通過靶向敲除fad2-1a/1b基因來改良大豆油成分的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年10月1日提交的美國臨時(shí)申請序列號61/885, 213和2013年 3月15日提交的美國臨時(shí)申請序列號61/790, 655的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于制備大豆植物的材料和方法，所述大豆植物可用于生產(chǎn)具有相較 于野生型植物改良的成分的油。本發(fā)明還涉及缺乏FAD2-1A/1B活性的大豆品種。
[0004] 背景
[0005] 大豆（Glycine max)是一種世界范圍內(nèi)重要的豆類作物，因其具有固定大氣氮的 能力。大豆還作為動(dòng)物飼料蛋白的主要來源，并且其油在烹飪/煎炸到工業(yè)和生物柴油方 面都有應(yīng)用。通常采用氫化處理來增加大豆油的熱穩(wěn)定性，延長大豆油的保質(zhì)期，并改善大 豆油的口感。然而，氫化作用會(huì)增加生產(chǎn)成本，還會(huì)導(dǎo)致反式脂肪的形成，這與人類心血管 疾病相關(guān)聯(lián)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供用于改良大豆油成分的材料和方法，所述改良通過降低或消除δ -十二 脂肪酸去飽和酶2 (FAD2)1A和1Β基因的表達(dá)，而不利用轉(zhuǎn)基因法來實(shí)現(xiàn)。還提供具有所述 改良的油成分的大豆品種。
[0007] 本文所述的方法采用序列特異性的稀切核酸內(nèi)切酶，以在FAD2-1A和/或FAD2-1B 編碼序列中引入突變，由此敲除基因功能。這些方法介導(dǎo)FAD2-1A/1B沉默，而不插入轉(zhuǎn)基 因。含有轉(zhuǎn)基因的植物在某些管轄區(qū)域（例如歐洲）高度規(guī)范化，并且，在某些管轄區(qū)域， 獲得監(jiān)管審批所耗費(fèi)的成本很高。本文所述的方法還可加速新品種的生產(chǎn)，并且可具有比 轉(zhuǎn)基因或傳統(tǒng)培育方法更高的成本效益。
[0008] -個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種大豆植物、植物部分或植物細(xì)胞，其具有一個(gè)或多 個(gè)FAD2-1A等位基因中的突變、一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，或者一個(gè)或多個(gè) FAD2-1A等位基因中的突變和一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，其中與對應(yīng)的野生 型大豆植物、植物部分或植物細(xì)胞產(chǎn)出的油相比，所述植物、植物部分或植物細(xì)胞產(chǎn)出的油 所具有的增加的油酸含量和減少的亞油酸含量。各突變可位于SEQ ID NO: 1或SEQ ID Ν0:2 所示的序列。各突變可由稀切核酸內(nèi)切酶（例如，轉(zhuǎn)錄激活因子樣（TAL)效應(yīng)物核酸內(nèi)切 酶）誘導(dǎo)。TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶能夠結(jié)合SEQ ID N0S: 18-33中任一項(xiàng)所示的序列。各突 變可以是多于一個(gè)核苷酸的插入、缺失或取代。各突變的FAD2-1A和/或FAD2-1B等位基 因可具有改變的內(nèi)源性核酸序列，但不包括任何外源核酸。在一些實(shí)施方式中，所述植物、 植物部分或植物細(xì)胞不含轉(zhuǎn)基因。所述植物部分可以是種子。
[0009] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種大豆植物、植物部分或植物細(xì)胞，其具有一個(gè)或 多個(gè)FAD2-1A等位基因中的突變，一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，或者一個(gè)或多個(gè) FAD2-1A等位基因中的突變和一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，其中所述植物、植物 部分或植物細(xì)胞產(chǎn)出的油的油酸含量大于30 % (例如，大于40 %、大于50 %或大于55 % )。 在一些實(shí)施方式中，所述植物、植物部分或植物細(xì)胞不含轉(zhuǎn)基因。
[0010] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種大豆植物、植物部分或植物細(xì)胞，其具有一個(gè)或 多個(gè)FAD2-1A等位基因中的突變，一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，或者一個(gè)或多個(gè) FAD2-1A等位基因中的突變和一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，其中所述植物、植物 部分或植物細(xì)胞產(chǎn)出的油的亞油酸含量少于10% (例如，少于5%、少于3%或少于1% )。 在一些實(shí)施方式中，所述植物、植物部分或植物細(xì)胞不含轉(zhuǎn)基因。
[0011] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)大豆油的方法，所述大豆油具有提高的油 酸含量和降低的亞油酸含量。所述方法可包括（a)提供一種大豆植物或植物部分，其具有 一個(gè)或多個(gè)FAD2-1A等位基因中的突變，一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變，或者一個(gè) 或多個(gè)FAD2-1A等位基因中的突變和一個(gè)或多個(gè)FAD2-1B等位基因中的突變；和（b)從所 述植物或植物部分生產(chǎn)油。各突變可由稀切核酸內(nèi)切酶（例如，TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶）誘 導(dǎo)。TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶能夠結(jié)合SEQ ID NOS :18-33中任一項(xiàng)所示的序列。在一些實(shí)施 方式中，所述植物或植物部分不含轉(zhuǎn)基因。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種制備大豆植物的方法，所述大豆植物在各FAD2-1A 等位基因中具有突變，且在各FAD2-1B等位基因中具有突變。所述方法可包括：(a)使具有 功能性FAD2-1A和FAD2-1B等位基因的大豆植物細(xì)胞的群與靶向內(nèi)源性FAD2-1A序列的一 種或多種稀切核酸內(nèi)切酶，以及靶向內(nèi)源性FAD2-1B序列的一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶接 觸，（b)從所述群選擇一種細(xì)胞，其中各FAD2-1A等位基因和各FAD2-1B等位基因已失活， 和（c)使所選的植物細(xì)胞再生成大豆植物。所述大豆植物細(xì)胞可包含子葉細(xì)胞。該方法可 包括：采用編碼一種或多種稀切核酸內(nèi)切酶的一種或多種載體轉(zhuǎn)化子葉細(xì)胞。該一種或多 種稀切核酸內(nèi)切酶可以是TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶。該TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶各自可靶向至 SEQ ID N0:18-33中任一所列序列。所述方法可包括：將一種或多種TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切 酶蛋白引入所述植物細(xì)胞。該方法還可包括培養(yǎng)所述植物細(xì)胞以生成植物株系。所述方法 還可包括：從所述植物細(xì)胞分離包含F(xiàn)AD2-1A基因座的至少部分或FAD2-1B基因座的至少 部分的基因組DNA。在一些實(shí)施方式中，所述植物細(xì)胞不含轉(zhuǎn)基因。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生大豆植物的方法，所述大豆植物在各FAD2-1A等位基因 中具有突變，且在各FAD2-1B等位基因中具有突變。所述方法可包括（a)使在至少一個(gè) FAD2-1A等位基因中具有突變且在至少一個(gè)FAD2-1B等位基因中具有突變的第一大豆植物 與在至少一個(gè)FAD2-1A等位基因中具有突變且在至少一個(gè)FAD2-1B等位基因中具有突變的 第二大豆植物雜交，以獲得子代；和（b)從所述子代選擇一種大豆植物，其在各FAD2-1A和 FAD2-1B等位基因中具有突變。各突變可由稀切核酸內(nèi)切酶（例如，TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切 酶）誘導(dǎo)。TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶能夠結(jié)合SEQ ID N0S: 18-33中任一項(xiàng)所示的序列。各突 變可以是多于一個(gè)核苷酸的缺失。在一些實(shí)施方式中，所述第一和第二大豆植物不含轉(zhuǎn)基 因。
[0014] 除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同。雖然與本文所述類似或等同的方法和材料可用來實(shí)施本發(fā)明， 但在下文描述合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文 獻(xiàn)都通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書（包括定義在內(nèi)）為準(zhǔn)。此外， 材料、方法和實(shí)施例都僅是說明性的，并不意在構(gòu)成限制。
[0015] 在附圖和以下描述中詳細(xì)說明了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方式。本發(fā)明的其他特 征、目的和優(yōu)勢通過描述、附圖以及權(quán)利要求書將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0016] 圖1A和1B顯示FAD2-1A和FAD2-1B中的不同TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶靶位點(diǎn)的DNA 序列。FAD2-1A 基因 （SEQ ID N0:1)的 DNA 序列示于圖 1A，而 FAD2-1B 基因 （SEQ ID N0:2) 的DNA序列示于圖1B。下劃線序列指示TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶的靶位點(diǎn)，稱為T1-T4。小 寫字母表示用于篩選TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的突變的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。
[0017] 圖2的凝膠照片顯示來自用于篩選大豆毛狀根的TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的 FAD2-1A和FAD2-1B中的突變的PCR富集試驗(yàn)的產(chǎn)物。
[0018] 圖3顯示大豆毛狀根中TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的FAD2-1A和FAD2-1B基因中 突變的示例性DNA序列。頂行各圖顯示FAD2-1A中效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶（下劃線）的識別位 點(diǎn)的DNA序列（頂部兩圖）和FAD2-1B中效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶（下劃線）的識別位點(diǎn)的DNA 序列（底部兩圖）。其他序列顯示由不精確的非同源末端連接（NHEJ)誘導(dǎo)的代表性突變， 右側(cè)顯示缺失的大小。
[0019] 圖4的凝膠照片顯示在再生的大豆植物上進(jìn)行的T7E1試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)用于鑒 定FAD2-1A和FAD2-1B中的TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的突變。星號指示具有明顯突變的 樣品。本文中的表4A提供關(guān)于凝膠中各泳道中分析的是何種再生植物和何種具體FAD2-1 基因的信息。第一和最末泳道包含分子長度標(biāo)志物，從而不編號。表4A中列為"未切"的 DNA樣品不用T7E1處理。
[0020] 圖5顯示FAD2-1A和FAD2-1B中TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的突變的DNA序列。 這些突變是遺傳上可傳播的。
[0021] 圖6顯示對于GM026-18衍生的不同子代進(jìn)行脂肪酸成分分析的結(jié)果。帶有aaBB 基因型的植物在FAD2-1A的兩個(gè)等位基因中具有突變。帶有AAbb基因型的植物在FAD2-1B 的兩個(gè)等位基因中具有突變。aabb植物在FAD2-1A和FAD2-1B的兩個(gè)等位基因中具有突 變。
[0022] 圖7顯示FAD2-1突變體中TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶轉(zhuǎn)基因的隔離。凝膠圖像顯示 分別采用針對TAL效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶編碼序列和大豆醇脫氫酶（ADH)基因的引物組獲得的 PCR產(chǎn)物。凝膠圖像下方的標(biāo)記表示：1-15,個(gè)體T2突變株系；WT，來自非轉(zhuǎn)基因野生型大 豆植物的DNA ;載體，用于轉(zhuǎn)化的載體DNA ;轉(zhuǎn)基因，來自包含T-DNA載體的轉(zhuǎn)基因植物的陽 性對照DNA *0,不含任何DNA的陰性對照。
[0023] 發(fā)明詳述
[0024] 農(nóng)產(chǎn)品大豆油由五種脂肪酸組成：棕櫚酸（10% )、硬脂酸（4% )、油酸（18% )、亞 油酸（55% )和亞麻酸（13% )。具有高油酸含量的植物油可需要較少處理以改善穩(wěn)定性和 /或口感。所述油也可更健康，并且更適于生產(chǎn)生物柴油。油酸含量大于55%且亞油酸含 量少于10%的大豆油尤其有用。已采用傳統(tǒng)培育和誘變策略