一種靶向sall4基因的脫氧核酶分子及在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用
【專利摘要】一種靶向SALL4基因的脫氧核酶分子及其在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用，屬于靶向基因技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是根據(jù)編碼人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)設(shè)計(jì)并構(gòu)建脫氧核酶分子，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子是一種能夠識(shí)別并切割靶基因序列的小核酸分子，不僅具有高的靶基因序列切割能力，同時(shí)具有反義寡核苷酸的化學(xué)穩(wěn)定性，合成成本低。通過(guò)脫氧核酶分子對(duì)靶基因SALL mRNA序列的有效識(shí)別和高效切割，來(lái)抑制乳腺癌的增殖、遷移與浸潤(rùn)，最終構(gòu)建一類通過(guò)抑制SALL4表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)乳腺癌基因治療的小核酸類藥物。
【專利說(shuō)明】
-種卽向SALL4基因的脫氧核酶分子及在乳腺癌基因治療中 的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于祀向基因技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種祀向SA化4基因的脫氧核酶分子及 其在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 《全球癌癥報(bào)告2014》顯示，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400 萬(wàn)人，逐年遞增至2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人。同時(shí)，我國(guó)腫瘤發(fā)病率多 年來(lái)持續(xù)上升，已成為一個(gè)必須高度重視的社會(huì)問(wèn)題。2015年，中國(guó)癌癥總發(fā)病429.16萬(wàn) 例，總死亡281.42萬(wàn)例。癌癥的臨床治療方案目前主要包括化學(xué)療法、放射療法和手術(shù)治療 等。然而，長(zhǎng)期化學(xué)治療極易產(chǎn)生腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象，放射療法和手術(shù)療法難W實(shí)現(xiàn)腫瘤 的徹底根治，同時(shí)W上策略中嚴(yán)重的毒副作用給患者了帶來(lái)極大的痛苦。因此，構(gòu)建一種高 效、安全的腫瘤治療策略，對(duì)于解決運(yùn)一人類頑疾具有重要的意義。
[0003] 與常規(guī)的治療策略相比，基因治療作為一種從根本上治療疾病的新興手段，成為 目前國(guó)際學(xué)術(shù)界研究的焦點(diǎn)，有望成為未來(lái)腫瘤臨床治療中的"新寵"?；蛑委?，是指通過(guò) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源基因引入病變的祀細(xì)胞或者組織，通過(guò)目的基因的表達(dá)，糾正或補(bǔ)償 缺陷基因，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，恢復(fù)組織或器官的正常功能，從而達(dá)到治療目的的 一種新型治療方法。人類SA化4基因是果蛹屬基因化osophila spalt的同源異形基因，位于 20號(hào)染色體的ql3.2。該基因共有4個(gè)外顯子，有兩種亞型，即SA化4A和SA化4B，其差異是由 于基因內(nèi)部外顯子2的不同剪接機(jī)制所導(dǎo)致的。通常，SA化4的表達(dá)只是在胚胎中，在成熟組 織中是沉默的。近年研究顯示，在乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì) 瘤等諸多實(shí)體瘤中均檢測(cè)到SALL4的過(guò)表達(dá)。由此可見，SALL4可能是一個(gè)關(guān)鍵的癌基因，在 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。因此，WSA化4基因?yàn)樽饔渺朦c(diǎn)，開發(fā)小分子化學(xué)物、 小干擾RNA等，降低該基因的表達(dá)水平，有望成為腫瘤臨床治療中的新型策略。
[0004] 脫氧核酶化eoxy;ribozyme,DNAzyme)是一類能夠特異性地識(shí)別并切割祀基因 mRNA 的單鏈DNA片段，因而能夠降低致病基因的表達(dá)水平，達(dá)到預(yù)防及治療疾病的目的，同時(shí)不 會(huì)對(duì)細(xì)胞基因組產(chǎn)生任何副作用。目前，已經(jīng)通過(guò)人工模擬的方法，合成了幾十種脫氧核 酶，包括10-23型脫氧核酶、8-17型脫氧核酶、"手槍型"脫氧核酶等。其中，10-23型脫氧核酶 研究最為廣泛，它是由一個(gè)活性中屯、和兩個(gè)祀基因結(jié)合臂所組成，活性中屯、序列高度保守， 祀基因結(jié)合臂與祀基因 mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)特異性結(jié)合，進(jìn)而活性中屯、可W切割mRNA，下調(diào) 祀基因的表達(dá)水平。與小干擾RNA相比，脫氧核酶具有更高的祀基因 mRNA切割效率，對(duì)腫瘤 生長(zhǎng)的抑制效果更為有效，同時(shí)脫祀效率更低，副作用低，具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，脫氧 核酶的化學(xué)本質(zhì)為脫氧寡核巧酸，其還具有如下優(yōu)勢(shì)：（1)分子量小，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)底物 的趨近性好；（2)催化效率及特異性高；（3)易于合成，價(jià)格低廉?？傊撗鹾嗣赣捎谄渚珳?zhǔn) 的祀基因 mRNA序列識(shí)別及切割能力，已成為一類重要的腫瘤特異性抑制劑，有望成為未來(lái) 腫瘤基因治療中的一類新型小核酸基因藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是根據(jù)編碼人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)設(shè)計(jì)并構(gòu)建脫氧核 酶分子，通過(guò)脫氧核酶分子對(duì)祀基因 SA化mRNA序列的有效識(shí)別和高效切割，來(lái)抑制乳腺癌 的增殖、遷移與浸潤(rùn)，最終構(gòu)建一類通過(guò)抑制SA化4表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)乳腺癌基因治療的小核酸類 藥物。
[0006] 本發(fā)明中所采用的脫氧核酶分子為10-23型脫氧核酶，是一類能夠特異性地識(shí)別 并切割祀基因 mRNA的單鏈DNA片段，具體序列包括：一個(gè)活性中屯、和兩個(gè)祀基因結(jié)合臂組 成，活性中屯、序列高度保守（由15個(gè)脫氧核糖核巧酸組成，其序列為5 ' -GGCTAGCTACAACGA- 3'），祀基因結(jié)合臂（由9個(gè)脫氧核糖核巧酸組成）與祀基因 mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)特異性結(jié)合， 其切割位點(diǎn)為5'-lUY-3'（R不形成堿基配對(duì)，Y則必須與脫氧核酶形成堿基配對(duì)）。
[0007] 本發(fā)明的脫氧核酶分子的序列如下之一所示，其核巧酸序列分別如SEQ ID NO. 1、 沈Q ID NO.2、SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所示：
[0008] 1.5 '-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3 '
[0009] 2.5'-CTTTAGGTA GGCTAGCTACAACGA CACCACAGA-3'
[0010] 3.5'-CTTGGGGAA GGCTAGCTACAACGA TTATAGTTT-3'
[0011] 4.5'-CTGGAAGGA GGCTAGCTACAACGA TGTGGTTTC-3'
[0012] 本發(fā)明中脫氧核酶分子可W通過(guò)修飾來(lái)增加穩(wěn)定性，組成脫氧核酶的憐酸醋基團(tuán) 可W在天然憐酸二醋鍵部分的自由單鍵氧位置進(jìn)行修飾，其中可W是氧、或是甲氧基、或是 硫。
[OOU]本發(fā)明所設(shè)及脫氧核酶能夠通過(guò)對(duì)mRNA序列的識(shí)別切割，降低SALL4的表達(dá)水平， 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡和周期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌增殖的抑制，同時(shí)能夠降低乳腺癌細(xì)胞 的遷移浸潤(rùn)能力。
[0014]綜上，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子是一種能夠識(shí)別并切割祀基因序列的小核酸 分子，不僅具有高的祀基因序列切割能力，同時(shí)具有反義寡核巧酸的化學(xué)穩(wěn)定性，合成成本 低。通過(guò)對(duì)祀基因 SA化4mRNA序列的高效切割，脫氧核酶能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳腺癌增殖、遷移與浸 潤(rùn)能力的抑制，有望成為一類有效的惡性腫瘤基因治療藥物。本發(fā)明的實(shí)施，將對(duì)解決惡性 腫瘤運(yùn)一人類頑疾具有重要的意義，將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1祀基因 SALL4mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖；
[0016] 圖2祀基因 SA化4mRNA潛在祀位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖；
[0017] 圖3脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7(A)、MDA-MB-231 (B)細(xì)胞增殖的抑制分析曲線；
[0018] 圖4脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7(A)、MDA-MB-231(B)集落形成能力的抑制作用 圖；
[0019]圖5脫氧核酶誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF7(A)、MDA-MB-231(B)調(diào)亡的檢測(cè)圖；
[0020] 圖6脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 圖；
[0021] 圖7脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7(A)和MDA-MB-23UB)線粒體膜電位的影響圖； 圖中jc-1單體的出現(xiàn)(圖中W箭頭標(biāo)示)表示細(xì)胞線粒體膜電位的下降。
[0022 ]圖8脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7 (A)和MDA-MB-231 (B)細(xì)胞周期的影響圖；
[0023 ]圖9脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7 (A)和MDA-MB-231 (B)遷移能力的影響圖；
[0024] 圖10脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7(A)和MDA-MB-231 (B)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面給出的實(shí)施例子是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，W便于本專業(yè)技術(shù)人員更全面地 理解本發(fā)明。但所給出的實(shí)施例不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，因而該專業(yè)的技術(shù) 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
[00%] 實(shí)施例1
[0027] 根據(jù)人SA化4基因的mRNA序列，進(jìn)行mRNA生理?xiàng)l件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果如圖1; 根據(jù)脫氧核酶設(shè)計(jì)原則，選取相應(yīng)的祀位點(diǎn)區(qū)域，設(shè)計(jì)四條脫氧核酶寡核巧酸序列，祀位點(diǎn) 選取位置如圖2所示，每條脫氧核酶分子的兩端各有3個(gè)核巧酸為硫代修飾，采用PAGE或 HPLC純化，所設(shè)計(jì)的脫氧核酶序列如下：
[0028] 1.Dz-SA化4-12:5 '-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3 '
[00 巧]2.Dz-SAli^4-62:5，-CTTTAGGTAGGCTAGCTACAACGACACCACAGA-3'
[0030] 3.Dz-SAli^4-143:5'-CTTGGGGAAGGCTAGCTACAACGATTATAGTTT-3'
[0031] 4.Dz-SAli^4-191:5'-CTGGAAGGAGGCTAGCTACAACGATGTGGTTTC-3'
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 乳腺癌細(xì)胞MCF7、S陰性乳腺癌MDA-MB-231采用含有體積分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血 清、lOOU/mL青霉素、lOOiig/mL鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%的C〇2條件 下進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。脫氧核酶的轉(zhuǎn)染采用商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑GoldenTransfer?-D(GT-D)，W 2:l(v/wt)的比例將轉(zhuǎn)染試劑與實(shí)施例1中的4種脫氧核酶分子混合，在37°C中解育20min， 加入至細(xì)胞培養(yǎng)體系中，W無(wú)血清培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)染4h，并在含有血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 4她。乳腺癌細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)過(guò)程如下：W5 X 103細(xì)胞/孔的密度分別將MC巧、MDA-MB-231 細(xì)胞接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)基20化L，預(yù)培養(yǎng)2地。將Golden化ansfer?-D/脫氧核酶復(fù)合 物稀釋至1、2、3、化g/mL，加入至96孔板中，WDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(關(guān)于細(xì)胞存活率的測(cè)定分為 4種GoldenlYansferTM-D/脫氧核酶復(fù)合物（4條曲線）W及GoldenlYansferTM-Di； 1 條曲線）， 僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液的組別視作100%存活，在圖中化g/mL處體現(xiàn)，因此無(wú)曲線，共計(jì)5條曲 線）和Golden化ansfer?-D作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)至4她后，每孔加入20化5mg/mL嚷挫藍(lán)(MTT) 溶液至終濃度為0.5mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。地后小屯、吸棄上清，加入15化L二甲亞諷溶解生成 的紫色沉淀物，振蕩5min后，在492nm下通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。取各平行孔0D值的平均值， 依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：
[0034] Cell viability( % ) = (Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank) X 100%
[003引其中，Asampie為分別加入GoldenTransfer?-D/脫氧核酶復(fù)合物W及僅加入 GoldenlYansfer?-D后的吸光度值，Accmtroi為WDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液正常培養(yǎng)細(xì)胞后的吸光度 值，Abiank為無(wú)培養(yǎng)細(xì)胞僅加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液后的吸光度值
[0036]研究中對(duì)Golden化ansfer?-D/脫氧核酶復(fù)合物進(jìn)行不同濃度的稀釋，作用于腫瘤 細(xì)胞后4她檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。伴隨脫氧核酶分子濃度的增加，脫氧核酶對(duì)兩種乳腺癌細(xì) 胞的增殖抑制能力明顯增加。其中，針對(duì)Loopl2設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子化-SA化4-12作用效果 最為明顯，同時(shí)該脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7的作用效果要明顯優(yōu)于S陰性乳腺癌MDA- MB-231。
[0037]實(shí)施例3
[003引 W2X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2mL，預(yù)培養(yǎng)2地。將Dz-SA化4-12 W化g/mL的濃度無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染4h，換成完全培養(yǎng)基 培養(yǎng)至4她。使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶消化貼壁細(xì)胞，并用血清計(jì)數(shù)板對(duì)收取的細(xì) 胞計(jì)數(shù)。在新的六孔板中，每孔加入3000個(gè)經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組處理后的細(xì)胞，每5天換液一次，培 養(yǎng)14天后，棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，用體積分?jǐn)?shù)為75 %的冰乙醇固定20min，預(yù)冷的抑7.2的憐酸緩 沖液(Phosphate buffer solution，PBS)清洗一次，隨后加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.2%的結(jié)晶 紫/PBS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，4°C染色20min。隨后，采用預(yù)冷的PBS清洗至沒(méi)有浮色，倒置顯 微鏡下拍照。
[0039] 本發(fā)明中，我們通過(guò)集落形成的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)脫氧核酶對(duì)細(xì)胞集落形成能力的影 響，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，脫氧核酶化-SA化4-12轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少， 而轉(zhuǎn)染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑GT-D組并無(wú)明顯變化，可見本發(fā)明 所設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的集落形成能力。
[0040] 實(shí)施例4
[0041 ] W2X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2mL，預(yù)培養(yǎng)2地。將DZ-SALL4-12分別W1、2、3、4iig/mL的濃度無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染4h，換成 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至4她。根據(jù)Annexin V-門TC/PI細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博公司）的使 用說(shuō)明書進(jìn)行相關(guān)檢測(cè):使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25 %的膜酶消化貼壁細(xì)胞，2000g離屯、5min 收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗涂細(xì)胞兩次；W50化染色體系對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，其中包括化L Annexin V-門TC和化L PI，混勻后于4°C避光條件下解育30min;WAnnexin V結(jié)合緩沖液將 體系稀釋至40化L，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞調(diào)亡情況。
[0042] 從圖5中我們可W清楚看到，脫氧核酶的轉(zhuǎn)染對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞都具有良好的調(diào) 亡誘導(dǎo)效果，同時(shí)對(duì)乳腺癌MC巧作用效果更為明顯。在化g/mL情況下早期調(diào)亡比例即可達(dá) 到26.70%，同等濃度下，脫氧核酶誘導(dǎo)=陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞早期調(diào)亡為15.94%。
[0043] 實(shí)施例5
[0044] X 106細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，每皿 培養(yǎng)基lOmL，預(yù)培養(yǎng)2地。^化g/mL的條件無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染脫氧核酶化-SA化4-12地，換 成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至4她。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集并連同培養(yǎng)基上清收集至預(yù)冷的50mL離 屯、管中，12000巧m 4°C離屯、5min。將蛋白沉淀W預(yù)冷的PBS重懸，12000rpm 4°C離屯、Imin，棄 上清，向沉淀中加入3倍沉淀體積的細(xì)胞裂解液RIPA和100 X蛋白酶抑制劑PMSF，在冰上裂 解化，其中每15min搖動(dòng)使沉淀均勻。隨后W1200化pm 4°C離屯、15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL離屯、管管中。取10化樣品，WBCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國(guó)公司)標(biāo)定蛋白濃度，剩余 的樣品加入5XSDS上樣緩沖液，100°C煮樣15min，煮樣后冷卻至室溫后分裝放入-20°C冰箱 保存。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE聚丙締酷胺凝膠并且80V預(yù)電泳5min，上樣時(shí)，每孔 40]ig蛋白量加入樣品，80V電壓20min將蛋白樣品壓縮至濃縮膠/分離膠界面，更改電壓至 120V，約化后電泳至凝膠下緣。W300mA恒流冰浴化將細(xì)胞全蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜取出 驚干后，將膜按不同分子量分割至合適大小，放入至質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉/0.1% Tween20/PBS溶液，在常溫下封閉PVDF膜化，去除膜的蛋白非特異結(jié)合。取出后W濾紙吸干， 放入抗體雜交袋中，抗體W質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%牛血清白蛋白（Bovine serum a化umin，BSA)/ PBS溶液稀釋至適當(dāng)比例（SA化4 1:1000; e-act in 1: 2000，抗體購(gòu)自Abeam公司）加入雜交 袋中，在4 °C搖動(dòng)解育過(guò)夜。0.1 % Tween20/PBS清洗立次，每次1 Omin W除去抗體的非特異性 結(jié)合，加入3%BSA/PBS溶液稀釋相應(yīng)的二抗（1:5000)。0.1%1^661120/?85清洗^次，每次 lOminW除去二抗的非特異性結(jié)合。最后用E化顯色試劑盒(上海天能科技公司）曝光顯影。
[0045] 從圖6中我們可W看出，在乳腺癌細(xì)胞系MC巧和MDA-MB-231中，脫氧核酶的作用能 夠顯著降低SA化4蛋白的的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑 GT-D組相關(guān)蛋白表達(dá)量基本保持不變。同時(shí)，脫氧核酶的作用能夠降低細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白 p;r〇-Caspase-3、p;r〇-Caspase-9，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP9蛋白的表達(dá)水平。該結(jié)果證明，轉(zhuǎn) 染的脫氧核酶化-SA化4-12可W降低SA化4的表達(dá)，下調(diào)的SA化4激活了 pro-化spase9，具有 活性的化spase9進(jìn)而激活了 pro-化spase-3的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了調(diào)亡，即脫氧核酶 通過(guò)激活線粒體調(diào)亡途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡的。
[0046] 實(shí)施例6
[0047] W2X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2mL，預(yù)培養(yǎng)2地。W無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染脫氧核酶化-SA化4-12地，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至 4她。按照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司）的使用說(shuō)明書進(jìn)行操 作：WPBS清洗細(xì)胞一次后，在培養(yǎng)板中加入ImL JC-1染色工作液，在37°C，體積分?jǐn)?shù)為5% 的C〇2培養(yǎng)箱中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，解育20min。用預(yù)熱的解育緩沖液將細(xì)胞進(jìn)行清洗;最終向 培養(yǎng)板中加入ImL PBS，在巧光顯微鏡進(jìn)行拍照。W轉(zhuǎn)染無(wú)活性的脫氧核糖iDz的細(xì)胞作為 陰性對(duì)照，W終濃度為化M的氧化憐酸化抑制劑CCCP預(yù)處理20min的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。
[0048] 從圖7中我們可W看到，脫氧核酶作用后，細(xì)胞線粒體中JC-1單體明顯增加，而轉(zhuǎn) 染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑GT-D組并沒(méi)有明顯變化。該結(jié)果進(jìn)一步 證明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子通過(guò)激活細(xì)胞線粒體調(diào)亡途徑來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的調(diào) 亡。
[0049] 實(shí)施例7
[0050] W2X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2血，預(yù)培養(yǎng)2地。W無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染化-SA化4-12地，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至4她。按照 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(上海貝博公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作:使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶 消化貼壁細(xì)胞，2000g離屯、5min，棄上清，細(xì)胞采用預(yù)冷的PBS洗涂?jī)纱?，體積分?jǐn)?shù)為75 %的 冰凍乙醇-20°C固定化，然后用冷PBS洗涂一次，并用10化L冷PBS重懸；在上述體系中加入 RNase A溶液20化，37°C水浴30min去除細(xì)胞中的RNA;加入300化PI染液，輕輕混勻后4°C避 光解育30min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的周期阻滯情況。
[0051] 圖8所示，與對(duì)照組相比，脫氧核酶化-SALL4-12的轉(zhuǎn)染能夠使乳腺癌MCF7細(xì)胞系 G2期比率由14.7 %增加到21.8 %，使S陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞G2期阻滯由13.8 %增加 到22%，而轉(zhuǎn)染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑GT-D組細(xì)胞G2期含量并無(wú) 明顯變化。該結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶分子能夠有效實(shí)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系的G2期 周期阻滯，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
[0化2] 實(shí)施例8
[0053] W3X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2mL，預(yù)培養(yǎng)2地。待培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)板面積的90%時(shí)，用黃槍頭沿直線方向劃 出"傷口"，PBS清洗一次W去除細(xì)胞碎片。W無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染脫氧核酶化-SA化4-12,4h后 換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔1化用倒置顯微鏡拍照，并測(cè)定單細(xì)胞層中"傷口"的間隔距離。
[0054] 從圖9中我們可W觀察到，與對(duì)照組相比，脫氧核酶化-SALL4-12的實(shí)驗(yàn)組乳腺癌 細(xì)胞的遷移速率顯著降低，而轉(zhuǎn)染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑GT-D組 遷移速率無(wú)明顯變化。該結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的 遷移能力。
[0化5] 實(shí)施例9
[0056] W2X 105細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng) 基2mL，預(yù)培養(yǎng)2地。W無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染脫氧核酶化-SA化4-12地，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至 4她。使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶消化貼壁細(xì)胞，W含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1 %牛血清 白蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，向孔徑為0.祉m的化answell小室的上室加入2 X 1〇4個(gè)細(xì)胞，在化answell下室中加入6(K)化含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地。培養(yǎng)至?xí)r間后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的冰乙醇4°C固定20min。用一次性的 醫(yī)用棉簽擦除上室中未穿過(guò)的細(xì)胞，穿過(guò)半透膜的細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的結(jié)晶紫/PBS 溶液染色20min，PBS清洗S次后，W倒置顯微鏡拍照。
[0057] 從圖10中我們可W清楚觀察到，與對(duì)照組相比，脫氧核酶化-SA化4-12作用后實(shí)驗(yàn) 組下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而轉(zhuǎn)染無(wú)義脫氧核酶iDz實(shí)驗(yàn)組W及單獨(dú)加入轉(zhuǎn)染試劑GT-D 組細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯變化。該結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脫氧核酶對(duì)乳腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能 力有顯著的抑制作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向SALL4基因的脫氧核酶分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3SSEQIDN0.4K*。2. 權(quán)利要求1所述的一種靶向SALL4基因的脫氧核酶分子在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106047874SQ201610383360
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】李全順, 興振, 王旭, 楊潔冰, 楊艷, 施維
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)