本發(fā)明涉及基因載體領(lǐng)域，具體地說，涉及一種靶向型多肽納米基因載體復(fù)合物。
背景技術(shù)：
：基因治療是將基因(主要為DNA或siRNA)傳遞到特定細(xì)胞中，從而促進(jìn)或抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá)，達(dá)到治療人類疾病的目的，由于DNA或siRNA容易被核酸酶降解，并且多帶負(fù)電荷導(dǎo)致其難以通過同樣帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，故需要利用基因載體來保護并傳遞核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。理想的基因載體應(yīng)該保證高轉(zhuǎn)染效率的同時，具有良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性，除此之外，對特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染也是基因載體需要具備的特征之一。因此，發(fā)展具有高效、低毒且具有靶向功能的基因載體是基因治療成功應(yīng)用的重要前提?；蜉d體分病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體雖然具備高轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)點，卻存在很大的安全隱患，高免疫原性可引起機體免疫原性，并且存在激活原癌基因引發(fā)腫瘤的風(fēng)險。非病毒載體的優(yōu)勢在于免疫原性低，生產(chǎn)制備簡單，對基因材料要求限制少等。非病毒載體分為聚合物和脂質(zhì)體兩大類，前者包括聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚氨基酸、樹枝狀大分子等；后者以陽離子脂質(zhì)體為代表。這些載體的共同特點是都帶有大量正電荷，通過靜電吸附作用攜帶基因物質(zhì)。聚乙烯亞胺是一種轉(zhuǎn)染效率高且被廣泛應(yīng)用的基因載體材料，但由于它不可降解，毒性大等原因抑制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。近年來，生物可降解的聚陽離子材料漸漸引起了研究者的關(guān)注。相比不可降解的聚合物材料，多肽及其衍生物類材料由于其類蛋白質(zhì)的組成，具有低毒低富集，生物相容性好的特點，有望成為理想的基因載體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和人類對腫瘤發(fā)病機制認(rèn)識的不斷深入，基因治療逐漸成為腫瘤生物學(xué)治療中的重要組成部分。而對體內(nèi)特定細(xì)胞類型的基因轉(zhuǎn)染是基因治療可以成功的關(guān)鍵因素。近年來，腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞成分，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞逐漸引起了人們的關(guān)注。針對腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的基因治療，阻礙間質(zhì)細(xì)胞對腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用，從而達(dá)到輔助常規(guī)治療辦法的手段是一種很有應(yīng)用前景的策略。CN102114000A公開了一種同時包載抗癌多肽和基因或化療藥物或放療藥物的共輸送脂質(zhì)納米遞藥系統(tǒng)。所述遞藥系統(tǒng)由尋靶材料、脂質(zhì)成分和藥物組成，其充分利用組分間的性狀差異，或通過靜電吸附進(jìn)行包載，或通過被動結(jié)合主動載藥的方法，實現(xiàn)將不同藥物共同包載到脂質(zhì)納米遞藥系統(tǒng)中，將可恢復(fù)抑癌蛋白p53活性的抗癌多肽和基因藥物或化療藥物或放療藥物同時遞送入靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到協(xié)同治療的目的。然而，該發(fā)明所述納米遞藥系統(tǒng)存在構(gòu)建步驟復(fù)雜，靶向修飾過程繁瑣，靶向修飾合成效率低等問題，且脂質(zhì)體穩(wěn)定性有待改進(jìn)，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。CN104288776A公開了一種自組裝多肽—凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。所述的自組裝多肽—凋亡素基因復(fù)合納米顆粒是由自組裝多肽作為載體，通過自身的酸性氨基酸和堿性氨基酸所帶的電荷與攜帶凋亡素基因的質(zhì)粒分子之間形成離子鍵結(jié)合，質(zhì)粒分子牢固粘附于自組裝多肽表面，形成復(fù)合納米顆粒。該復(fù)合納米顆粒呈纖維狀，長度為100～200nm，直徑為10～20nm。該納米顆粒表面富含精氨酸，能與細(xì)胞膜表面精氨酸受體識別結(jié)合并被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其所攜帶的基因，所表達(dá)的凋亡素蛋白能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對正常細(xì)胞無毒。然而，其由于所公布的載體無靶向性，所述精氨酸受體無特異性，限制了其對特定細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染和生物體內(nèi)轉(zhuǎn)染。因此，亟需開發(fā)一種高效、低毒、制備簡易且具備腫瘤靶向作用的多肽納米基因載體復(fù)合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種靶向型多肽納米基因載體復(fù)合物(PNP/DNA/抗體復(fù)合物或PNP/siRNA/抗體復(fù)合物)。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明首先提供了一種具備腫瘤靶向作用的多肽納米基因載體復(fù)合物，其由帶正電荷的納米基因載體、基因藥物和具備腫瘤靶向的抗體構(gòu)成；所述納米基因載體上吸附有基因藥物和具備腫瘤靶向的抗體；所述納米基因載體由多肽和疏水性功能分子偶聯(lián)構(gòu)成。作為優(yōu)選，多肽與基因藥物的正負(fù)電荷比(N:P)為20:1～50:1。其中，所述基因藥物為siRNA和/或DNA。進(jìn)一步地，所述多肽為分子量在1.5kDa～4kDa之間兩親性穿膜肽，優(yōu)選為多聚精氨酸；所述疏水性功能分子為膽固醇。作為優(yōu)選，多肽與抗體的質(zhì)量比為10:1-5:1。作為優(yōu)選，所述納米基因載體的粒徑在50～110nm之間。進(jìn)一步地，所述多肽納米基因載體復(fù)合物的制備方法為：(1)將多肽和疏水性功能分子偶聯(lián)構(gòu)成的兩親性結(jié)合物溶解在少量二甲基亞砜中使其充分分散，取少量上述二甲基亞砜溶液加入水(或磷酸鹽緩沖液)中在100W超聲條件下超聲5-10min，自組裝得到帶正電荷的納米基因載體；上述二甲基亞砜溶液加入水(或磷酸鹽緩沖液)后的體系中，兩親性結(jié)合物的濃度不低于32.4mgL-1；考慮到二甲基亞砜對細(xì)胞的毒性，二甲基亞砜在該體系中質(zhì)量比不應(yīng)超過1％；(2)將基因藥物的水溶液與步驟(1)所得溶液混合，室溫靜置20～30min，通過靜電吸附作用形成納米基因載體與基因藥物的復(fù)合物；(3)向步驟(2)所得溶液中加入抗體，室溫孵育，通過靜電吸附作用形成多肽納米基因載體復(fù)合物。進(jìn)一步地，所述抗體為靶向腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的抗體，優(yōu)選為抗成纖維細(xì)胞活化蛋白抗體(anti-FAP-α)。本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過自組裝形成納米基因載體并攜帶小干擾核酸，表面吸附靶向腫瘤組織的抗體。利用帶豐富正電荷的納米基因載體吸附具有靶向性、帶負(fù)電的抗體，可避免帶正電的納米基因載體在體內(nèi)循環(huán)中被清除，同時又能提高靶向能力。該方法過程簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作。此外，本發(fā)明所述納米基因載體由多肽和疏水性功能分子偶聯(lián)構(gòu)成兩親性結(jié)合物，該兩親性結(jié)合物的自組裝過程中不生成共價健，沒有逆反應(yīng)，可形成高度有序的納米結(jié)構(gòu)，特別適合于構(gòu)建生物醫(yī)用材料。附圖說明圖1為PNP/DNA/抗體復(fù)合物粒徑(A)及Zeta電位的影響(B)。其中，PNP代表納米基因載體，PNP/DNA代表納米基因載體/DNA復(fù)合物，PNP/DNA/抗體代表納米基因載體/DNA/抗體復(fù)合物。圖2為PNP/DNA/抗體復(fù)合物電鏡形貌。圖3為PNP/siRNA/抗體復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果。圖4為PNP/siRNA/抗體復(fù)合物細(xì)胞毒性實驗結(jié)果。圖5為PNP/siRNA/抗體復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞攝取實驗結(jié)果。圖6為蛋白免疫印記分析PNP/siRNA/抗體復(fù)合物的體外基因敲擊效率。圖7為正負(fù)電荷比(N:P)對轉(zhuǎn)染效率的影響。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1兩親性結(jié)合物的制備利用二氯三苯甲基氯樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)、和Fmoc保護的L-氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，購自吉爾生化(上海)有限公司)為原料，在各種耦合、裂解試劑存在的條件下，通過固相合成法在樹脂上制備多聚精氨酸的聚合物。再經(jīng)過簡單的裂解反應(yīng)，將多肽從樹脂上分離下來，經(jīng)后續(xù)的沉淀、洗滌、干燥處理后制得純白色多肽粉末。具體的實驗過程如下：首先，取1.01克二氯三苯甲基氯樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)至多肽合成裝置(購自西格瑪奧德里奇公司)，加入干燥的N，N-二甲基甲酰胺(購自西格瑪奧德里奇公司)浸泡樹脂半小時，使之充分溶脹，最后排出溶劑N，N-二甲基甲酰胺。稱取0.76克Fmoc-Arg(Pbf)-OH用10毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后將該溶液轉(zhuǎn)入到上步含有處理過的樹脂的多肽合成裝置中，再加入2毫升催化劑二異丙基乙胺(DIEA)，室溫下讓Fmoc-Arg(Pbf)-OH與樹脂相互作用約1.5小時，使其充分固定在樹脂上。用N，N-二甲基甲酰胺沖洗樹脂3次，加入甲醇攪拌30分鐘，封閉樹脂上未反應(yīng)的活性位點，并再次用N，N-二甲基甲酰胺溶脹樹脂。然后用體積比為1:4的哌啶(購自西格瑪奧德里奇公司):N，N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)進(jìn)行保護基的脫除，反應(yīng)3次，前兩次各持續(xù)3分鐘，第三次持續(xù)20分鐘。之后再用5mL的N，N-二甲基甲酰胺重復(fù)洗滌樹脂5次，每次持續(xù)1分鐘，直到N，N-二甲基甲酰胺洗液的pH顯中性。稱取1.52克Fmoc-Arg(Pbf)-OH，0.92克2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(購自吉爾生化(上海)有限公司)，0.36克1-羥基苯并三唑(購自吉爾生化(上海)有限公司)，用10毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后將該溶液轉(zhuǎn)入到多肽合成裝置中，再加入2毫升催化劑二異丙基乙胺(DIEA)，室溫下讓Fmoc-Arg(Pbf)-OH與樹脂相互作用約2小時，使其充分連接到上一個氨基酸上，N，N-二甲基甲酰胺沖洗樹脂3次，取少許樹脂加入10％茚三酮的無水甲醇(購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司)中加熱至沸騰，觀察樹脂顏色變化，若樹脂顏色無明顯變化，則說明第二個氨基酸已完全同上一個氨基酸偶聯(lián)，若樹脂變藍(lán)甚至發(fā)黑，則說明第二個氨基酸沒有與前一個氨基酸完全反應(yīng)，需重復(fù)連接。重復(fù)以上步驟繼續(xù)縮合精氨酸，直至第9個精氨酸，隨后連接甘氨酸。用體積比為1:4的哌啶:N，N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)進(jìn)行保護基的脫除之后，加入1.00g膽固醇(購自西格瑪奧德里奇公司)/4mL吡啶(購自西格瑪奧德里奇公司)的混合液，反應(yīng)兩次、每次2小時。做完茚三酮測試，確保膽固醇已經(jīng)完全連接到了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重復(fù)洗滌樹脂5次，每次持續(xù)1分鐘。最后，將多肽從樹脂上裂解下來，具體過程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.85mL1，2-乙二硫醇(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.5mL茴香硫醚(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.5mL去離子水。將樹脂放入上述混合液中進(jìn)行裂解反應(yīng)3小時，之后過濾掉樹脂，在收集到的液體中加入乙醚(購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司)，立即出現(xiàn)白色沉淀。然后，離心分離上述懸濁液，轉(zhuǎn)速為5000rpm、離心時間5分鐘，除去上清液，進(jìn)行冷凍干燥，收集白色多肽粉末，制得分子量2kDa的兩親性結(jié)合物。實施例2PNP/siRNA/抗體復(fù)合物的制備本實施例所述方法同樣適用于PNP/DNA/抗體復(fù)合物的制備，制備時，將本實施例中的siRNA替換為相應(yīng)的DNA即可。PNP/siRNA/抗體復(fù)合物按照如下步驟的方法制備而成：(1)首先將上述制成的兩親性結(jié)合物(分子量2423)制備成10mg/mL的二甲基亞砜(購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司)儲存液。將5μL儲存液稀釋在100μLDEPC水中，超聲5min使其形成顆粒均勻、穩(wěn)定的多肽納米顆粒PNP(即前文所述的納米基因載體)。(2)將negativecontrolsiRNA(委托上海吉瑪公司合成)溶于DEPC水中，震蕩混勻，配置成0.13mg/mL工作液。立即將50μLsiRNA溶液加入到50μL多肽納米顆粒溶液中，輕輕震蕩混勻，室溫孵育20-30min形成PNP/siRNA復(fù)合物。形成的PNP/siRNA復(fù)合物中，PNP與siRNA的電荷比為20:1。(3)將抗體(購自美國R&DSystems公司)干粉用PBS溶解，制備成1mg/mL工作液，按PNP與抗體質(zhì)量比10:1加入抗體。混勻后室溫孵育20-30min形成PNP/siRNA/抗體復(fù)合物。將上述制備的復(fù)合物溶液用PBS緩沖液(購自維森特)稀釋至1mL，放入激光粒度儀自動檢測粒徑和Zeta電位(英國馬爾文公司，型號ZetasizerNanoZS)。粒徑測量結(jié)果如圖1A所示，將上述siRNA替換為DNA，PNP/DNA/抗體平均粒徑90nm左右，分散良好粒徑均一。Zeta電位測量如圖1B所示，可見納米基因載體帶正電荷，為+30mV左右，吸附一定量的DNA后，Zeta電位下降為+25mV左右。進(jìn)一步加入單克隆抗體，抗體與納米基因載體吸附后可見納米顆粒電荷反轉(zhuǎn)，表面Zeta電位下降為-10mV左右。實施例3TEM觀察形貌取實施例2中制備的PNP/siRNA/抗體復(fù)合物溶液10μL用于TEM測試。將復(fù)合物小心地滴到干凈的銅網(wǎng)(購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)，片刻后吸去樣品室溫干燥，用醋酸雙氧鈾(購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)染色8min，室溫干燥至少1h后進(jìn)行電鏡(日本日立公司，型號HT7700)觀察。實驗結(jié)果見圖2。由圖2可見，PNP/DNA/抗體復(fù)合物形成球形納米級粒子，粒徑均一，分散良好。實施例4瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗新鮮制備不同質(zhì)量比的PNP/siRNA復(fù)合物，室溫下孵育20min，加入上樣緩沖液和SYBRGREEN(北京索萊寶科技有限公司)后混勻，將混合溶液載于1％瓊脂糖凝膠上，在TAE電泳緩沖液中100V電壓下電泳5～10min后紫外曝光拍照。瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果如圖3所示。從圖3中可見，與裸siRNA相比，PNP/siRNA復(fù)合物向正極遷移受阻，在PNP：siRNA質(zhì)量比為1:1時，復(fù)合物不帶電荷，滯留在膠孔中，逐漸增加PNP的量，可見復(fù)合物向負(fù)極方向遷移，證明核酸可被完全吸附于PNP/siRNA復(fù)合物中，且復(fù)合物此時帶正電荷。實施例5細(xì)胞毒性實驗將人前列腺癌PC-3細(xì)胞以起始密度1*104/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)18-20h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入200μL含不同濃度(25μg/mL～200μg/mL，以PNP的量計算，PNP：siRNA電荷比均為25：1)的PNP/siRNA、PNP/siRNA/抗體復(fù)合物、PEI25K和Lipofectamine2000，每組4個復(fù)孔，培養(yǎng)24h；吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10％CCK-8試劑(日本同仁化學(xué))的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育1h，用酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度(OD值)，計算相對細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(％)＝(OD樣品組-OD空白孔)/(OD對照組-OD空白孔)*100％其中OD樣品組為個給藥組450nm處吸光度平均值，OD對照組為個未處理細(xì)胞組450nm處吸光度平均值，OD空白孔只加入CCK-8試劑組處吸光度平均值由圖4可知，400μg/mLPNP/siRNA/抗體在所測濃度下，對PC-3細(xì)胞幾乎沒有毒性，相比之下，用PEI25K和Lipofectamine2000(Invitrogen)處理組，細(xì)胞存活率分別下降75％和18％。實施例6基因轉(zhuǎn)染評價(1)細(xì)胞攝取實驗：按上述實施例2制備PNP/siRNA/抗體復(fù)合物(本實施例中siRNA采用FAM標(biāo)記，F(xiàn)AM-siRNA委托上海吉瑪公司合成)，測定其體外轉(zhuǎn)染效果，具體方法如下：以表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAF作為考察對象，將對數(shù)生長的CAF接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1*105個，于37℃和5％CO2培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌三次。然后分別加入熒光標(biāo)記的siRNA及轉(zhuǎn)染復(fù)合物：FAM-siRNA，PNP/FAM-siRNA復(fù)合物和PNP/FAM-siRNA/抗體復(fù)合物于37℃和5％CO2培養(yǎng)6h。收集細(xì)胞，臺盼藍(lán)處理30s猝滅細(xì)胞表面熒光。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞對上述復(fù)合物的攝取情況(結(jié)合圖5所示)。(2)轉(zhuǎn)染效率評價：按實施例2所述的方法制備PNP/siRNA/抗體復(fù)合物，不同的是將negativecontrolsiRNA替換為針對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA特異性siRNA序列(委托上海吉瑪公司合成)。制備的PNP/siRNA/抗體復(fù)合物中，PNP與siRNA的電荷比為25:1；PNP與抗體的質(zhì)量比為10:1。將DEPC水均替換為無血清培養(yǎng)基。將CAF細(xì)胞按每孔將對數(shù)生長的CAF接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1*105個，于37℃和5％CO2培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)到70％融合，將細(xì)胞分為空白對照組，PNP/NC-siRNA/抗體組，PNP/anti-GAPDH組，PNP/anti-GAPDH/抗體組，PNP/anti-GAPDH/IgG組，其中anti-GAPDH為抑制GAPDH表達(dá)的siRNA，而NC-siRNA不對相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)生影響，IgG為所用抗體同種來源同型對照。各對照組siRNA濃度均為100nM。采用Western蛋白免疫印記法測定轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染anti-GAPDHsiRNA對CAF細(xì)胞GAPDH蛋白的抑制作用，重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染48h后取蛋白檢測。曝光結(jié)果見圖6A,從圖6A中可以看出，與PNP/NC-siRNA/抗體組相比，PNP/anti-GAPDH組，PNP/anti-GAPDH/抗體組均顯示出了良好的RNA干擾效果。PNP/anti-GAPDH/IgG組沒有顯示出轉(zhuǎn)染功能，表明表面IgG無法脫落而屏蔽掉了PNP的穿膜功能，這一現(xiàn)象為靶向轉(zhuǎn)染提供了依據(jù)，即PNP/RNA/抗體復(fù)合物只能對表達(dá)其吸附的抗體相應(yīng)抗原的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Western蛋白免疫印記法結(jié)果用光密度軟件ImageJ進(jìn)行分析并計算蛋白相對表達(dá)率。GAPDH蛋白相對表達(dá)率(％)＝(實驗組條帶光密度/對照組條帶光密度)*100％通過光密度分析軟件對圖6A中條帶進(jìn)行分析，以PNP/NC-siRNA/抗體組作為對照組按式進(jìn)行計算，分析結(jié)果見圖6B。對比例1本對比例與實施例6的區(qū)別在于：(2)轉(zhuǎn)染效率評價：改變PNP/siRNA的正負(fù)電荷比(N:P，N表示多肽的氨基基團，P表示核酸的磷酸基團)，探索N:P比值變化對RNA沉默效果的影響。根據(jù)實施例2構(gòu)建不同N:P的PNP/siRNA復(fù)合物(此處忽略抗體對于體系的影響，直接模擬抗體從納米顆粒表面脫落后的轉(zhuǎn)染過程)，不同的是將negativecontrolsiRNA替換為針對綠色熒光蛋白(GFP)的mRNA特異性siRNA序列(委托上海吉瑪公司合成)。將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的人乳腺癌細(xì)胞系MB-MDA-231細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔6*104個，于37℃和5％CO2培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)到70％融合。將不同N:P的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到孔板中，siRNA濃度保持在100nM，每組4個重復(fù)。轉(zhuǎn)染36h后，棄去培養(yǎng)基PBS洗2次，每孔加入100μlRIPA裂解液(高效)(北京索萊寶科技有限公司)冰上裂解15min。收集含有蛋白的裂解液，測定激發(fā)波長460nm，發(fā)射波長506nm處的熒光強度(Fluorescenceintensity，F(xiàn)I)。相對熒光強度(％)＝(FI實驗組-FI空白孔)/(FI對照組-FI空白孔)*100％其中FI實驗組為實驗組每組FI的平均值，F(xiàn)I空白孔為只有裂解液沒有細(xì)胞的孔。FI對照組為不加轉(zhuǎn)染復(fù)合物處理的細(xì)胞組。實驗結(jié)果如圖7所示，因綠色熒光蛋白熒光強度與其表達(dá)量成正比，根據(jù)圖7可知，N:P在20:1至60:1范圍內(nèi)均可達(dá)到約50％的RNA干擾效果。根據(jù)實施例5細(xì)胞毒性結(jié)果可知，增加PNP(N)比例會增加轉(zhuǎn)染復(fù)合物毒性，故優(yōu)選多肽與核酸的比例為20:1-50:1。對比例2本對比例與實施例2的區(qū)別在于：取實施例2中電荷比為20:1的PNP/siRNA復(fù)合物，加入不同量的抗體或人IgG，使形成的PNP/siRNA/抗體(或IgG)復(fù)合物中，PNP與蛋白(抗體或人IgG)的質(zhì)量比依次減小(50:1-5:1)。(見表1)通過動態(tài)光散射對PNP/siRNA/抗體(或IgG)復(fù)合物的Zeta電位進(jìn)行測量。與實施例2(10:1)相比，高于此比例的轉(zhuǎn)染復(fù)合物抗體吸附不足導(dǎo)致納米粒子帶正電或Zeta電位大于-10mV；低于此比例的轉(zhuǎn)染復(fù)合物Zeta電位不低于-10mV，證明實施例2中比例(10:1)時抗體吸附已達(dá)到飽和。根據(jù)對比例1，多肽與抗體的質(zhì)量比可在10:1至5:1范圍內(nèi)變動。表1PNP/siRNA中加入不同比例抗體對Zeta點位的影響。PNP/siRNA:蛋白(w:w)PNP/siRNA50:120:110:15:1PNP/siRNA/抗體(mV)24.3±2.517.8±1.2-6.3±0.9-10.2±1.4-10.8±1.7PNP/siRNA/mAb(mV)24.3±2.518.8±2.1-2.7±1.7-10.1±1.7-9.7±1.5雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3