一種抗胰島素樣生長因子受體IGF-1R人源抗體LMAb1的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過噬菌體庫獲得的抗IGF-1R人源功能抗體LMAbl。具體而言,通過 分子生物學(xué)方法從全人噬菌體抗體庫中篩選到了一株抗人IGF-1R人源抗體LMAbl,通過真 核表達(dá)系統(tǒng)獲得相應(yīng)的抗體,最后通過生物學(xué)實驗對抗體的體外、體內(nèi)功能進(jìn)行評價。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素生長因子IGFs及其受體IGF-1R與腫瘤的關(guān)系密切。IGF-1R是跨膜受體, 屬于受體酪氨酸激酶(RTK),基因定位于染色體15q25_26,其前體為一條單鏈多肽,經(jīng)剪切 加工去除30個氨基酸的信號肽序列后,肽鏈被糖基化,并斷裂成一條具有706個氨基酸的 胞外A亞單位和626個氨基酸構(gòu)成的穿膜B亞單位。A和B亞單位通過二硫鍵形成一個AB 半受體,它與另一個AB半受體構(gòu)成一個完整受體A2B2。其胞外的A亞單位富含半胱氨酸, 決定配體結(jié)合的特異性,B亞單位則穿越細(xì)胞膜,傳導(dǎo)配基誘導(dǎo)的信號,B鏈的不同區(qū)域可 以介導(dǎo)IGF-1R不同的生物學(xué)活性,其中Y950 (第950位酪氨酸殘基)為Src同源域2 (She) 和IRS-1的結(jié)合位點,K1003(第1003位賴氨酸殘基)是ATP結(jié)合位點,Y1131、Y1135和 Y1136是酪氨酸激酶活性區(qū)域,它能夠促使IRS-1等底物發(fā)生磷酸化,并可以促進(jìn)細(xì)胞集落 的形成,而位于IGF-1R C端的Y1250和Y1251可以使細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化功能,Y1316則可以和 PI3激酶結(jié)合,發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡及促有絲分裂等生物學(xué)功能。當(dāng)配基與IGF-1R結(jié)合后可誘 導(dǎo)其自身及IRS、She、Grb 10等底物磷酸化,同時啟動細(xì)胞內(nèi)P13K-PKB/AKT和RAS-RAF-MAPK 等信號級聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂,抑制細(xì)胞凋亡。因此,IGF-1R不但對正常組織有增殖 效應(yīng),而且也是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的前提,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
[0003] IGF-1R在惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝 癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),其酪氨酸激酶活性也有所增強。IGF-1R的激活在 細(xì)胞增殖方面有以下重要作用:(1)可促進(jìn)有絲分裂;(2)是某些類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型建立和 維持的前提及腫瘤發(fā)生所必備;(3)可減少腫瘤細(xì)胞凋亡,由此導(dǎo)致或加速腫瘤形成和進(jìn) 展。研究表明,IGF-1R在乳腺癌中高表達(dá),且IGF-1R能夠介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂;在 子宮內(nèi)膜腺癌中IGF-1R的表達(dá)顯著高于正常組織和良性增生內(nèi)膜,可能的機(jī)制為:IGF-1R 通過與配體結(jié)合,激活下游分子如MAPK等的相互作用,通過與細(xì)胞癌基因如c-myc、c-src 等的協(xié)同表達(dá)從而促使胞內(nèi)蛋白發(fā)生磷酸化,誘導(dǎo)核內(nèi)相關(guān)癌基因的表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞 癌變。
[0004] 總而言之,在大多數(shù)腫瘤中IGF-1R表達(dá)增加,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,與惡性腫瘤 的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系,因此IGF-1R能夠作為腫瘤診斷、治療和預(yù)后的重 要參考。IGF-1R是一個極具吸引力的腫瘤靶向治療的靶點,其拮抗劑如特異性抗體、反義核 酸等能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的IGF-1R的表達(dá),使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 凋亡、影響腫瘤新血管形成從而抑制腫瘤生長,發(fā)揮良好的抗腫瘤效應(yīng)。
[0005] 本項發(fā)明利用噬菌體抗體庫方法獲得了 一株新型抗人IGF-1R人源功能抗體 LMAbl。體外試驗顯示,LMAbl具有良好的生物學(xué)效應(yīng),能夠特異性識別細(xì)胞膜表面的 IGF-1R(圖1),抑制IGF-1R陽性細(xì)胞的增殖(圖2)、遷移(圖3)和克隆形成(圖4);體內(nèi) 試驗顯示,LMAbl能夠抑制移植瘤的生長,降低小鼠的死亡率(圖5)。LMAbl為IGF-1R表 達(dá)陽性的癌癥等相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供了選擇。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為了提供新的抗IGF-1R抗體分子,本發(fā)明公開了一種抗IGF-1R人源抗體LMAbl 可變區(qū)氨基酸序列,其特征在于重鏈可變區(qū)氨基酸序列為序列1,輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為 序列2。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種抗IGF-1R人源抗體LMAbl可變區(qū)基因序列,重鏈可變區(qū)基因 為序列3,輕鏈可變區(qū)基因為序列4。
[0008] 本發(fā)明公開的抗體LMAbl的特征之一是能夠識別細(xì)胞膜表面靶抗原IGF-1R。
[0009] 本發(fā)明公開的抗體LMAbl的特征之一是能夠特異性地抑制IGF-1R陽性細(xì)胞的增 殖。
[0010] 本發(fā)明公開的抗體LMAbl的特征之一是能夠特異性地抑制IGF-1R陽性細(xì)胞的遷 移。
[0011] 本發(fā)明公開的抗體LMAbl的特征之一是能夠特異性地抑制IGF-1R陽性細(xì)胞的體 外克隆形成。
[0012] 本發(fā)明公開的抗體LMAbl的特征之一是能夠在動物體內(nèi)發(fā)揮抑制腫瘤增殖的功 能,降低小鼠死亡率。
[0013] 具體實施過程如下:
[0014] 1)利用全人源天然抗體庫篩選獲得抗IGF-1R抗體LMAbl基因序列;
[0015] 2)設(shè)計相應(yīng)的引物,構(gòu)建抗IGF-1R抗體LMAbl真核表達(dá)載體;
[0016] 3)抗IGF-1R抗體LMAbl的真核表達(dá)及純化;
[0017] 4)抗IGF-1R抗體LMAbl體外生物學(xué)活性的鑒定,包括抗原結(jié)合及抑制細(xì)胞增殖、 遷移和克隆形成;
[0018] 5)抗IGF-1R抗體LMAbl體內(nèi)抑瘤活性的鑒定。
[0019] 下面參照上述步驟詳細(xì)描述抗IGF-1R人源抗體LMAbl的設(shè)計及制備過程。設(shè)計 及制備本發(fā)明抗體的方法僅僅是說明相關(guān)方法,并非是限制性的;也可以采用其他已知的 方法,或者采用修改的方法。
[0020] 1)利用全人源天然抗體庫篩選獲得抗IGF-1R抗體LMAbl基因序列。
[0021 ] 基于已建立的大容量全人源抗體庫,利用細(xì)胞篩選方法篩選陽性結(jié)合的克隆,并 經(jīng)測序獲得抗IGF-1R人源抗體序列。
[0022] 2)設(shè)計相應(yīng)的引物,構(gòu)建抗IGF-1R抗體LMAbl真核表達(dá)載體。
[0023] 根據(jù)獲得的抗體LMAbl輕重鏈可變區(qū)基因序列,設(shè)計相應(yīng)的突變引物,在重鏈可 變區(qū)基因兩端分別引入Pvu II和BstE II位點,輕鏈可變區(qū)基因兩端分別引入EcoRV和 Xho I位點,利用PCR技術(shù)合成LMAbl輕重鏈可變區(qū)基因;經(jīng)酶切、鏈接構(gòu)建抗IGF-1R抗體 LMAbl真核表達(dá)載體,進(jìn)行序列測定。
[0024] 3)抗IGF-1R抗體LMAbl的真核表達(dá)及純化;
[0025] a)抗體LMAbl的表達(dá):大量制備克隆了抗體LMAbl輕重鏈基因的真核表達(dá)質(zhì)粒, 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法瞬時轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞,培養(yǎng)足夠長時間候后收獲上清,上清中含有 目的抗體。
[0026] b)LMAbl的純化:利用Protein A/G親和層析法獲得純化抗體LMAbl。
[0027] 4)抗IGF-1R抗體LMAbl體外生物學(xué)活性的鑒定,包括抗原結(jié)合及抑制細(xì)胞增殖、 遷移和克隆形成。
[0028] a)體外LMAbl結(jié)合IGF-1R細(xì)胞:收集膜IGF-1R陽性的細(xì)胞,加入梯度稀釋的 LMAbl抗體,冰上孵育0. 5h,洗滌后再加入PE標(biāo)記的熒光標(biāo)記的羊抗人二抗,以確定抗體 LMAbl的膜抗原結(jié)合能力。
[0029] b)細(xì)胞增殖抑制試驗:收集細(xì)胞,重懸計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至2X104/ml,96孔板 中加入細(xì)胞,每孔50 μ 1,同時加入梯度稀釋的LMAbl抗體50 μ 1,繼續(xù)37°C培養(yǎng)72h。每孔 加 10 μ 1CCK-8,測 0D450 值。
[0030] C)細(xì)胞遷移試驗:重懸計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至3 X 105/ml,取250 μ 1細(xì)胞加入遷移 板上室,板下部加750 μ 1含不同濃度LMAbl抗體的培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)24h,用棉簽擦凈上室 底部細(xì)胞,固定并染色,水洗晾干,小心取下室膜,鏡檢計數(shù)。
[0031] d)細(xì)胞克隆形成試驗:依次配制0.6%上層膠、1.2%下層膠、2XDMEM,下層膠 1. 5ml/孔加入6孔板,4°C放置15min使其凝固。細(xì)胞消化、計數(shù)并稀釋為IX 104/ml。配 制上層膠液(含細(xì)胞液0. 4ml),鋪入之前的6孔板,lml/孔,4°C 20min,每孔再加500 μ 1培 養(yǎng)基,需要加 LMAbl的樣品,每層膠層及培養(yǎng)基均加抗體。37°C培養(yǎng)2周,加200 μ 1/孔ΜΤΤ 染色并計數(shù)。
[0032] 5)抗IGF-1R抗體LMAbl體內(nèi)抑瘤活性的鑒定。
[0033] 收集細(xì)胞,計數(shù)并調(diào)整至lXl〇7ml。BALb/c裸鼠脂肪墊注射細(xì)胞懸液100μ 1/ 點,1周后可見腫瘤。尾靜脈注射不同量的LMAbl抗體,對照組給予生理鹽水。每周兩次測 量并計算小鼠瘤體積,記錄體重和死亡率。
【附圖說明】
[0034] 圖1流式細(xì)胞術(shù)鑒定LMAbl的膜抗原結(jié)合能力。LMAbl稀釋后(0. 12ng/ml~2 μ g/ ml),與膜IGF-1R陽性的卵巢癌細(xì)胞系SK0V3及SK0V3-T(IGF-1R陽性率略強于SK0V3)孵 育。結(jié)果顯示,LMAbl能夠與細(xì)胞特異性結(jié)合,且這一結(jié)合呈劑量依賴性。
[0035] 圖2CCK-8法鑒定LMAbl體外抑制IGF-1R陽性細(xì)胞系增殖的功能。A :LMAbl抑制 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示,LMAbl能夠抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,且抑制 效應(yīng)呈一定的劑量依賴性。當(dāng)抗體濃度為50 μ g/ml時,細(xì)胞活率為正常細(xì)胞的約60% ;B :LMAbl抑制SK0V3-T細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示,LMAbl能夠抑制SK0V3-T細(xì)胞的增殖,且抑制 效應(yīng)呈一定的劑量依賴性。當(dāng)抗體濃度為2 μ g/ml以上時,細(xì)胞活率即降至正常細(xì)胞的約 75%。
[0036] 圖3Transwe 11法鑒定LMAb 1抗體抑制SK0V3-T細(xì)胞遷移的功能。細(xì)胞加入 Transwell板上室,板底加750 μ 1含LMAbl的培養(yǎng)基。染色后取隨機(jī)取3個視野鏡檢計 數(shù)。結(jié)果顯示,LMAbl能夠抑制細(xì)胞的遷移,當(dāng)抗體濃度為100 μ g/ml時,遷移細(xì)胞數(shù)降低 約 75%。
[0037] 圖4軟瓊脂克隆形成法鑒定LMAbl抗體抑制SK0V3-T細(xì)胞克隆形成的能力。上層 膠中的細(xì)胞會形成肉眼可見的克隆,而加入LMAbl的樣品孔中克隆明顯減少。當(dāng)抗體濃度 為50 μ g/ml時,形成的克隆數(shù)較少了約25%。
[0038] 圖5體內(nèi)移植瘤試驗鑒定LMAbl的抑瘤能力。A :裸鼠移植瘤體積;B :小鼠存活率。 裸鼠脂肪墊注射細(xì)胞后1周成瘤,尾靜脈給予LMAbl抗體治療,可見抗體與Herceptin聯(lián) 用能夠抑制小鼠移植瘤的生長(A),并且可以降低小鼠死亡率(B)。Tras :trastuzumab (即 Herceptin) ;N. C :對照組,即用生理鹽水治療組。
【具體實施方式】
[0039] 實施例一抗IGF-1R抗體LMAbl的真核表達(dá)、純化及初步鑒定
[0040] 一、材料
[0041] 抗體真核表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR由本室構(gòu)建并申請國家專利(專利授權(quán)號: ZL200510064335. 0);引物應(yīng)用biosun軟件設(shè)計,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;脂質(zhì) 體lipofectamin2000購自Invitrogen ;ProteinA/G親和純化柱購自GE公司;羊抗人IgG、 辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG、人IgG等購自中杉金橋;內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品;其他試劑為市 購產(chǎn)品。
[0042] 二、方法
[0043] 1、抗體的表達(dá)
[0044] 1. 1抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0045] 選擇能夠獲得的含有人IgGl抗體恒定區(qū)基因