] 誤差線，土SD*P < 0· 05 ;**P < 0· 01 ;***P < 0· 001，雙側(cè) t 檢驗(yàn)。
[0085] 實(shí)施例3
[0086] 參照附圖3。因?yàn)榉謩e靶向于TGF0 1或TGF0 R1導(dǎo)致了人和小鼠細(xì)胞中mi