靶向cld18a2的t淋巴細胞及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤細胞治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及靶向CLD18A2的Τ淋巴細胞 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Τ淋巴細胞在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用日益受到重視。基于Τ淋巴細胞的過繼性 免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方法可以克服抗體治療的 上述缺陷，但在大多數(shù)腫瘤的療效仍不能令人滿意[Grupp SA，et al. Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol. ,2011 ;344:149_72·]。近年來，根據(jù) CTL 對革巴細 胞的識別特異性依賴于T淋巴細胞受體（T Cell Rec印tor，TCR)的發(fā)現(xiàn)，將針對腫瘤細胞 相關(guān)抗原的抗體的scFv與T淋巴細胞受體的CD3 ζ或Fc ε RI γ等胞內(nèi)信號激活基序融 合成嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor, CAR),并將其通過如慢病毒感染等方式 基因修飾在T淋巴細胞表面。這種CAR T淋巴細胞能夠以主要組織相容性復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex, MHC)非限制性方式選擇性地將T淋巴細胞定向到腫瘤細 胞并特異性地殺傷腫瘤。CAR T淋巴細胞是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一個新的免疫治療策略 [Schmitz M,et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10. 1155/2010/956304. ]〇
[0003] 嵌合抗原受體包括胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)。通常胞外區(qū)包含能夠識別 腫瘤相關(guān)抗原的scFv，跨膜區(qū)采用CD8，CD28等分子的跨膜區(qū)，胞內(nèi)信號區(qū)采用免疫受體酪 氨酸活化基序（ITAM)⑶3 ζ或Fc ε RI γ及共刺激信號分子⑶28、⑶27、⑶137、⑶134等的 胞內(nèi)信號區(qū)。
[0004] 胞內(nèi)信號區(qū)僅包含ΙΤΑΜ的為第一代CAR Τ淋巴細胞，其中嵌合抗原受體 各部分按如下形式連接：scFv-TM-ITAM。該種CAR T可以激發(fā)抗腫瘤的細胞毒性效 應(yīng)，但是細胞因子分泌比較少，并且在體內(nèi)不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D_modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res2007, 67(22):11029-11036.]。
[0005] 隨后發(fā)展的第二代CAR T淋巴細胞加入了⑶28或⑶137(又名4-1BB)的胞內(nèi) 信號區(qū)，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：scFv-TM-⑶28-ITAM或scFv-TM-/ ⑶137-ITAM。胞內(nèi)信號區(qū)發(fā)生的B7/⑶28或4-1BBL/⑶137共刺激作用引起T淋巴細胞的持 續(xù)增殖，并能夠提高T淋巴細胞分泌IL-2和IFN- γ等細胞因子的水平，同時提高CAR T在 體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121 (5):1822-1826. ]〇
[0006] 近些年發(fā)展的第三代CAR T淋巴細胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連 接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進一步提高了 CAR T 在體 內(nèi)的存活周期和其抗腫瘤效果[Carpenito C·，et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains. PNAS，2009,106(9):3360 - 3365.]。
[0007] 盡管CAR T淋巴細胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但其較高風險亦需要考 慮。比如，由于某些/種正常組織低表達CAR所能識別的特異性抗原可能造成CAR T淋巴 細胞對表達相應(yīng)抗原的正常組織的損傷。如，針對腎細胞癌患者腫瘤細胞上表達的抗原碳 酸酐酶IX (CAIX)是第一個用于臨床的CAR T淋巴細胞過繼治療的案例，也是第一個報道含 CAR細胞的脫靶效應(yīng)的案例。病人在多次輸入CAR T淋巴細胞后出現(xiàn)2-4級肝毒性。分析原 因為肝膽管上皮細胞低表達CAIX，原臨床試驗被迫中斷同時排除了病人治療效果的任何評 價[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:first clinical experience. J clin oncol,2006,24(13):e20-e22. ；Ngo MC. , et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011，R1-R7]。另外，CAR中過多的共刺激信號會降低效應(yīng)細胞激活所需的閾 值，使得基因修飾的T淋巴細胞在低水平抗原或沒有抗原觸發(fā)的條件下也可能會被活化， 導(dǎo)致大量細胞因子的釋放以致可能引發(fā)所謂的"細胞因子風暴"。這種信號外漏（singnal leakage)會導(dǎo)致脫靶細胞毒性，從而產(chǎn)生非特異性的組織損傷。例如，在采用針對Her2 的第三代CAR臨床治療一個具有肝和肺轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)腸癌患者的過程中由于正常肺組織 中低表達Her2而引發(fā)所謂的"細胞因子風暴"致病人粹死[Morgan RA.，et al.Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy,2010, 18(4) :843-851. ] 〇
[0008] 設(shè)計CAR T時，所針對的抗原基因是一種關(guān)鍵性的選擇，鑒于體內(nèi)基因表達的復(fù)雜 性以及各種不可控因素，選擇到一個合適的用于CAR T的基因是非常困難的。并且，很多腫 瘤特異性的抗原，很難找到針對其的且適合于構(gòu)建CAR T細胞的特異性分子，在建立CAR T 后，往往無法獲得有活性的胞外結(jié)合區(qū)，這也是發(fā)展CAR T技術(shù)的難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供靶向CLD18A2的T淋巴細胞及其制備方法和應(yīng)用。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面，提供表達于T淋巴細胞表面的嵌合抗原受體（CAR)，所述的 嵌合抗原受體包含順序連接的：胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)，其中所述胞外結(jié)合區(qū)包 含特異性識別CLD18A2(claudinl8. 2)的蛋白。
[0011] 在一個優(yōu)選例中，所述的特異性識別CLD18A2的蛋白是抗體或配體；較佳地，所述 的抗體是單鏈抗體或結(jié)構(gòu)域抗體。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的跨膜區(qū)是包含⑶8或⑶28的跨膜區(qū)和鉸鏈區(qū)的序列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的胞內(nèi)信號區(qū)選自：⑶3 ζ，F(xiàn)c ε RI Y，⑶27,⑶28,⑶137， ⑶134的胞內(nèi)信號區(qū)序列，或其組合。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體包括如下的順序連接的胞外結(jié)合區(qū)，跨膜 區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)：
[0015] 特異性識別CLD18A2的單鏈抗體、⑶8和⑶3 ζ ;
[0016] 特異性識別CLD18A2的單鏈抗體、CD8、CD137和CD3 ζ ;
[0017] 特異性識別CLD18A2的單鏈抗體、⑶28分子的跨膜區(qū)（⑶28a)、⑶28分子的胞內(nèi) 信號區(qū)（⑶28b)和⑶3 ζ ;或
[0018] 特異性識別CLD18A2的單鏈抗體、⑶28分子的跨膜區(qū)、⑶28分子的胞內(nèi)信號區(qū)、 CD137 和 CD3 ζ。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體具有SEQ ID Ν0:19~22任一所述的氨基 酸序列。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述的嵌合抗原受體的核酸。
[0021] 在一個優(yōu)選例中，所述的核酸具有SEQ ID N0:15~18任一所述的核苷酸序列。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達載體，其包含所述的核酸。
[0023] 在一個優(yōu)選例中，所述的表達載體來源于慢病毒質(zhì)粒pWPT (或pWPT-eGFP)。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種病毒，所述的病毒（如慢病毒）包含所述載體。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受體、或所述的核酸、或所述的表達載 體、或所述的病毒的用途，用于制備靶向CLD18A2的基因修飾的T淋巴細胞。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因修飾的T淋巴細胞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)有所述的核酸，或 所述的表達載體或所述的病毒。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因修飾的T淋巴細胞，其表面表達一種嵌合抗 原受體，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列選自SEQ ID N0:19-22任一所述的氨基酸序列。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的基因修飾的T淋巴細胞的用途，用于制備抑制 腫瘤的藥物，所述的腫瘤是CLD18A2陽性（高表達）的腫瘤。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的CLD18A2陽性的腫瘤包括：胰腺