具有持續(xù)高爾基體靶向成像能力的碳點及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物成像技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗光漂白、具有持續(xù)高爾基體靶向成像能力的碳點及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高爾基體(Golgi apparatus, Golgi complex)是真核細胞的細胞器之一，既是蛋白質(zhì)修飾、分選、水解加工的場所，又是分泌物質(zhì)的轉(zhuǎn)運站。高爾基體的熒光成像對研宄細胞內(nèi)生理活動及與高爾基體相關(guān)疾病的生理過程都有重要作用。自1985年Lipsky等將NBDC6-Ceramide用于高爾基體焚光成像后，神經(jīng)酰胺類似物便成為高爾基體焚光革E向定位的常用染料。但是這種神經(jīng)酰胺類似物隨著細胞的代謝也會出現(xiàn)在線粒體與細胞質(zhì)膜上，且實際應(yīng)用表明該類物質(zhì)具有細胞毒性。因此，非常有必要發(fā)展一種生物相容性好，具有長時間高爾基體靶向性能的熒光探針。
[0003]碳量子點(carbon quantum dots，簡稱碳點)，是繼富勒稀、碳納米管及石墨稀之后最熱門的碳納米材料之一。碳點不僅呈現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)活性與較小尺寸的特性，且生物相容性良好。從2004年碳點首次報道以來，許多研宄者通過改變碳源及合成方法制備出了一系列不同熒光顏色與量子產(chǎn)率的碳點。目前，碳點已廣泛應(yīng)用于生物成像，但是其在單個細胞中的分布較為分散，并不能對細胞中的某個細胞器進行精確定位。
[0004]因此制備一種具有良好生物相容性，且同時具有良好高爾基體靶向與成像能力的碳點是一項非常有挑戰(zhàn)性且應(yīng)用前景極好的工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有持續(xù)高爾基體靶向成像能力的碳點及其制備方法，所述碳點能夠精確對細胞中尚爾基體進彳丁定位，且具有良好的抗光漂白性和生物相容性。
[0006]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案達到所述目的:
[0007]1、具有持續(xù)高爾基體革E向成像能力的碳點，制備方法包括如下步驟:
[0008]I)、按檸檬酸與L-半胱氨酸的質(zhì)量比為1:0.25?1:1的比例，取檸檬酸并在150?250°C條件下加熱O?20min，獲得產(chǎn)物A ；
[0009]2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和產(chǎn)物A混合，140?250°C加熱3?60min，獲得固體產(chǎn)物B ;
[0010]3)、先用氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液將步驟2)所獲固體產(chǎn)物B的pH調(diào)至6?8，然后用0.22 μ m的濾膜進行過濾，再用截留分子量500?100Da的透析袋透析12?48h，冷凍干燥即得碳點。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟I)中所述檸檬酸與L-半胱氨酸的質(zhì)量比為1:1。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟I)中所述加熱溫度為200°C，加熱時間為20min。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟2)中所述加熱溫度為150°C，加熱時間為50min。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟3)中先用氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液將步驟2)所獲固體產(chǎn)物B的pH調(diào)至7。
[0015]2、制備具有持續(xù)高爾基體靶向成像能力的碳點的方法，包括如下步驟:
[0016]1)、按檸檬酸與L-半胱氨酸的質(zhì)量比為1:0.25?1:1的比例，取檸檬酸并在150?250°C條件下加熱O?20min，獲得產(chǎn)物A ；
[0017]2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和產(chǎn)物A混合，140?250°C加熱3?60min，獲得固體產(chǎn)物B ;
[0018]3)、先用氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液將步驟2)所獲固體產(chǎn)物B的pH調(diào)至6?8，然后用0.22 μ m的濾膜進行過濾，再用截留分子量500?100Da的透析袋透析12?48h，冷凍干燥即得碳點。
[0019]本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)，L-半胱氨酸的量相對太少或者加入半胱氨酸后的溫度太高都會使碳點的靶向成像能力減弱，因此，本發(fā)明通過實驗研宄最終獲得檸檬酸與L-半胱氨酸的最佳質(zhì)量比范圍，以及加熱的溫度范圍。
[0020]另外，在本發(fā)明中，步驟2)中會產(chǎn)生硫化氫氣體，所以需要注意廢氣的處理以免對人體造成傷害，在加熱的過程中需要用玻璃棒將兩種物質(zhì)攪拌均勻。
[0021]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明首先在稍高的溫度下將檸檬酸熱解縮合成較小的碳點骨架，然后再在稍低溫度下與L-半胱氨酸縮合，在最終形成碳點的同時也使碳點表面帶上大量半胱氨酸殘基，最終獲得藍色熒光強度高且具有持續(xù)高爾基體靶向能力的碳點，避免了常規(guī)方法繁冗的后續(xù)修飾步驟。通過本發(fā)明所述方法獲得的藍色碳點的絕對量子產(chǎn)率高達68%，且該碳點具有良好的抗光漂白性和生物相容性，為檢測細胞生理過程與疾病診斷等提供了更精確的幫助。
【附圖說明】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0023]圖1碳點的高分辨透射電鏡圖片，其中a圖為在較低放大倍數(shù)下大量碳點的宏觀圖片，b圖為較高放大倍數(shù)下碳點面內(nèi)晶格圖，c圖為較高放大倍數(shù)下碳點面間晶格圖。
[0024]圖2碳點的X射線光電子能譜圖，其中a圖為碳點總體的X射線光電子能譜，b圖為Cls的X射線光電子能譜，c圖為N Is的X射線光電子能譜，d圖為S 2p的X射線光電子能譜；a圖中位于285eV左右的峰歸屬于碳元素，399eV左右的峰歸屬于氮元素，531eV左右的峰歸屬于氧元素，163eV左右的峰歸屬于硫元素；b圖中鍵能為288.0eV的峰歸屬于羰基碳，鍵能為285.2eV的峰歸屬于與氮氧硫等以單鍵相連的碳，鍵能為284.6eV的峰歸屬于與其他碳原子單鍵相連的碳；c圖中鍵能為399.3eV的峰為吡啶型N的峰，400.1eV的峰為吡咯型N的峰；(1圖中可分別得到S 2pl/2與S 2p3/2的電子結(jié)合能，它們分別位于164.5eV與 162.8eV ；
[0025]另圖中符號代表如下:C:碳元素；N:氮元素；0:氧元素；S:硫元素；1，2:主量子數(shù)；s，P:原子軌道；1/2，3/2:磁量子數(shù)和自旋量子數(shù)的和，其中自旋量子數(shù)取得是1/2和 _1/2。
[0026]圖3碳點的傅立葉轉(zhuǎn)換紅外吸收光譜，圖中符號代表如下:
[0027]-OH:羥基；-NH:氨基；-SH:巰基；C = O:羰基；C00-:酯；_CH⑴:烷基;_CH(2):燒基;
[0028]34300^^3240011^2978011^25260^^17080^^15810^^13880^1分別表示碳點中輕基、氣基、燒基(I)、疏基、幾基、醋、燒基(2)的紅外特征吸收峰。
[0029]圖4碳點的熒光光譜與紫外可見吸收光譜及其在自然光和紫外光下的圖片；碳點的焚光最大發(fā)射位于420nm處，最大激發(fā)位于350nm處；碳點在350nm處有良好的紫外吸收，在245nm左右有良好的紫外吸收肩峰；a圖為自然光下圖片，b圖為紫外光下圖片。
[0030]圖5碳點的細胞毒性實驗結(jié)果。
[0031]圖6碳點靶向高爾基體在轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)下的照片；其中，a圖為共聚焦顯微鏡下與碳點共同孵育的喉癌細胞(HEP2)明場圖，b圖為共聚焦熒光顯微鏡下碳點的熒光圖片(藍色)，c圖為共聚焦熒光顯微鏡下高爾基體特異性熒光染料NBD C6-ceramide的熒光圖，d圖為明場與熒光通道下圖片的重合圖。
[0032]圖7以D-半胱氨酸、硫代乙酰胺、L-丙氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸為碳源獲得的碳點的細胞成像圖；其中，圖ai_a3依次為D-半胱氨酸碳點的細胞成像圖，圖b i_b3依次為硫代乙酰胺碳點的細胞成像圖，圖C1-C3依次為L-丙氨酸碳點的細胞成像圖，圖d「屯依次為S-甲基-L-半胱氨酸碳點的細胞成像圖，其中，I為細胞的明場圖，2為熒光成像圖，3為明場圖和熒光圖的疊加圖，標(biāo)尺為20 μm。
[0033]圖8碳點長時間靶向高爾基體的轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝圖片涸士-屯為不同時間下碳點在熒光通道下的圖片，a2-d2S細胞在明場通道與熒光通道下的疊加圖。
[0034]圖9碳點抗光漂白性能研宄結(jié)果叫-屯為碳點在熒光顯微鏡激光下連續(xù)激發(fā)60min的圖片，a2-d2為高爾基體熒光染料NBD C6-ceramide在熒光顯微鏡激光下連續(xù)激發(fā)60min的圖片，a3-d#激發(fā)不同時間點明場與熒光通道重合后的圖片。
【具體實施方式】
[0035]下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0036]所用試劑包括:檸檬酸(上海晶純生化科技股份有限公司，上海)，氫氧化鉀(重慶川東化工(集團)有限公司，重慶)，實驗中所用試劑均為分析純，所用水均為超純水(18.2M，Mil1-Q)。
[0037]所用儀器包括:MILIP0RE(美國)超純水機；QL_901型漩渦混勻器(海門市其林貝爾器材制造有限公司)；DF-101S即熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；95-2定時雙向磁力加熱攪拌器(金壇市友聯(lián)儀器研宄所)；ΚΧΗ2-02-1ΑΒ恒溫干燥箱(中國上海科析試驗儀器廠，成都科析試驗成套公司)；透析袋MD31 (500-1000)(上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司)；0.22μπι濾頭(重慶市鈦新化工有限公司)；FTIR-8400S傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(日立，日本)；高倍透射電鏡(Tecnai G2F20S-TWIN microscopy) ；ESCALAB250X-rayphotoelectron spectrometer ;紫外可見分光光度計(Shimadzu, Japan);焚光分光光度計(Hitachi, Japan) ；Absolute PL Quantum yield Spectrum Cl1347(HAMAMATSU, Japan);奧林巴斯轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯，日本)。
[0038]本發(fā)明所述碳點的制備方法包括如下步驟:
[0039]I)、檸檬酸熱解:按檸檬酸與L-半胱氨酸的質(zhì)量比為1:0.25?I的比例，取檸檬酸加入圓底燒瓶，在150?250°C加熱O?20min ；
[0040]2)、混合物熱解:步驟I)完畢后，向圓底燒瓶中繼續(xù)加入配比量的L-半胱氨酸，140?250°C繼續(xù)加熱3?60min，獲得固體產(chǎn)物；
[0041]3)、酸堿中和:向步驟2)獲得的固體產(chǎn)物中加入氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，至整個溶液pH呈6-8為止；
[0042]4)、純化:將步驟3)得到的中性溶液用0.22 μπι的濾膜過濾，然后用截留分子量為500?100Da的透析袋透析12?48小時，透析后冷凍干燥即得碳點。
[0043]實施例1碳點的制備
[0044]碳點的制備方法如下:
[0045]I)、檸檬酸熱解:將2