一種基于bodipy的半胱氨酸熒光探針化合物的制備與應(yīng)用
【專利說明】一種基于BODIPY的半胱氨酸熒光探針化合物的制備與應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種半胱氨酸熒光探針化合物及其制備與應(yīng)用，屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0003]眾所周知，細(xì)胞是組成生命最基本的單元結(jié)構(gòu)，然而目前人們對于細(xì)胞中的各種生命現(xiàn)象的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入、直觀，所以能夠檢測分子的熒光探針以及生物成像具有很大的研究價值。在眾多組成生命的物質(zhì)中，巰基化合物特別是含有巰基的氨基酸在生命代謝中起著不可或缺的作用。研究表明，巰基化合物與很多疾病有關(guān)，比如帕金森病、心血管疾病、腎功能衰竭等。其中，半胱氨酸是參與蛋白質(zhì)合成的、人體必需的20種基本氨基酸之一，也是構(gòu)成谷胱甘肽的重要部分。半胱氨酸在體內(nèi)能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定，減輕心肌細(xì)胞的損傷；刺激淋巴細(xì)胞分化增加人體的抵抗力；參與肝臟內(nèi)的代謝過程，促進(jìn)肝功能等作用。相反，如果體內(nèi)缺少半胱氨酸就會導(dǎo)致代謝失調(diào)從而引發(fā)一系列疾病。因此，如何高效快速地檢測生物體內(nèi)半胱氨酸已成為化學(xué)、生物領(lǐng)域亟待解決的重大課題之一。熒光探針檢測方法不僅靈敏度高、選擇性好，而且可以應(yīng)用于活細(xì)胞中的檢測，目前很多科研工作者正在致力于這項(xiàng)研究。在現(xiàn)有技術(shù)中，CN103755672A提供了一種基于7-羥基香豆素衍生物的半胱氨酸熒光探針，該探針激發(fā)波長較短，可能對細(xì)胞本身有一定傷害，該技術(shù)也未能給出一個最低的檢測限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種半胱氨酸熒光探針化合物，可以靈敏檢測半胱氨酸。
[0005]本發(fā)明還提供所述半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種半胱氨酸熒光探針化合物，具有式I所示(圖1)的結(jié)構(gòu)。
[0007]本發(fā)明所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，包括如下步驟:
(1)將4-氰基聯(lián)苯酚和無水氯化鎂混合溶于乙腈中，再加入適量的三乙胺和多聚甲醛，反應(yīng)加熱回流五小時，得到化合物II (如圖2);
(2)將制得的化合物II溶于二氯甲烷中，緩慢加入吡咯和少量三氟乙酸催化，室溫反應(yīng)攪拌一小時，得到化合物III(如圖3);
(3)將上步制得化合物III溶于二氯甲烷中，加入適量DDQ并在室溫下攪拌1.5小時，之后再加入三乙胺和三氟化硼-乙醚溶液，并在室溫下攪拌反應(yīng)22小時，得到化合物IV (如圖4)； (4)將上步制得的化合物IV溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和丙烯酰氯，在冰浴下反應(yīng)4小時，得到探針分子I (如圖1)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(1)所述氰基聯(lián)苯酚、無水氯化鎂、三乙胺和多聚甲醛的摩爾比為1:1.5:4:15 ；
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(2)所述化合物I1、三氟乙酸和吡咯的摩爾比為1:0.1:20 ;根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(3)所述化合物II1、DDQ、三乙胺和三氟化硼-乙醚的摩爾比為 1:1.2:10:15 ；
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(4)所述化合物IV、三乙胺和丙烯酰氯的摩爾比為1:1.2:1.2 ；
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(1)- (4)全程在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行；
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(1)反應(yīng)回流溫度為81°C。
[0009]更為詳細(xì)的，所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，步驟如下:
(a)取6.24 g (32 mmol)的氰基聯(lián)苯酸和4.56 g (48 mmol)的無水MgCl2于三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，再加入16.3 ml (122 mmol)三乙胺，然后加入80 mL無水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32 g(440 mmol)。加熱回流8小時。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，然后用少量水進(jìn)行淬滅，再加入大量的6 Μ鹽酸進(jìn)行酸化，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離，得白色固體化合物II 3.51 g，產(chǎn)率約為50%。
[0010](b)取2.00 g (8.96 mmol)化合物II加入150 mL的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 mL干燥的二氯甲烷，室溫下攪拌。待溶解后再緩慢地加入12.0 mL (174.4 mmol)新蒸餾的吡咯，然后再加入0.03 mL的三氟乙酸作催化劑，室溫?cái)嚢?小時。反應(yīng)停止后，將粗產(chǎn)物用飽和碳酸鈉溶液洗滌，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離，得到1.42 g的灰白色固體化合物III，產(chǎn)率為46%ο
[0011](c)取0.71 g (2.06 mmol)化合物III加入150 mL的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 mL干燥的二氯甲烷，然后加入0.51 g(2.24 mmol)DDQ，室溫下攪拌1.5 h。再加入2.9mL (20.61 mmol)三乙胺，最后緩慢加入3.9 mL (30.86 mmol)三氟化硼乙醚，室溫下攪拌反應(yīng)22 ho反應(yīng)結(jié)束后，將以上粗產(chǎn)物用50 mL蒸餾水洗滌三次，然后用二氯甲烷萃取，硅膠柱純化，得到橘紅色固體化合物IV 0.3 g，產(chǎn)率約為42%。
[0012](d)取0.10 g (0.26 mmol)化合物IV加入100 mL的三口燒瓶中氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入
0.04 mL (0.31 mmol)干燥的三乙胺和10 mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降溫，加入0.026 mL (約0.31 mmol)丙烯酰氯。冰浴下攪拌反應(yīng)4小時。反應(yīng)停止后，加入少量水淬滅。將以上粗產(chǎn)物經(jīng)過水洗、萃取、干燥、硅膠柱純化后，得到0.04克橘紅色產(chǎn)物I，產(chǎn)率約為35%。
[0013]本發(fā)明所述的半胱氨酸熒光探針化合物的應(yīng)用，可廣泛用于測試水體中的半胱氨酸含量。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述熒光探針用于在pH = 7.4的乙腈和水體積比1:1的溶液中半胱氨酸的快速檢測。在50%乙腈的水溶液中最低可探測的半胱氨酸濃度為10 8 mol/Lo
[0015]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所述熒光探針在pH=7.4的乙腈和水體積比1:1的溶液中，用波長360 nm的光作為激發(fā)波長，可以發(fā)現(xiàn)其在525 nm處有很強(qiáng)的綠色熒光，一旦加入半胱氨酸，溶液熒光迅速淬滅，加入高半胱氨酸和谷胱甘肽的時候，熒光有少許淬滅，而加入其他氨基酸后溶液的熒光沒有明顯變化，對半胱氨酸具有很高的選擇性。
[0016]將本發(fā)明的熒光探針化合物加入含有50%乙腈的水溶液中，配成熒光探針化合物濃度為5微摩爾每升的溶液，用HEPES緩沖溶液調(diào)節(jié)pH = 7.4，加入不同濃度的半胱氨酸，用波長360 nm的光激發(fā)，在波長525 nm處的熒光依次減弱。得出工作曲線如圖2所示，通過測定待測樣品的熒光強(qiáng)度，就可以定量的計(jì)算出半胱氨酸的濃度。
[0017]本發(fā)明所述的半胱氨酸熒光探針化合物不僅可用于水體中半胱氨酸的檢測，還可應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的檢測和成像。
[0018]將HUVEC細(xì)胞在37°C條件下于含有20微摩爾每升的本發(fā)明探針I(yè)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘，探針分子迅速的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并顯示出強(qiáng)熒光，然后用1.2毫摩爾每升的半胱氨酸處理3.5小時，其強(qiáng)熒光迅速淬滅。
[0019]與現(xiàn)有的檢測技術(shù)相比，本發(fā)明熒光探針具有以下優(yōu)點(diǎn):
人本發(fā)明的熒光探針化合物能夠檢測微量的半胱氨酸，且具有良好的靈敏度和選擇性； 么本發(fā)明的熒光探針化合物合成方法簡單、收率高、產(chǎn)物易于保存；
又本發(fā)明的熒光探針化合物具有很好的生物相容性和細(xì)胞膜穿透性；
<與現(xiàn)有的技術(shù)CN103755672A相比，本發(fā)明的熒光探針的激發(fā)發(fā)射波長更長，在細(xì)胞成像研究時對細(xì)胞的損傷更小。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明熒光探針I(yè)的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明中化合物II的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本發(fā)明化合物III的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為本發(fā)明化合物IV的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例1熒光探針在含有50%乙腈的水溶液中(pH=7.4)，與不同氨基酸作用后的熒光強(qiáng)度。
[0021]圖6為本發(fā)明的熒光探針與不同濃度的半胱氨酸的熒光強(qiáng)度工作曲線圖。
[0022]圖7為本發(fā)明的熒光探針用于細(xì)胞中半胱氨酸的檢測及成像，分為左圖和右圖，左圖為圖a，右圖為圖b，圖a為HUVEC細(xì)胞在本發(fā)明熒光探針培養(yǎng)基中的熒光圖，圖b為HUVEC細(xì)胞在本發(fā)明熒光探針和半胱氨酸共同作用下的熒光圖。
[0023]圖8本發(fā)明的熒光探針的核磁圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限于此。實(shí)施例中的各種原料均來自于市場購買。
[0025]實(shí)施例1、
取6.24 g (32mmol)的氰基聯(lián)苯酸和4.56 g (48 mmol)的無水]\%012于三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，再加入16.3 mL (122 mmol)三乙胺，然后加入80 mL無水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32 g (440 mmol)。加熱回流8小時。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，然后用少量水進(jìn)行淬滅，再加入大量的6 Μ鹽酸進(jìn)行酸化，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離，得到白色固體II 3.51 g，產(chǎn)率約為 50%。核磁氫譜"H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 11.11 (s, 1H)，9.99 (s, 1H), 7.73-7.78 (m, 4H)，7.66 (dt, /= 8.59 Hz, 2.12, 2H)，7.12 (d, J=8.37 Hz, 1H)。
[0026]實(shí)施例2、
取2.00 g (8.96 mmol)化合物II加入150 mL的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 mL干燥的二氯甲烷，室溫下攪拌