本發(fā)明屬于微納米功能材料技術領域，涉及一種兼具熒光可視、磁靶向和pH敏感功能的無機納米復合藥物載體的制備方法。

背景技術：

腫瘤是目前威脅人類健康的重大疾病之一，近年來，隨著人們對腫瘤認識的深化和診斷手段的提高，癌癥的治療已經取得長足的進步。治療腫瘤的普遍方法，如化學藥物療法，放射線療法及手術切除等，仍具有一定的不足。比如說，當前口服或注射的抗癌藥物都是全身給藥，抗癌藥物在殺死腫瘤細胞的同時亦可損害患者的免疫系統(tǒng)，而且會導致患者的進一步健康惡化。因此人們期望化療藥物能夠定點定量的運送到病變位置，實現(xiàn)病變位置局部治療的效果。因此，迫切的需要開發(fā)一種生物相容性好、體內可降解的化療藥物的運載體應用到生物體內。目前，所制備的一些藥物載體，成本較高，實驗條件苛刻，制備工藝復雜，載體材料生物相容性較差難以應用到生物體內。

技術實現(xiàn)要素：

針對目前的藥物載體成本高、制備工藝復雜且生物相容性較差的技術問題，本發(fā)明提供了一種兼具熒光可視、磁靶向功能和pH敏多功能的復合空心微球藥物載體，該藥物載體的結構為空心球狀ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺的微納米復合空心微球；其中，空心球狀ZnO粒徑為200～1000nm，F(xiàn)e₃O₄的粒徑為8～15nm，ZnS:Mn²⁺粒徑為3～6nm；空心球狀ZnO、Fe₃O₄@PEG納米粒子和ZnS:Mn²⁺量子點的摩爾比為1:1:(3～5)；Fe₃O₄@PEG按照Fe₃O₄的物質的量計算。

其制備方法具體如下：

1)空心球狀ZnO制備：配置20mL的0.03～0.04mol/L Zn(AC)₂·2H₂O乙醇溶液，加入0.4～0.8mL 200～1000nm的聚苯乙烯微球，恒溫55～65℃下攪拌1.5～2h。隨后將20mL的0.035～0.045mol/L NaOH乙醇溶液加入其中，攪拌2～4h，所得產物用乙醇洗滌2～3次，干燥并研磨后，在270～280℃下煅燒20～30min，制得的空心球狀ZnO，其粒徑為200～1000nm。

2)Fe₃O₄@PEG納米粒子的制備：將FeCl₃·6H₂O,FeCl₂·4H₂O和PEG-4000溶于水中，三者摩爾比為1:0.6:(0.0026～0.0038)，在室溫下攪拌10～20min。把混合的溶液轉移到反應容器中，加入濃度為25％的氨水，其中鐵離子與氨水中NH₃·H₂O的摩爾比為1.6:(1.3～1.4)。在85～95℃恒溫水浴下攪拌反應3～4h，得到黑色均勻的懸浮液。自然冷卻反應體系至室溫，利用磁性富集收集產物，并依次用去離子水和乙醇進行洗滌、干燥后，制得Fe₃O₄@PEG納米粒子，其粒徑為8～15nm。

3)ZnS:Mn²⁺量子點的制備：將Zn(AC)₂·2H₂O和Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL水中，二者摩爾比按照摻雜比計，在室溫下攪拌溶解。向上述溶液中分別加入9.75mL油酸、0.004～0.005mol的油酸鈉和16.25mL乙醇，在室溫下攪拌1～2h得到混合溶液。然后將0.004mol Na₂S·9H₂O溶于6.5mL水中，室溫下攪拌10～20min后加入到上述混合溶液中，攪拌2～3h。然后在190～210℃下燒結10～12h。取出產物后，用1:1的乙醇和環(huán)己烷的混合溶液進行超聲，離心，反復3～5次清洗。最后，在80℃的干燥箱中干燥3～5小時，得到ZnS:Mn²⁺量子點，在室溫條件下充分研磨后備用；所制得的ZnS:Mn²⁺粒徑為3～6nm。

4)按照摩爾比1:1:3～5稱取空心球狀ZnO、Fe₃O₄@PEG納米粒子和ZnS:Mn²⁺量子點。

5)將上述納米粒子分別分散于乙醇中，三者摩爾濃度分別為：空心球狀ZnO0.01mol/L，F(xiàn)e₃O₄@PEG納米粒子0.0015～0.003mol/L，ZnS:Mn²⁺量子點0.0045～0.015mol/L。

6)在55～70℃勻速攪拌條件下向空心球狀ZnO的乙醇溶液中同時逐滴加入Fe₃O₄@PEG納米粒子乙醇溶液和ZnS:Mn²⁺量子點乙醇溶液，滴加速度為10～15mL/min，滴加時間控制在20分鐘以內，滴加完成后保持溫度和攪拌速度2h；所述攪拌的速度為240～300r/min。

7)通過磁性富集，收集產物，經乙醇洗滌并干燥后得到最終產物。

本發(fā)明中所使用的空心球狀ZnO、Fe₃O₄@PEG納米粒子和ZnS:Mn²⁺量子點的摩爾比為1:1:(3～5)；ZnS:Mn²⁺量子點摻雜比例優(yōu)選1％。

步驟5)的分散方式優(yōu)選超聲分散處理。

步驟6)中滴加速度優(yōu)選每分鐘10滴，每滴1mL；攪拌的速度優(yōu)選240r/min。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用自組裝的方法制備ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺藥物載體，針對Fe₃O₄會導致ZnS:Mn²⁺熒光猝滅而導致發(fā)光性能喪失，通過表面修飾，抑制Fe₃O₄納米顆粒與ZnS:Mn²⁺量子點接觸后的熒光猝滅效應，提高載體體系的熒光效率，保障熒光成像功能的實現(xiàn)。并利用ZnO中空結構的比表面積大、負載能力強的優(yōu)勢，提高載藥體系的載藥率。實現(xiàn)了材料生物相容性好，制備工藝簡單，實驗條件溫和，成本低廉，且兼具熒光可視、磁靶向和pH敏多功能的復合空心微球藥物載體。

附圖說明

圖1本發(fā)明實施例1中Fe₃O₄納米粒子的透射電鏡圖。

圖2本發(fā)明實施例1中ZnS:Mn²⁺量子點的透射電鏡圖。

圖3本發(fā)明實施例1中ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的透射電鏡圖。

圖4本發(fā)明實施例1中ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的元素面掃描圖。

圖5本發(fā)明實施例1所制備的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體和Fe₃O₄納米粒子的磁滯回歸曲線。

圖6 ZnS:Mn²⁺量子點和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的熒光光譜圖。

圖7本發(fā)明所制備的空心球狀ZnO的MTT圖。

圖8本發(fā)明所制備的Fe₃O₄納米粒子的MTT圖。

圖9本發(fā)明所制備的ZnS:Mn²⁺量子點的MTT圖。

圖10本發(fā)明所制備的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的MTT圖；圖7至圖10中橫坐標為濃度，縱坐標為細胞存活率。

圖11本發(fā)明所制備的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體在不同pH值下的釋藥曲線圖。橫坐標為時間，縱坐標為釋藥率。

具體實施方式

實施例1

1)空心球狀ZnO的制備：配置20mL的0.03～0.04mol/L Zn(AC)₂·2H₂O乙醇溶液，加入0.4～0.8mL 200～1000nm聚苯乙烯微球，恒溫55～65℃下機械攪拌1.5～2h。隨后將20mL的0.035～0.045mol/L NaOH乙醇溶液加入其中，機械攪拌2～4h，所得產物用乙醇洗2～3次，干燥并研磨后，在270～280℃下煅燒20～30min，制得的空心球狀ZnO，粒徑為200～1000nm。

2)Fe₃O₄@PEG納米粒子的制備：將FeCl₃·6H₂O,FeCl₂·4H₂O和PEG-4000溶于水中，三者摩爾比為1:0.6:(0.0026～0.0038)，在室溫下攪拌10～20min。把混合的溶液轉移到500mL的三頸燒瓶中，加入濃度為25％的氨水，其中鐵離子與氨水中NH₃·H₂O的摩爾比為1.6:1.3～1.4。在85～95℃恒溫水浴下機械攪拌3～4h，得到黑色均勻的懸浮液。讓三頸燒瓶自然冷卻至室溫，通過磁鐵來分離收集沉淀物，并用去離子水和乙醇進行洗滌后，在50～60℃干燥10～14h，制得的Fe₃O₄@PEG，其粒徑為8～15nm。

3)ZnS:Mn²⁺(1％)量子點的制備：將Zn(AC)₂·2H₂O和Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL水中，二者摩爾比為100:1，在室溫下攪拌10～20min。向上述溶液中分別加入9.75mL油酸、0.004～0.005mol的油酸鈉和16.25mL乙醇，在室溫下磁力攪拌1～2h。將0.004molNa₂S·9H₂O溶于6.5mL水中，室溫下攪拌10～20min后加入到上述混合溶液中，攪拌2～3h。所得的混合溶液在190～210℃下燒結10～12h。取出產物后，用1:1的乙醇和環(huán)己烷的混合溶液進行超聲，離心，反復3～5次清洗。最后，在80℃的干燥箱中干燥3～5小時，得到最終產物并在室溫條件下充分研磨。所制得的ZnS:Mn²⁺(1％)粒徑為3～6nm。

4)按照摩爾比1:1:3～5稱取空心球狀ZnO、Fe₃O₄@PEG納米粒子和ZnS:Mn²⁺(1％)量子點。

5)將上述納米粒子分別分散于乙醇中，三者摩爾濃度分別為：空心球狀ZnO 0.01mol/L，F(xiàn)e₃O₄@PEG納米粒子0.0015～0.003mol/L，ZnS:Mn²⁺量子點0.0045～0.015mol/L。

6)在55～70℃勻速攪拌條件下向空心球狀ZnO的乙醇溶液中同時逐滴加入Fe₃O₄@PEG納米粒子乙醇溶液和ZnS:Mn²⁺量子點乙醇溶液，滴加速度為10～15mL/min，滴加時間控制在20分鐘以內，滴加完成后保持溫度和攪拌速度2h；所述攪拌的速度為240～300r/min。

7)通過磁性富集，收集產物，經乙醇洗滌并干燥后得到最終產物。

實施例2

1)空心球狀ZnO制備：a.0.1580gZn(AC)₂溶解在20mL乙醇中，0.032gNaOH溶解在20mL乙醇中。b.向Zn(AC)₂乙醇溶液中加入0.8mL聚苯乙烯微球恒溫60℃下機械攪拌1.5h。c.將NaOH乙醇溶液加入到b的溶液中機械攪拌3h。D.產物用乙醇洗2-3次，干燥，研磨。e.280℃下煅燒30min。

2)Fe₃O₄@PEG納米粒子的制備：a.FeCl₃·6H₂O(2.7022g),FeCl₂·4H₂O(1.1929g)和PEG-4000(10g)溶解在150mL去離子水中，在室溫下攪拌十分鐘。b.把混合的溶液轉移到500mL的三頸燒瓶中，向混合溶液中加入100mL的氨水(25％)，讓其在恒溫水浴90℃下機械攪拌3h，得到黑色均勻的懸浮液。c.當三頸燒瓶自然冷卻至室溫，通過磁鐵來分離收集沉淀物，并用去離子水和乙醇進行洗滌。d.50℃干燥12h。

3)ZnS:Mn²⁺(1％)量子點的制備：稱取0.8561g Zn(AC)₂·2H₂O、0.0096g Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL去離子水中，室溫磁力攪拌10min后，加入9.75mL油酸，1.3g油酸鈉，16.25mL乙醇，室溫磁力攪拌1h得到混合溶液；稱取0.9367g Na₂S·9H₂O溶于6.5mL去離子水中，室溫磁力攪拌10min后，將其加入上述混合溶液中，室溫磁力攪拌2h。然后轉移至190℃的干燥箱中燒結12h。取出產物后，利用乙醇和環(huán)己烷的混合液(乙醇和環(huán)己烷的比例為1:1)對其進行超聲，離心，反復清洗3次后，在80℃干燥箱中干燥3h，得到粉末物質，在室溫條件下充分研磨。

4)樣品溶解，具體為：0.0244g空心球狀ZnO，0.0695g Fe₃O₄@PEG納米粒子，0.146g ZnS:Mn²⁺(1％)量子點分別分散在30mL、150mL、150mL的乙醇中，并分別進行10s、20s、60s的超聲分散。

5)載體復合，具體為：先將空心球狀ZnO的乙醇溶液加入三頸燒瓶中60℃恒溫機械攪拌，再將Fe₃O₄@PEG納米粒子的乙醇溶液、ZnS:Mn²⁺(1％)量子點的乙醇溶液同時逐滴加入，每分鐘10滴，每滴1毫升，在20分鐘內同時逐滴加入到上述三頸燒瓶中，在60℃恒定溫度下以240轉/分鐘的速度機械攪拌2h。

6)產物富集：快速將(3)中的上層混濁液倒入燒杯中，隨后將燒杯放置在半徑3cm高2cm圓柱形的磁鐵上,利用復合材料體系的磁性富集產物3分鐘，待上層液體澄清后，將上清液倒出，收集燒杯底部產物。

7)洗樣：用乙醇洗2-3次。

效果驗證

如圖1～圖3所示分別為Fe₃O₄納米粒子、ZnS:Mn²⁺量子點、ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的透射電鏡圖。由圖3可見，ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合微球為空心結構的尺寸在820nm左右。

如圖4所示為ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合微球的元素面掃描圖，可見其中含有Zn、Fe、S、Mn、O元素，且分布均勻，呈空心結構。

如圖5所示是Fe₃O₄納米粒子和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體的M-H曲線。圖中可見，所制備的Fe₃O₄納米粒子的飽和磁化強度為35emu/g，而復合空心微球藥物載體的飽和磁化強度在15emu/g，雖然磁飽和強度有所減小，但已經達到磁靶向功能的要求。

如圖6所示ZnS:Mn²⁺量子點(a)和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球藥物載體(b)的PL圖。由圖可見，復合空心微球藥物載體組裝后，更有利于ZnS:Mn²⁺的橙黃光發(fā)射，發(fā)光效率有所提高。

如圖7～圖10所示分別為空心球狀ZnO、Fe₃O₄納米粒子、ZnS:Mn²⁺量子點以及ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球對海拉細胞存活率的檢測，從圖中可以看出細胞存活率在樣品濃度為100ug/mL時分別為91.5％，90.2％，87％，89.2％，基本無毒性。

如圖11所示是所制備的DOX裝載的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球在不同PH值下的釋藥曲線圖。圖中分別為DOX裝載的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺復合空心微球在pH＝5.5，6.3，7.2的阿霉素(DOX)釋放率分別為44.68％，36.91％，10.82％。