專利名稱：人抗凝血酶Ⅲ的表達方法及其專用表達載體和工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域中人抗凝血酶m的發(fā)酵表達方法及 其專用表達載體和工程菌。
技術(shù)背景人抗凝血酶ni (AT-in)是血漿中重要的生理性抗凝血因子，在維持血液的凝血與抗凝血平衡中起重要作用，承擔血漿中70%的生理性抗凝血酶活性，在肝素的作用下 通過與凝血酶和因子Xa的結(jié)合發(fā)揮抗凝作用，其缺乏將易導致血栓形成。國外在臨 床上已經(jīng)廣泛使用，用于多種疾病的治療，包括彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、先天 及后天獲得性AT-m缺乏癥、敗血癥等(Int Angiol. 2007,26:53-63; Angiology. 2007,58:85-91)。尤其是針對DIC的治療，效果極為顯著。DIC在歐美每年的發(fā)病率 約為50萬例，死亡率超過50%，僅美國即有20-30億美元市場，美國GTC公司生產(chǎn) 的轉(zhuǎn)基因AT-III用于DIC在歐盟已進入II期臨床(www. gtc-bio.com)。另外，最新研究 結(jié)果表明，AT-III可以緩解抗凝常用藥肝素形成的耐藥性(Ann Thorac Surg. 2008,85:2153-60)，這也預示著其更加廣闊的市場前景。AT-m主要由肝臟合成，是一種單鏈糖蛋白，屬于Serpin (絲氨酸蛋白酶)家族， 分子量58200，人抗凝血酶基因位于第1號染色體長臂(lq23-25)，長約16kb，包 括7個外顯子和6個內(nèi)含子，其mRNA長為1.5Kb，編碼432個氨基酸的成熟蛋白，有 重要功能的區(qū)域如酶結(jié)合區(qū)(反應位點)、肝素結(jié)合位點、構(gòu)象敏感的色氨酸以及s-s 交聯(lián)等。AT-III的主要作用機制為羧基端Arg393-Ser394肽鍵發(fā)生斷裂，在a羧基 和蛋白酶的活性中心Ser羥基間形成酯鍵。目前，AT-m已經(jīng)在多種生物體系中進行 基因重組研究；先后在五coli， CHO、 cos細胞系等系統(tǒng)對AT-in進行了表達。2000 年5月，美國Genzyme公司用乳腺生物反應器生產(chǎn)的基因藥物rhAT，已被FDA批準用 于臨床，這也是世界上第一個被FDA批準用于臨床的由轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的基因藥物。 2008年，中國青島淼淼公司成功構(gòu)建了分泌rhAT的轉(zhuǎn)基因山羊(生物工程學報24: 117-123)，并于2006年申請了專利(CN 1840187A)。但是，國內(nèi)還未看到用畢赤 酵母進行AT-m表達的研究。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種用于表達人抗凝血酶m (AT-in)的巴斯德畢赤酵母表達載體。本發(fā)明所提供的用于表達人抗凝血酶III的巴斯德畢赤酵母表達載體，是含有人抗 凝血酶III編碼基因的重組畢赤酵母表達載體。為延長mRNA的壽命，防止通讀，所述載體中人抗凝血酶III編碼基因的終止密碼子后還添加有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，使之形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。此外，為方便操作，還可根據(jù)上述經(jīng)改造的人抗凝血酶III編碼基因序列和限制性 內(nèi)切酶的基因特征序列在所述經(jīng)改造的人抗凝血酶m編碼基因序列中引入若干限制 性內(nèi)切酶識別位點。所述在終止密碼子后添加有序列表中序列1所示核苷酸序列，以及fc0y I和 7fot I兩個限制性內(nèi)切酶識別位點的人抗凝血酶III編碼基因可經(jīng)PCR擴增獲得，擴增 引物可具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列。用于構(gòu)建含有人抗凝血酶III編碼基因的畢赤酵母表達載體的出發(fā)載體可為任意 一種適于外源基因表達的畢赤酵母表達載體，如pPIC9K、 pPICza A或pPICZA等。以pPIC9K為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有上述人抗凝血酶III編碼基因及添加序列的重 組畢赤酵母表達載體為9K-AT。上述重組畢赤酵母表達載體可按照生物工程領(lǐng)域中的常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于表達人抗凝血酶m的巴斯德畢赤酵母工程菌。本發(fā)明所提供的表達人抗凝血酶m的巴斯德畢赤酵母工程菌，是將含有上述人抗 凝血酶m的重組畢赤酵母表達載體導入畢赤酵母中得到的。所述畢赤酵母可為任意適于蛋白表達的畢赤酵母菌株，如畢赤酵母GS115或X-33 菌株等。以畢赤酵母GS115為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有9K-AT的重組畢赤酵母菌株為GS115 / 9K-AT。將重組畢赤酵母表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母的方法優(yōu)選為電擊轉(zhuǎn)化法，但也可以采用 其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如電擊轉(zhuǎn)化法、乙酸鋰轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種人抗凝血酶III的表達方法。本發(fā)明所提供的人抗凝血酶ni的表達方法，是發(fā)酵上述用于表達人抗凝血酶m的 巴斯德畢赤酵母工程菌，得到人抗凝血酶m。發(fā)酵上述重組畢赤酵母時需加入甲醇誘導劑，所加入甲醇的濃度為0. 5-1%。為補償甲醇的損失，每24小時還要補加甲醇，使菌液中的甲醇濃度保持在0.5-1 %，誘導溫度為28'C。所述百分濃度均為體積百分濃度。用上述方法獲得的人抗凝血酶III也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供了一種人抗凝血酶m的表達方法及其專用表達載體與工程菌。用本發(fā) 明的巴斯德畢赤酵母表達載體及工程菌進行人抗凝血酶m的表達，彌補了傳統(tǒng)人抗凝 血酶ni制備方法以及原核表達系統(tǒng)表達方式的不足；此外，若將本發(fā)明應用于工業(yè)化 人抗凝血酶in的生產(chǎn)，可獲得高水平表達且純度較高的人抗凝血酶m，并具有操作簡 單，原料生物體生長周期短，生產(chǎn)規(guī)模大(可以高密度發(fā)酵)，提取成本低，酶活性 高的優(yōu)點，具有重要的工業(yè)應用前景和實際意義。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖i為經(jīng)改構(gòu)設(shè)計的人抗凝血酶in基因的pcR擴增圖譜圖2為重組巴斯德畢赤酵母表達載體9K-AT的酶切鑒定圖譜 圖3為重組巴斯德畢赤酵母表達載體9K-AT的結(jié)構(gòu)示意圖 圖4為重組人抗凝血酶III表達產(chǎn)物的Western blot鑒定圖譜具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。下面列舉具體實施例對本發(fā) 明進行說明，以下具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范 圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例i、人抗凝血酶m在巴斯德畢赤酵母中的表達一、重組巴斯德畢赤酵母表達載體9K-AT的構(gòu)建和鑒定(1) 人抗凝血酶III基因的改構(gòu)設(shè)計根據(jù)GenBank中人抗凝血酶III (AT-III)的基 因序列(GenBank號P01008)，在終止密碼子后引入如序列表中序列1所示的一段 核苷酸序列，使之形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，以延長mRNA的壽命，防止通讀。再根據(jù)設(shè) 計改構(gòu)的序列和限制性內(nèi)切酶的基因特征序列引入限制性內(nèi)切酶&^ I和7fetl的識 別位點。根據(jù)上述基因序列設(shè)計的PCR擴增引物序列為正向引物5'-CGGAATTCCACGGGAGCCCTGTGGACATCTGC-3，(序列表中序列2)，反向引物5， -TTTATAGCGGCCGCAGGAAGAGGTGCAAAGAATAAGAAC-3，(序列表中序列3)。(2) 人抗凝血酶III基因的擴增以攜帶人抗凝血酶ni全長cDNA的質(zhì)粒PC-AT (中 國生物制品學雜志，2002， 15:161-163)為模板，利用上述引物PCR擴增人抗凝血酶III 基因，PCR擴增條件為94°C 30s， 55°C 45s， 72°C 150s， 40個循環(huán)。通過PCR切 除編碼32個氨基酸信號肽的96個堿基。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖l所示(泳道l: DL2000分子量標準；泳道2: PCR擴增去除信號肽序列的AT-III cDNA)，回收長度約1300bp的目的片段并對其進行純 化。(3) 序列測定將純化后的PCR擴增產(chǎn)物克隆進pGEM-T載體(購自Promega公司) 中，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA， 用限制性內(nèi)切酶^coWI和I進行雙酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了 1300bp和3000bp左 右的DNA片段，與預期結(jié)果相符。再對其進行測序，測序結(jié)果表明經(jīng)PCR擴增獲得了 序列正確的目的片段，長度約為1300bp。(4) 重組巴斯德畢赤酵母表達載體9K-AT的構(gòu)建將測序正確的目的基因克隆至 穿梭質(zhì)粒pPIC9K (Invitrogen)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞，利用含100 mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA， 以步驟(1)所用引物進行PCR鑒定，經(jīng)PCR擴增可獲得1300bp左右目的條帶的為陽 性克隆質(zhì)粒，再對陽性克隆質(zhì)粒用EcoRl和/或Notl進行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所 示(泳道l: 9K-AT;泳道2: DNA分子量標準DL2000;泳道3: 9K-AT/EcoRI+Not I; 泳道4: 9K-AT/EcoR I;泳道5: 9K-AT/Not I)，經(jīng)^cot I和淑I酶切獲得了約1300bp 的目的片段，與預期結(jié)果相符，證明獲得了序列及插入位置均正確的攜帶經(jīng)改構(gòu)設(shè)計 的人抗凝血酶III基因的重組巴斯德畢赤酵母表達載體，命名為9K-AT，其結(jié)構(gòu)示意圖 如圖3所示。二、攜帶人抗凝血酶III基因的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建(1) GS115酵母感受態(tài)細胞的制備取10-20 p 1凍存的GS115酵母細胞接種于5mL YPD培養(yǎng)液(1% Yeast Extract, 2% p印tone，高壓滅菌后，加入除菌的溶液至如下 終濃度2% glucose)中，過夜(12-16小時)培養(yǎng)后取0. 1-0. 5mL至500mL新鮮YPD 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜至OD,為1.3-1.5，然后4。C、 1500g離心5分鐘收集菌體，用冰 冷無菌的去離子水洗滌細胞，以1/25體積冰浴的無菌1M山梨醇洗滌，離心后以1/500體積冰浴的無菌山梨醇重懸，備用。(2) 重組巴斯德畢赤酵母表達載體9K-AT轉(zhuǎn)化酵母細胞GS115:將鑒定正確的陽性 質(zhì)粒9K-AT，用5"W I酶切線性化，以Wizard DNAClean-Up system (購自Promega公 司)回收線性化載體。然后，將5nl線性化的質(zhì)粒DNA與65y 1 GS115酵母感受態(tài) 細胞混合，進行電轉(zhuǎn)化，電擊條件1500V， 25uF， 200 Q。以MG (1.34% YNB， 1 % glycerol, 1.5%瓊脂，高壓滅菌后，加入除菌的溶液至如下終濃度4X10-5% biotin， ±0.004% histidine， 2. 0mg/ml G418)和麗(1. 34% YNB， 0. 5% methanol, 1. 5%瓊脂，高壓滅菌后，加入除菌的溶液至如下終濃度4X 10-5% biotin， ±0. 004% histidine， 2.0rag/ml G418)平板篩選高拷貝G418陽性轉(zhuǎn)化子。提取重組酵母菌 的全基因組DNA，在步驟(1)所用引物的引導下進行菌落PCR鑒定，經(jīng)PCR擴增可獲 得約1300bp目的條帶，與預期結(jié)構(gòu)相符，證明獲得了攜帶人抗凝血酶III基因的重組 畢赤酵母工程菌，命名為GS115/9K-AT。三、重組畢赤酵母工程菌GS115 / 9K-AT的表達及表達產(chǎn)物鑒定 (1)重組畢赤酵母工程菌GS115 / 9K-AT的表達及鑒定挑取陽性克隆單菌落于BMGY 培養(yǎng)基(1% Yeast Extract, 2% p印tone， lOOraM磷酸鉀緩沖液pH6.0， 1.34% YNB， 1% glycerol,高壓滅菌后，加入除菌的溶液至如下終濃度，4X10-5% biotin) 中，在28。C下培養(yǎng)至OD,為2-6時，3000g離心收集細胞，重懸于B腿Y(1X Yeast Extract, 2% p印tone， lOOraM磷酸鉀緩沖液pH6. 0， 1.34% YNB， 0.5% methanol, 高壓滅菌后，加入除菌的溶液至如下終濃度，4X10-5% biotin)培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)，每天補充甲醇進行誘導表達，使其終濃度為0.5-1%，不同時間取樣，離心取上 清，進行10% SDS-PAGE檢測，經(jīng)檢測可獲得58KD目的條帶，與預期結(jié)構(gòu)相符，再 在一抗兔抗人AT-III單克隆抗體(購自上海生物制品研究所)和二抗辣根酶標記山羊 抗兔IgG(H+L)(購自中山公司)的作用下對表達作進一步的Western blot鑒定，鑒 定結(jié)果如圖4所示(泳道l:陰性對照；泳道2:陽性對照；泳道3:表達產(chǎn)物)，鑒定結(jié)果表明用本發(fā)明的工程菌及表達方法可獲得高水平表達的人抗凝血酶m。(2 )重組蛋白的純化發(fā)酵液離心取上清，用0. 45 u m濾膜過濾后上H印arin-hyperD 柱(購自BioS印ra⑧公司)，流速為20cm/h，用0, 02M pH7. 5磷酸緩沖液+0. 12MNaCl 洗脫未結(jié)合雜蛋白；用0. 02M pH7. 5磷酸緩沖液+0. 27M NaCl洗脫弱結(jié)合蛋白；以磷 酸緩沖液+2MNaCl洗脫結(jié)合蛋白。對純化蛋白進行10% SDS-PAGE檢測，經(jīng)檢測可獲 得約58KD目的條帶，與預期結(jié)果相符，再在一抗兔抗人AT-III單克隆抗體和二抗辣根 酶標記山羊抗兔IgG(H+L)的作用下對表達作進一步的Western blot鑒定，鑒定結(jié)果 表明用本發(fā)明的工程菌及表達方法獲得了高水平表達且純度較高的人抗凝血酶III。(3)鑒定正確后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中生長重組人抗凝血酶m:挑取陽性單菌落，接入YPD 培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐生長，每24小時流加補充甲醇。對發(fā)酵 產(chǎn)物進行純化，并對純化蛋白進行10% SDS-PAGE檢測，經(jīng)檢測可獲得約58KD目的 條帶，與預期結(jié)果相符，再在一抗兔抗人AT-III單克隆抗體和二抗辣根酶標記山羊抗 兔lgG(H+L)的作用下對表達作進一步的Western blot鑒定，鑒定結(jié)果表明用本發(fā)明 的工程菌及表達方法可獲得高水平表達且純度較高的人抗凝血酶III，并可進行大規(guī)模 工業(yè)化生產(chǎn)。序列表<160〉 3<210> 1<211〉 45〈212〉 腿 <213〉人工序列<220> 〈223〉<■〉 1taaaatgttc ttattctttg cacctcttcc tgcggccgct ataaa 化<210〉 2<211〉 32<212> DNA〈213〉 人工序列<220〉 〈223〉〈400〉 2cggaattcca cgggagccct gtggacatct gc 32<210> 3〈211> 39<212> 薩 〈213〉人工序列〈220>〈223〉 〈400〉 3tttatagcgg ccgcaggaag aggtgcaaag aataagaac 39
權(quán)利要求
1、用于表達人抗凝血酶III的巴斯德畢赤酵母表達載體，是含有人抗凝血酶III編碼基因的重組畢赤酵母表達載體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求i所述的巴斯德畢赤酵母表達載體，其特征在于所述載體中 人抗凝血酶ni編碼基因的終止密碼子后添加有如序列表中序列i所示的核苷酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的巴斯德畢赤酵母表達載體，其特征在于還可在所述經(jīng)改造的人抗凝血酶m編碼基因序列中引入若干限制性內(nèi)切酶識別位點。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的巴斯德畢赤酵母表達載體，其特征在于所述在終止密碼子后添加有序列表中序列1所示核苷酸序列，以及fcoi I和I兩個限制性內(nèi)切酶識別位點的人抗凝血酶m編碼基因可經(jīng)pcr擴增獲得，擴增引物具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項所述的巴斯德畢赤酵母表達載體，其特征在于用 于構(gòu)建含有人抗凝血酶III編碼基因的畢赤酵母表達載體的出發(fā)載體為pPIC9K、 pPICz a A或pPICZA;以pPIC9K為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述人抗凝血酶III編碼基因 及添加序列的重組畢赤酵母表達載體為9K-AT。
6、 用于表達人抗凝血酶III的巴斯德畢赤酵母工程菌，是將權(quán)利要求1-5任一項所述的含有人抗凝血酶in的重組畢赤酵母表達載體導入畢赤酵母中得到的。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的巴斯德畢赤酵母工程菌，其特征在于所述畢赤酵母 為畢赤酵母GS115或X-33菌株；以畢赤酵母GS115為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有9K-AT 的重組畢赤酵母菌株為GS115 / 9K-AT。
8、 一種人抗凝血酶III的表達方法，是發(fā)酵權(quán)利要求6或7所述的用于表達人抗 凝血酶III的巴斯德畢赤酵母工程菌，得到人抗凝血酶III。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達方法，其特征在于發(fā)酵所述重組畢赤酵母時需 加入甲醇誘導劑，所加入甲醇的濃度為0. 5-1%。
10、 用權(quán)利要求8或9所述方法獲得的人抗凝血酶III。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人抗凝血酶III的發(fā)酵表達方法及其專用表達載體和工程菌。用于表達人抗凝血酶III的巴斯德畢赤酵母表達載體，是含有人抗凝血酶III編碼基因的重組畢赤酵母表達載體。用于表達人抗凝血酶III的巴斯德畢赤酵母工程菌，是將所述含有人抗凝血酶III的重組畢赤酵母表達載體導入畢赤酵母中得到的。用本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母表達載體及工程菌進行人抗凝血酶III的表達，彌補了傳統(tǒng)人抗凝血酶III制備方法以及原核表達系統(tǒng)表達方式的不足；此外，若將本發(fā)明應用于工業(yè)化人抗凝血酶III的生產(chǎn)，則具有操作簡單，原料生物體生長周期短，生產(chǎn)規(guī)模大(可以高密度發(fā)酵)，提取成本低，酶活性高的優(yōu)點，具有重要的工業(yè)應用前景和實際意義。
文檔編號C12R1/84GK101402968SQ20081022650
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者喬志新, 群 于, 鵬 任, 宋麗雅, 李偉靜, 謝冰潔, 敏 賀 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所