本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗。

背景技術(shù)：

兔支氣管敗血波氏桿菌病在秋冬季節(jié)和早春多發(fā)。主要通過(guò)空氣傳播，經(jīng)呼吸道而感染。幼兔發(fā)病率高，并且有死亡病例。成年兔發(fā)病較少。此菌在群養(yǎng)兔污染為64.4％，散養(yǎng)兔為20％。在自然條件下，多種哺乳動(dòng)物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天氣突變，兔的抵抗力下降，兔舍衛(wèi)生不好，空氣污濁等情況下，均可引起本病發(fā)生。本病的潛伏期7～10d。成年兔表現(xiàn)鼻炎和支氣管炎。有多量的漿液性、黏液性鼻液流出。鼻炎長(zhǎng)期不愈，鼻腔流出黏液性或膿性分泌物，打噴嚏，呼吸困難，不食，消瘦等。仔兔多呈急性經(jīng)過(guò)，初期剛見(jiàn)鼻炎病狀后，即表現(xiàn)呼吸困難，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病變?yōu)楸茄住⒒撔员菤夤苎?、化膿性支氣管肺炎，個(gè)別的出現(xiàn)敗血病變化。鼻腔、氣管黏膜充血、水腫。鼻腔內(nèi)有漿液性、黏液性或黏液膿性分泌物。在肺門(mén)支氣管周圍到肺的邊緣見(jiàn)有支氣管肺炎病灶。病變多見(jiàn)于心葉、尖葉，嚴(yán)重的病例，波及全肺葉。病變部隆起、堅(jiān)硬，呈暗紅色，褐色，進(jìn)而為灰黃色。有些病例肺上有大小不等的膿瘡。嚴(yán)重的占肺部的90％以上。有的肝臟表面有黃豆至蠶豆大的膿瘡。膿瘡破后可見(jiàn)黏稠的奶油狀乳白色的膿汁。還見(jiàn)有心包炎、胸膜炎、胸腔積膿及肌肉膿腫等。

兔支氣管敗血波氏桿菌病主要采用生物安全措施和疫苗預(yù)防接種。其中生物安全措施主要包括：加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，做好防疫工作；兔場(chǎng)最好堅(jiān)持自繁自養(yǎng)；對(duì)新引進(jìn)的兔，必須隔離觀察1個(gè)月以上，經(jīng)細(xì)菌學(xué)與血清學(xué)檢查為陰性者方可入群。本病常與巴氏桿菌混合感染，兔群一旦發(fā)病，必須查明原因，消除外界刺激因素，隔離感染兔，以控制病原傳播。兔支氣管敗血波氏桿菌病較難治愈，需要加強(qiáng)規(guī)?；脠?chǎng)的免疫，目前主要用分離到的支氣管敗血波氏桿菌制成滅活菌苗，進(jìn)行預(yù)防接種，每只兔皮下注射1mL，每年2次；也有用兔巴氏桿菌—波氏桿菌二聯(lián)苗或巴氏桿菌—波氏桿菌—兔病毒性出血癥三聯(lián)苗預(yù)防接種(杜雅楠等,2006；黃艷艷等,2006)。但兔支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗容易出現(xiàn)細(xì)菌毒素殘留問(wèn)題，常導(dǎo)致免疫兔發(fā)病，因此，目前迫切需要一種能夠防控該病的安全性、效力好的疫苗，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種兔支氣管敗血波氏桿菌，為兔支氣管敗血波氏桿菌QDBb01株(Rabbit Bordetella bronchiseptica QDBb01)，于2016年11月01日保藏在中國(guó)武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016607。

本發(fā)明所篩選的兔支氣管敗血波氏桿菌用于制備疫苗；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗，其中抗原為從上述的兔支氣管敗血波氏桿菌中提取的，具有免疫原性的蛋白；

其中蛋白的提取方法如下：將兔支氣管敗血波氏桿菌QDBb01株的菌體破碎后，離心去除未破碎掉的細(xì)菌菌體和較重的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器；將上清液高速離心后獲得沉淀；用緩沖液溶解沉淀后，室溫孵育后；再進(jìn)行高速離心；沉淀溶解以后，用能夠截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子蛋白，透析液中的蛋白即為目的蛋白。

本發(fā)明實(shí)施例中提供的一種兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗，其中氫氧化鋁膠佐劑；

為了彌補(bǔ)現(xiàn)今兔支氣管敗血波氏桿菌疫苗的不足，本發(fā)明通過(guò)通過(guò)將分離到的兔支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，提供一種兔支氣管敗血波氏桿菌抗原蛋白的提取方法，并將提取出的抗原蛋白與氫氧化鋁膠佐劑乳化混合，制備出了一種能夠預(yù)防兔支氣管敗血波氏桿菌病的有效疫苗。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明的兔支氣管敗血波氏桿菌的分離及培養(yǎng)圖；

圖2：玻片凝集試驗(yàn)圖；其中左(陽(yáng)性菌)、中(樣品菌)和右(生理鹽水)

圖3單菌落16S基因、Pm基因和Bb基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中“-”陰性水對(duì)照；“+”陽(yáng)性菌對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：兔支氣管敗血波氏桿菌的分離及培養(yǎng)

從山東省濰坊某兔場(chǎng)購(gòu)進(jìn)一批1.5～3.0kg兔子做豬瘟脾淋苗試驗(yàn)，出現(xiàn)以發(fā)病急、死亡快，口鼻出血，肺臟出血、淤血為特征的疾病，根據(jù)發(fā)病死亡兔的臨床表現(xiàn)、剖檢病變，初步懷疑兔巴氏桿菌或兔支氣管敗血波氏桿菌感染，于是取肺臟組織進(jìn)行了細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)培養(yǎng)單菌落進(jìn)行16s和巴氏桿菌(Pm)基因或波氏桿菌(Bb)基因的PCR擴(kuò)增，并克隆、測(cè)序，確診該批兔是由兔支氣管敗血波氏桿菌感染引起的死亡。

1.1發(fā)病情況從山東濰坊購(gòu)進(jìn)一批1.5～3.0kg兔子做豬瘟脾淋苗測(cè)溫試驗(yàn)，該批兔子只免疫過(guò)兔瘟疫苗，其它疫苗均未免疫，整體狀態(tài)良好。

1.2臨床及剖檢癥狀一只體重大概2kg左右試驗(yàn)兔子，突然死亡，口鼻噴血，死前一天精神狀態(tài)、采食和飲水良好，無(wú)任何疾病癥狀，無(wú)打斗外傷，發(fā)病兔口鼻出血，肺臟出血、淤血，肝臟有一葉成黃白色。

1.3實(shí)驗(yàn)室診斷

1.3.1細(xì)菌分離和培養(yǎng)

初步懷疑兔巴氏桿菌或兔支氣管敗血波氏桿菌感染，于是無(wú)菌取發(fā)病兔肺部組織病料均勻接種于巧克力瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24小時(shí)形成中等菌落，呈灰白色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊。詳見(jiàn)圖1。

1.3.2細(xì)菌鑒定

1.3.2.1革蘭氏、美蘭染色鑒定經(jīng)革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察確定，革蘭氏染色為紅色小球桿菌，表明該菌為革蘭氏陰性菌；用美藍(lán)染色，鏡檢，可見(jiàn)多形態(tài)、兩極染色的小桿菌。

1.3.2.2玻片凝集試驗(yàn)鑒定采用兔支氣管敗血波氏桿菌陽(yáng)性血清鑒定該分離樣品菌，并用兔支氣管敗血波氏桿菌陽(yáng)性菌和生理鹽水分別做陽(yáng)性和陰性對(duì)照，具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.3.3.3PCR鑒定利用檢測(cè)原核生物用16S通用引物和巴氏桿菌(Pm)特定引物及設(shè)計(jì)的波氏桿菌(Bb)特定引物(上、下游引物序列詳見(jiàn)表1)對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并于1％瓊脂糖凝膠中電泳，詳見(jiàn)圖3。

表1引物序列表

1.3.3.4目的基因序列測(cè)定將16S和Bb目的基因分別送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析表明，該菌為兔支氣管敗血波氏桿菌，命名為QDBb01株。

1.3.3.5兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)滅活疫苗的制備

將菌種接種于鮑姜氏培養(yǎng)基，37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)48h。用滅菌生理鹽水離心洗滌2次，再用生理鹽水稀釋至含菌數(shù)為200億個(gè)/ml，按總體積0.4％加入甲醛，混勻，37℃滅活48小時(shí)，每隔6h混勻一次。經(jīng)檢驗(yàn)滅活合格者作為制苗用抗原。與氫氧化鋁膠佐劑按體積比＝1：4進(jìn)行配苗，制備成兔支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗，相當(dāng)于成品含40億個(gè)滅活菌/ml。免疫結(jié)果表明，本發(fā)明篩選的QDBb01株制備的疫苗對(duì)兔支氣管敗血波氏桿菌具有良好的免疫效果。并且，用目前市場(chǎng)上出售的兔支氣管敗血波氏桿菌疫苗進(jìn)行免疫，再用本發(fā)明篩選的QDBb01株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)；結(jié)果表明目前市場(chǎng)上出售的疫苗的免疫效果遠(yuǎn)低于本發(fā)明QDBb01株制成的滅活疫苗的效果。推測(cè)是由于QDBb01株基因發(fā)生變異導(dǎo)致目前疫苗的免疫效果不好。

實(shí)施例2兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)的蛋白的提純

將分離鑒定保存的兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)進(jìn)行3％TSB培養(yǎng)，并4000r/min收集菌體，再用PH7.2Tris-Hcl重懸菌體，將重懸菌體超聲波破碎，工作1s，間隔時(shí)間3s，全程時(shí)間12min，總共180次。4000r/min低速離心去除未破碎掉的細(xì)菌菌體和較重的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，取上清液于100000r/min，超速離心20min，去上清。將含外膜蛋白的沉淀用含2％Triton X-100的Tris-Hcl緩沖液溶解，室溫下孵育1h去除內(nèi)膜蛋白，再進(jìn)行100000r/min超速離心30min，沉淀用緩沖液再重懸，采用能夠截留蛋白分子量在40kDa以上(包含主要保護(hù)性抗原蛋白)的半透膜透析掉小分子蛋白，分裝，置-20℃保存。

實(shí)施例3：兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)亞單位疫苗制備

將純化好的兔支氣管敗血波氏桿菌蛋白用分光光度法按照以下步驟進(jìn)行絕對(duì)定量：(1)加測(cè)蛋白用的PBS 0.15ml和蛋白定量用考馬斯亮藍(lán)染液2.85ml于比色皿中作為對(duì)照，進(jìn)行調(diào)零；(2)加測(cè)蛋白用PBS 0.14ml、加待測(cè)蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考馬斯亮藍(lán)染液2.85ml于比色皿中測(cè)出吸光度值y為0.204，通過(guò)公式y(tǒng)＝0.152x+0.068得出蛋白濃度x＝0.83mg/ml，即為895μg/ml，以上所用測(cè)蛋白用試劑購(gòu)自TIANGEN公司。將此純化的蛋白溶液稀釋成150ug/ml，與氫氧化鋁膠佐劑按體積比＝1：4進(jìn)行配苗，制備成兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗，成品相當(dāng)于每毫升氫氧化鋁膠苗中含有蛋白30μg/ml。

實(shí)施例4：兔支氣管敗血波氏桿菌滅活苗和亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法

4.1攻毒用菌液的制備將分離鑒定保存的兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)復(fù)蘇挑取單菌落接種150ml 3％小牛血清鮑姜氏培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜搖床培養(yǎng)兔支氣管敗血波氏桿菌，次日早上取出，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)：將菌液進(jìn)行10^-7倍稀釋，取0.1ml進(jìn)行涂板，然后計(jì)算菌落數(shù)為48個(gè)。結(jié)果，菌數(shù)為4.8×10⁹cfu/ml。

4.2攻毒菌液最小致死劑量(LD₅₀)的確定選擇25只兔子，隨機(jī)分成5組，每組5只，將上述菌液按照10^-1依次稀釋成4.8×10⁷cfu/ml、4.8×10⁶cfu/ml、4.8×10⁵cfu/ml、4.8×10⁴cfu/ml四個(gè)梯度，以1ml/只的劑量進(jìn)行攻菌，留1組作為空白對(duì)照。連續(xù)觀察、記錄兔子發(fā)病死亡情況，解剖觀察病變情況，最終確定4.8×10⁵CFU為最小致死劑量。

4.3兔支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗、亞單位疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)將制備出的此滅活疫苗和亞單位疫苗成品分別按照1ml/只劑量皮下注射免疫體重1.5kg左右的家兔各10只，留10只作為未免疫對(duì)照組。免后14日，用兔支氣管敗血波氏桿菌QDBb01株(LD₅₀為4.8×10⁵CFU)按照100LD₅₀進(jìn)行攻毒，攻毒后觀察7日，統(tǒng)計(jì)家兔的攻毒保護(hù)率，以此來(lái)判定該疫苗的保護(hù)效果。結(jié)果，對(duì)照組10只全部發(fā)病，解剖上呼吸道病變均為支氣管敗血波氏桿菌典型癥狀；而亞單位疫苗和滅活苗免疫組攻毒后均健活，均未見(jiàn)發(fā)病，保護(hù)率均為10/10。但解剖兩種疫苗的注射的部位發(fā)現(xiàn)，滅活苗吸收不完全，而制備的亞單位疫苗吸收完全，因此，制備的兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)亞單位疫苗較滅活苗具有更好的安全性。而且，與QDBb01株制備的滅活疫苗類似，本發(fā)明制備的亞單位疫苗對(duì)QDBb01株的免疫效果也在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上好于市場(chǎng)上的類似疫苗。