一種人抗凝血酶iii的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種血制品的制備方法，具體涉及一種人抗凝血酶 III的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗凝血酶III (antithrombin III，AT- III)是一種維生素 K依賴的單鏈糖蛋白，在肝 臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞內(nèi)合成，是凝血酶及因子ΧΠ α、ΧΙ α、ΙΧ α、Χ α等含絲氨酸 的蛋白酶的抑制劑，分子質(zhì)量為58-64 KD，等電點(diǎn)為4. 8;半衰期約70小時(shí)，血漿中含量 260- 320mg/L ;含4個(gè)Ν糖基化寡糖鏈及3個(gè)二硫鍵，由9個(gè)α -螺旋結(jié)構(gòu)，3個(gè)β -折疊 和1個(gè)反應(yīng)中心環(huán)組成；41'-111與凝血酶、？乂&、？乂11&、乂1 &、^&、纖溶酶等絲氨酸以1:1的 比例形成復(fù)合物，從而使這些酶失去活性，肝素可加速這一反應(yīng)達(dá)千倍以上，肝素與AT- III 所含的賴氨酸結(jié)合后引起AT- III構(gòu)象改變，使AT- III所含的精氨酸殘基更易與凝血酶的絲 氨酸殘基結(jié)合，一旦肝素-AT- III凝血酶復(fù)合物形成，肝素就從復(fù)合物上解離，再次與另一 分子AT -III結(jié)合而被反復(fù)利用。
[0003] AT- III是組成抗凝血的主要成分，占人體總抗凝血能力的75%，是血漿中抑制凝 血酶的關(guān)鍵物質(zhì)，作為血液中活性凝血因子最重要的阻礙因子，它控制著血液的凝固和纖 維蛋白的溶解，參與保持體內(nèi)抗凝血功能和纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，并起著抗凝 調(diào)節(jié)作用。臨床上，血液中AT-III的水平隨各種疾病、癥狀而變化，在彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC)、肝疾患、腎病綜合癥等降低。血液中的AT- III水平降低可能會(huì)導(dǎo)致肝素治療效果無 法呈現(xiàn)。因此，掌握AT- III的活性作為對(duì)于此類疾病的監(jiān)測、病態(tài)分析、預(yù)后判定以及肝素 治療或使用AT- III濃縮制劑投藥時(shí)的指標(biāo)具有重要意義。
[0004] 近年發(fā)現(xiàn)AT-III促內(nèi)皮細(xì)胞分泌前列腺環(huán)素、抑制白細(xì)胞表面趨化受體 syndecan-4,緩解炎癥反應(yīng)。測定血楽;中AT- III含量能夠判斷血栓形成的病因，可直接抑制 凝血酶也可與凝血酶形成復(fù)合物抑制多種凝血因子活性。此外，AT-III對(duì)血小板聚集也有 一定抑制作用，是主要的內(nèi)源性凝血抑制物。作為臨床用藥，它在治療先天及后天獲得性 AT-III缺乏缺乏癥方面，具有難以替代的作用。遺傳性AT-III缺乏是一種常染色體顯性遺傳 性疾病，本病患病率約1/5000,發(fā)病多在10-25歲，患者常在手術(shù)后、創(chuàng)傷后、感染后、妊娠 或產(chǎn)后發(fā)生靜脈血栓，并可反復(fù)發(fā)生血栓?；颊哐獫{中AT- III生物活性與抗原性約為正常 人50%左右，AT-III結(jié)構(gòu)與功能異常的類型較多，共同表現(xiàn)是對(duì)肝素的親和力降低，從而對(duì) 絲氨酸蛋白酶的滅活能力明顯減弱。獲得性AT- III缺乏表現(xiàn)為AT- III合成降低，見于肝臟 疾病、肝功能障礙，主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晚期，常與疾病嚴(yán)重度相關(guān)，可伴發(fā)血 栓形成。
[0005] 國際上從上世紀(jì)60年代開始即開展了從人體血液中制備AT-ΠΙ的研究，隨著對(duì) AT-ΠΙ結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理研究的不斷深入，制備方法也日趨成熟，國際上AT-ΠΙ制品已廣 泛用于臨床，而且已經(jīng)研制出重組人AT-ΠΙ產(chǎn)品。國內(nèi)對(duì)AT-ΠΙ的研究不多，目前尚無 AT-ΠΙ產(chǎn)品面世，對(duì)于因 AT-ΠΙ缺乏導(dǎo)致的各種疾病，缺乏針對(duì)性的治療措施；近年有零 星的研究報(bào)道出現(xiàn)，如專利CN103059129A。常規(guī)的制備工藝，得率較低，且由于缺少維生 素 k依賴的凝血因子的去除措施，在制備過程容易導(dǎo)致蛋白激活，導(dǎo)致AT-ΠΙ生產(chǎn)合格率 不尚。
[0006] 鑒于此，本發(fā)明開發(fā)了一種制備AT-ΠΙ凍干粉的新方法，具有工藝穩(wěn)定、合格率 高，凍干粉復(fù)溶液澄清透明，無析出無乳光的優(yōu)點(diǎn)，且經(jīng)S/D、納米膜過濾、干熱三步病毒滅 活，大大提高了產(chǎn)品使用的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝先進(jìn)，操作方便，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品臨床 使用安全、可工業(yè)化的人抗凝血酶III的制備方法。
[0008] -種人抗凝血酶III的制備方法，包括如下步驟： (1) 血漿組分IV沉淀溶解 按1 :10-20的比例，將組分IV沉淀投入溶解緩沖液中，溫度控制在10-30°C，攪拌2-6 小時(shí)，使其充分溶解，得到均勻懸浮液； (2) 聚乙二醇（PEG)沉淀去雜蛋白 在步驟（1)所述的懸浮液中加入40-50% (w/w)的聚乙二醇，攪拌0. 5-1. 5小時(shí)，然后 用頗爾公司生產(chǎn)的Supradur 50P濾板串聯(lián)0. 45Mm濾芯過濾，收集澄清濾液，過濾前用溶解 緩沖液預(yù)洗濾板及濾芯； (3) DEAE Sephadex A-50 凝膠吸附 在步驟（2)所收集的濾液中加入DEAE Sephadex A-50凝膠，干凝膠的加入量為 0. 5-1. Og/kg，干凝膠預(yù)先用70°C以上的熱注射用水溶脹并用25°C以下的冷注射用水冷 卻，再用平衡緩沖液平衡；緩慢攪拌〇. 5-1. 5小時(shí)，后靜置5-15分鐘；過濾，收集濾液；凝膠 經(jīng)洗脫再生后重復(fù)使用； (4) S/D病毒滅活 步驟（3)所收集濾液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，攪勻后升溫至24-26Γ，后保溫6-7小時(shí)，然后用0. 45μπι濾芯澄清過濾； (5) 肝素親和柱層析 S/D后的濾液上肝素親和柱，柱子預(yù)先用平衡緩沖液充分平衡，上柱結(jié)束后先用平衡 緩沖液沖洗柱子，后用洗滌緩沖液洗滌柱子，再用洗脫緩沖液洗脫柱子，收集洗脫液，用 0. 45Mm或0. 22Mm濾芯過濾以上洗脫液，所得濾液即為高純AT-ΠΙ溶液； (6) 超濾濃縮 用5K~10K的超濾膜濃縮以上濾液，然后恒體積透析4-6倍，再濃縮至AT-ΠΙ效價(jià)高于 40IU/ml ;后移出超濾膜包并后洗膜包，收集濃縮液； (7) 加穩(wěn)定劑及調(diào)節(jié) 在步驟（6)所收集的濃縮液中加入穩(wěn)定劑，調(diào)節(jié)AT-ΠΙ效價(jià)至所需值(一般規(guī)格為 30-40IU/ml )，后調(diào) PH 值至 6. 50-7. 50 ; (8) 納米膜除病毒過濾 用0. lMm濾芯串聯(lián)20納米濾芯進(jìn)彳丁除病毒過濾； (9) 除菌過濾并分裝 用0. 22Mffl濾芯對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行除菌過濾并分裝； (10) 凍干； (11) 干熱滅活病毒 將步驟（10)得到的凍干制劑在100°C沸水浴中保溫30分鐘，進(jìn)行干熱病毒滅活。
[0009] 步驟（1)所述的溶解緩沖液組成為0· 01M-0. 02M TRIS，(λ 1Μ-(λ 15M氯化鈉，所述 的溶解緩沖液的ΡΗ值為7. 00-9. 50。
[0010] 步驟（2)所述的聚乙二醇的分子量為2000-6000,所述的聚乙二醇的加入量為 3-6% (w/w)〇
[0011] 步驟（3)所述的平衡緩沖液1組成為0. 01M-0. 02M TRIS，0.1 M-ο. 15M氯化鈉，平 衡緩沖液1的PH值為6. 50-7. 50。
[0012] 步驟（5)所述的肝素親和柱所用填料為Heparin Sepharose 6FF或Heparin S印harose CL-6B ;步驟（5)所述的平衡緩沖液組成2為0. 01M-0. 02M檸檬酸鈉，0. 1M-0. 2M 氯化鈉，平衡緩沖液2的PH為6. 50-7. 50 ;所述的洗滌緩沖液組成為0. 01M-0. 02M檸檬 酸鈉，0. 25-0. 5M氯化鈉，所述洗滌緩沖液的PH為6. 50-7. 50 ;所述的洗脫緩沖液組成為 0. 01M-0. 02M檸檬酸鈉，1M-2M氯化鈉，所述洗脫緩沖液的PH為6. 50-7. 50。
[0013] 步驟（7)所述的穩(wěn)定劑為甘氨酸，穩(wěn)定劑的加入量為0. 5-5% (w/w)。
[0014] 步驟（1)~ (11)所述的人抗凝血酶-III的制備方法，包含S/D、納米膜過濾及干 熱三步病毒滅除方法。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)勢 1，本工藝去除了原料中殘留的維生素 K依賴的凝血因子，特別去除了凝血酶原，大大 降低了生產(chǎn)過程中蛋白激活的概率，提高了產(chǎn)品合格率； 2, 采用聚乙二醇去除雜蛋白，為后續(xù)的柱層析操作提供了較佳的上樣條件，減少了層 析柱的負(fù)荷； 3, 聚乙二醇是一種蛋白保護(hù)劑，在生產(chǎn)過程中可防止蛋白變性失活； 4, 采用三步病毒滅活方法，使產(chǎn)品的臨床使用安全性大大提高。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施例只是為了使本領(lǐng)域的技 術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，不可理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)力保護(hù)范圍的限定，相反，對(duì)于本領(lǐng)域的 普通科研人員而言，凡利用本發(fā)明進(jìn)行的任何非實(shí)質(zhì)性的改動(dòng)或調(diào)整，均應(yīng)落入本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 實(shí)施例一 1，將3kg組分IV沉淀投入到30kg緩沖液中，緩沖液組成為0. 02M HCL-TRIS，0. 15M 氯化鈉，PH7. 50-7. 60,溫度控制在10°C，攪拌6小時(shí)，使其充分溶解； 2，在以上懸浮液中加入聚乙二醇至6%，攪拌0. 5小時(shí)，然后用頗爾公司生產(chǎn)的 Supradur 50P濾板串聯(lián)0. 45Mm濾芯過濾，收集澄清濾液，過濾前用溶解緩沖液預(yù)洗濾板及 濾芯； 3,以上濾液中加入預(yù)先溶脹并平衡的DEAE S印hadex A-50凝膠，按干膠計(jì)加入33g， 緩沖液組成為0. 02M TRIS-HCL，0. 15M氯化鈉，PH6. 50-6. 50 ;緩慢攪拌1. 5小時(shí)，后靜置5 分鐘；然后過濾，收集濾液； 4，以上濾液中加入Tween80至1.0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0.3% (wt%)，攪 勻后升溫至24-26Γ，后保溫6小時(shí)，然后用0. 45μπι濾芯澄清過濾； 5, 以上濾液上