構(gòu)建靈長類動物miRNA-122敲除模型的方法、靈長類動物肝癌模型及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種構(gòu)建靈長類動物肝癌模型的方法、動物肝癌模型及用該模型篩選 藥物的方法。特別涉及用表達于肝臟的miRNA miR-122構(gòu)建猴肝癌模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細胞癌是最常見的肝臟腫瘤，在世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性死亡因素中排名第三， 全球每年有超過50萬新患者。2012年美國預(yù)期有超過2. 87萬新增病例，20, 550預(yù)計會死 于這一惡性腫瘤。肝細胞癌的主要風(fēng)險因子包括乙型和丙型肝炎病毒感染以及飲酒造成的 肝損傷。如果發(fā)現(xiàn)及時尚有治愈的希望，但大多數(shù)病例在確診時均已至晚期無法醫(yī)治的階 段。
[0003] 2012年，來自俄亥俄州立大學(xué)綜合癌癥中心的研究人員證實一種稱作 microRNA-122 (miR-122)的小分子在防止肝細胞癌變的過程中發(fā)揮了重要的"剎車"功能， 喪失這一小RNA分子有可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生，修復(fù)該分子則可能減慢腫瘤生長，從而為治療 該疾病指明了一條新的途徑。相關(guān)研究發(fā)表在《臨床研究期刊》（Journal of Clinical Investigation)上。
[0004] 研究者開始開發(fā)出一種缺失miR-122的小鼠品系，通過初始的脂肪肝沉積，隨后 的炎癥和肝癌一系列事件，小鼠形成了肝細胞癌。研究人員隨后利用了第二種小鼠品系，由 于過表達致癌基因 MYC這些小鼠會自發(fā)形成肝癌。研究人員在腫瘤形成過程中將miR-122 傳遞到動物肝癌內(nèi)。三周后，這些用分子治療的小鼠腫瘤既小且少?？茖W(xué)家利用這些研究 開發(fā)的模型來了解肝臟生物學(xué)，也可以用于測試新開發(fā)藥物對抗包括HCC在內(nèi)的肝臟疾病 的治療效應(yīng)。
[0005] 然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，肝臟特異的分子miR-122在人和其它非靈長類動物 中調(diào)控的基因不一樣。導(dǎo)致的結(jié)果是，老鼠肝癌模型不適于人類肝癌機制的研究，也不適用 于肝癌藥物的篩選，只有靈長類動物才能作為有效的肝癌動物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 原發(fā)性肝癌是全球第五最常被診斷的癌癥，同時也是癌癥死亡的第二大誘因5' 6。 許多文獻已經(jīng)報道了 TGF0信號通路在肝腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用7'8。我們首 先估計了 miR-122在三種肝細胞系中對內(nèi)源TGFf3 1水平的影響，其中HepG2和Huh7是人 的肝癌細胞系，ifepal-6是小鼠的肝癌細胞系。！fepG2含有較低水平的miR-122,而Huh7和 !fepal-6有較高的miR-122表達（見圖7)。當(dāng)用miR-122過表達載體處理Η印G2細胞時，細 胞表達的TGFf3 1下降了 54% (圖la和圖8)。同時，當(dāng)用miR-122海綿轉(zhuǎn)染Huh7細胞時， 其TGFI3 1的量上升了 2倍。然而，沉默Η印al-6細胞的miR-122表達并不能引起TGF0 1 的變化，但有趣的是，TGF β R1的表達卻上升了 2倍。與此相對，人肝癌細胞系的TGF β R1表 達量在miR-122或者其海綿作用下并無變化。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)miR-122的這種正交作 用并不僅僅局限于肝細胞（圖9)。
[0007] 接下來我們研究了 miR-122對下游信號通路組分的抑制作用。在!fepG2細胞 中過表達miR-122形成一個穩(wěn)定的細胞系，稱作！fepG2-122。蛋白質(zhì)印跡分析表明了在 !fepG2-122細胞中p-Smad2轉(zhuǎn)變成Smad2的比率下降了 50%。在Η印G2-122細胞中過表達 TGFi3 1之后，該轉(zhuǎn)變比率又回復(fù)到較高的水平（圖lb)。類似地，當(dāng)miR-122在ΝΙΤ-1細胞 中過表達時，P-Smad2轉(zhuǎn)變成Smad2的比率下降了。同時，我們發(fā)現(xiàn)miR-122的抑制效果特 異于TGF β 1 (圖10)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明了 miR-122在人體中能夠抑制TGF β 1，但在 小鼠中卻是抑制TGF0R1。
[0008] 為了驗證miR-122是否直接調(diào)控人體內(nèi)的TGF0 1或小鼠中的TGF0R1，我們構(gòu) 建了一組雙熒光報告體系，每一組都含有人或者小鼠的3' UTR(圖11)。因為人TGFi3 1的 3' UTR含有多個亞型，我們?nèi)坎捎米铋L的亞型進行熒光素酶報告實驗9'1(]。轉(zhuǎn)染含有人 的TGFi3 1或者小鼠的TGFi3 R1 3' UTR的載體會使得熒光量顯著下降，但是轉(zhuǎn)入含有人的 TGFi3 R1或者小鼠的TGFi3 1 3' UTR的報告載體則不會引起變化，這些說明了它們的3' UTR 上沒有靶點位置。（圖Id和le)。
[0009] 因為miR-122的序列是脊椎動物中相同的，我們開始研究在不同物種中的 miR-122作用于TGFi3 1/TGF0 R1的靶點的保守程度。首先，我們實驗測定了在恒河猴、豬、 大鼠中miR-122是否靶向于TGFi3 1/TGF0 R1，我們克隆了它們的3'UTR并分別構(gòu)建入熒光 素酶報告載體中（圖11)。令人意外的是，我們并沒有在這3個物種中的TGFi3 1/TGFi3Rl 3' UTR中發(fā)現(xiàn)任何的miR-122的靶點（圖ld，le)。然而，蛋白質(zhì)印跡實驗卻顯示miR-122 能夠在大鼠和豬的細胞系中抑制TGF0R1的表達水平。所以，我們將研究的方向轉(zhuǎn)到了 TGF0 1/TGF0 R1 5' UTR 和編碼區(qū)區(qū)域（CDS)。
[0010] 我們將5個物種的5'UTR全長克隆并構(gòu)建成熒光素酶報告載體（圖12)。其中僅 含有人和恒河猴TGF β 1 5'UTR的報告載體的熒光亮度能夠被miR-122顯著降低（圖2a和 圖13)。為了確定精確的靶點位置，我們構(gòu)建了一系列含有人TGF0 1 5'UTR截斷區(qū)域的熒 光報告載體，發(fā)現(xiàn)當(dāng)這些載體中含有第4部分片段或者第7部分片段時，能夠被miR-122沉 默（圖2b)。出人意料地，含有第6部分片段的報告載體不受miR-122的影響。我們假設(shè) 因為第6部分片段有很高的GC比例導(dǎo)致了其形成了比較穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)，而接下來的 互換與突變實驗很好地證明了這點（圖14)。序列比對分析和隨后的突變實驗最終確定了 精確的靶點位置，miR-122的3'端能夠以一種非經(jīng)典的方式在該位置形成一個很強的堿基 互補配對（圖2c)。
[0011] 然后我們對動物系統(tǒng)進化樹上的有代表性物種的該靶點位置進行了基因組序列 分析。miR-122能夠顯著的抑制含有海牛TGF β 1 5'UTR的報告載體的熒光，而該保守5'UTR 對應(yīng)區(qū)域的第一位C堿基變成Τ堿基（圖2c，2d，圖15)。該保守序列中的第21位的C堿 基變成T堿基，同時如果伴隨著在第11位和第12位堿基之間插入一個或多個堿基，都會 或多或少地影響miR-122對該部分的抑制效果，例如在小鼠、大鼠、狗和豬等物種中。另外 在早期的脊椎動物的TGFi3 1 5' UTR中并沒有發(fā)現(xiàn)這些同源的序列，比如鳥或者魚，說明該 miR-122的靶點位置是在非洲獸類和靈長類的共同祖先時獲得的。
[0012] 接下來，我們在TGFf3 R1⑶S區(qū)域確定了一組可能為miR-122的靶點，該位置在所 有的脊椎動物中高度保守（表S1)11。我們將這些保守的序列分別構(gòu)建入一個能表達熒光 素酶一綠色熒光蛋白融合蛋白的載體中間（圖2e)。熒光素酶報告實驗證明了再大鼠和豬 的TGFf3 R1CDS區(qū)域含有miR-122的靶點，但是在人和猴子中卻沒有，隨后的熒光檢測實驗 也證明了這點（圖16)。通過對系統(tǒng)進化樹中的代表性物種的miR-122靶點位置的基因組 比較分析，我們模擬追蹤了進化軌跡?；诤唵蔚耐评?，我們發(fā)現(xiàn)在該靶點的獲得與缺失的 過程中共發(fā)生了三個事件（圖2f)。首先，在叢猴與人和狨猴的共同祖先之間出現(xiàn)分化時， 一個G變成A的突變（圖2f紅色）出現(xiàn)在人和狨猴的最近的祖先中，然后形成了猴子和其 他靈長類產(chǎn)生了目前保存的等位基因。該位置的突變導(dǎo)致了 miR-122和靶點位置的一個堿 基配對的缺失。然后，在人和黑猩猩最近的共同祖先中，第二個突變（A變成G，圖2f中藍 色）產(chǎn)生，這個突變進一步降低了 miR-122和其靶點之間的親和力。同時另一方面，在小 鼠和大鼠最近的共同祖先中，一個G變成A的突變（圖2f中綠色）產(chǎn)生了一個和miR-122 的配對，進一步加強了 miR-122和該靶點位置的親和力。因此，這些在進化上有力地說明了 miR-122在小鼠中靶向于TGF0 R1⑶S區(qū)域而在人中卻轉(zhuǎn)變?yōu)門GF0 1 5' UTR。
[0013] 基于miR-122是一個肝臟特異的小分子，TGF0R1的上升水平受肝臟細胞的局限。 然而，TGF β 1作為一種分泌蛋白，能夠調(diào)控鄰近細胞的功能。因此，我們假設(shè)miR-122在人 和小鼠中的缺失會導(dǎo)致不同的病理學(xué)影響，特別是在腫瘤的迀移方面。我們研究了 miR-122 介導(dǎo)的TGFi3 1/TGF0 R1抑制是否會影響上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變（EMT)，EMT是腫瘤 侵襲的早期表征。培養(yǎng)ifepG2或者Η印G2-122細胞48h之后，收集培養(yǎng)上清液。用該上清 液或者重組的TGFi3 1蛋白（終濃度為2. 5ng/ml)處理Huh7細胞。24h后蛋白質(zhì)印跡實驗 檢測結(jié)果表明，HepG2細胞培養(yǎng)上清能夠和重組的TGFi3 1蛋白一樣，使huh7細胞內(nèi)的鈣黏 蛋白含量下降50%，同時使波形蛋白含量上升2倍（圖3a)。而h印G2-122細胞的培養(yǎng)上 清卻產(chǎn)生了與上面相反的變化。為了進一步確認miR-122能夠通過TGFi3 1調(diào)節(jié)EMT，我們 分別在IfepG2和！fepG2-122細胞的培養(yǎng)上清中加入了 TGFi3 1的中和抗體（TGFi3 Ι-Ab)和 TGF β 1。然后我們發(fā)現(xiàn)，TGF β Ι-Ab使!1印62細胞的培養(yǎng)上清的作用顛倒了過來，而16叩1 也使Η印G2-122的培養(yǎng)上清作用相反。這些結(jié)果都與免疫熒光結(jié)果一致（圖3b)。
[0014] 對Hepal-6和過表達miR-122海綿的hepal-6細胞培養(yǎng)上清進行上面同樣的處 理，在兩種情況下，鈣黏蛋白和波形蛋白都沒有展現(xiàn)出差異（圖3c，3d)。為了確認小鼠的 TGFf3 1能夠引起人細胞的EMT，將重組的小鼠 TGFf3 1加到huh7細胞的DMEM培養(yǎng)基中時， 鈣黏蛋白的表達量下降了 4倍，同時波形蛋白則上升了 2. 5倍。
[0015] VEGF是另外一個關(guān)