專利名稱：一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒的制作方法
一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
人胰島素樣生長(zhǎng)因子II (Insulin-Like Growth Factor II，IGF II )是有 67 個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子量7Kd，結(jié)構(gòu)與胰島素相似，大部分經(jīng)肝臟合成，主要存在于血液中， 通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞繁殖、分化、生長(zhǎng)、代謝等多種生物效應(yīng)。近幾年來(lái)大量研究顯示，胰島素樣生長(zhǎng)因子II具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用，是一種細(xì)胞增殖調(diào)控因子，人類多種惡性腫瘤肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等的發(fā)生、發(fā)展與胰島素樣生長(zhǎng)因子II基因調(diào)控異常有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的酶免疫分析相關(guān)方法學(xué)檢測(cè)和試劑盒的研究使用報(bào)道。北京北方生物制品研究所有人胰島素樣生長(zhǎng)因子 II放射免疫分析的試劑盒，但因?yàn)闃?biāo)記物為放射性1251，在使用中存在污染和輻射的缺點(diǎn)； 國(guó)外有人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的ELISA試劑盒，但價(jià)格昂貴。因此，建立一種方便靈敏特異準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，從而能為臨床和實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)探討胰島素樣生長(zhǎng)因子II在炎癥、腫瘤、腫瘤治療后效果觀察及早期診斷方面提供一個(gè)新的思路，提供一種可靠的手段是十分必要的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)血清中人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的水平。
在生理狀態(tài)下，血清中IGF II含量甚微且由于分子量小較難獲得高效價(jià)抗血清， 因此發(fā)明人用人胰島素樣生長(zhǎng)因子II多肽連接生物大分子甲狀腺球蛋白，連接后將其用微量多次免疫法免疫大耳白兔獲得高效價(jià)高親和力的抗血清。用該抗血清包被聚苯乙烯酶標(biāo)板制成固相化抗體板。用胰島素樣生長(zhǎng)因子II多肽連接生物素，將生物素化的胰島素樣生長(zhǎng)因子II與樣本中待測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子II同時(shí)等體積加入固相抗體板中，經(jīng)過(guò)反應(yīng)洗滌后再加入酶標(biāo)親和素，經(jīng)過(guò)反應(yīng)洗滌后加入酶底物經(jīng)過(guò)顯色判斷待測(cè)物中胰島素樣生長(zhǎng)因子II的含量。
一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由固相酶標(biāo)板、 人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體、人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶和輔助試劑組成。
所述人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體是由人胰島素樣生長(zhǎng)因子II連接甲狀腺球蛋白后免疫動(dòng)物獲得抗血清，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨分級(jí)純化得到。
其特征在于，所述動(dòng)物為羊、兔或鼠。
所述人胰島素樣生長(zhǎng)因子II連接甲狀腺球蛋白的方法為戊二醛法。
所述生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的制備方法如下將人胰島素樣生長(zhǎng)因子II 加入到0. lmol/L pH 9. 2的碳酸鹽緩沖液中，在磁力攪拌下，吸取活化生物素溶液加入人胰島素樣生長(zhǎng)因子II溶液中，室溫?cái)嚢鑑i，24h后將其用生理鹽水透析12h，間隔換液4次，將反應(yīng)物移至離心管高速離心，取上清加入等體積甘油，-20°C保存。
所述輔助試劑包括顯色液、反應(yīng)終止液、底物工作液、洗滌液和緩沖液。
本發(fā)明的有益效果用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)150份正常獻(xiàn)血員和180份肝癌介入前和介入后患者血清，發(fā)現(xiàn)正常獻(xiàn)血員血清IGF II水平明顯低于肝癌各組患者，P < 0. 05 ； 肝癌患者進(jìn)行介入治療3天后IGF II水平明顯低于治療前，P < 0. 05 ；介入治療后3天與治療后一個(gè)月水平相比無(wú)明顯差異。表明該試劑盒可靈敏檢測(cè)血清中IGF II水平的差異。


圖1為IGF II酶聯(lián)免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
以下實(shí)施例并不限定本發(fā)明，實(shí)施例中未詳細(xì)說(shuō)明的操作步驟請(qǐng)參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版相應(yīng)部分(J.薩姆布魯克E. F.弗里奇等，科學(xué)出版社)或參閱所用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例1人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒的制備
1、材料
免疫用大耳白兔3只，雄性，體重1. 5公斤，由301醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。人 IGF II多肽購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司，人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma 公司。
2、人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體的制備和純化
將IGF II與甲狀腺球蛋白(TG)按最優(yōu)分子比(1 100)投料，采用戊二醛法連接， 經(jīng)透析后分裝、冷凍干燥備用，制得IGF II -TG0
首次免疫將IGF II -TG 200 μ g與弗氏完全佐劑充分混勻，分別與3只兔背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每隔4周加強(qiáng)免疫一次(將免疫原100 μ g與弗氏不完全佐劑充分混勻后同上法注射)。于第4次免疫后7天經(jīng)動(dòng)物頸動(dòng)脈放血，分離血清，分裝，-80°C保存。
取2mL兔抗IGF- II血清，加入4mL生理鹽水稀釋，置磁力攪拌器上，用飽和硫酸銨分級(jí)純化，過(guò)SephadeXG75柱，制得人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體。用紫外分光光度法測(cè)其蛋白含量。
3、生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的制備
IGF II 0. 25mg加0. lmol/L pH 9. 2的碳酸鹽緩沖液在磁力攪拌下，吸取1. 86mg活化生物素溶液加入IGF II溶液中，室溫?cái)嚢璩睾?，次日將其用生理鹽水透析12h，間隔換液 4次，將反應(yīng)物至小管高速離心，取上清加入等體積甘油保護(hù)，-20°C保存。
4、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶的制備
稱3mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶于0. 5ml新鮮三蒸水中，加NaIO4進(jìn)行醛化后，用 50mmol/L pH 9. 5的碳酸鹽緩沖液調(diào)PH彡9. 0，在磁力攪拌下緩慢將200 μ L親和素溶液滴加醛化的HRP溶液中，4°C攪拌反應(yīng)2h，加入0. 4%的NaBH4IOO μ L于反應(yīng)液中，4°C反應(yīng)2h， 用IOmmol pH 7. 8PBS透析過(guò)夜。次日，將反應(yīng)液離心，取上清加入等體積甘油，分裝凍存。
5、輔助試劑
顯色液(包括顯色劑A和顯色劑B)、反應(yīng)終止液、底物工作液、洗滌液和緩沖液均購(gòu)買自天根(北京)生化科技有限公司。
實(shí)施例2檢測(cè)方法
1、固相抗體酶標(biāo)板的制備
取純化后的IGF II抗體，用0. 05M檸檬酸鹽緩沖液配制成10ug/ml，將其按每孔 200 μ 1量加入96孔酶標(biāo)板中，37°C孵育池，洗板，加入含3%牛血清白蛋白的Tris. HCl封閉液中，4°C過(guò)夜，甩去封閉液，用冷凍干燥機(jī)去掉孔內(nèi)多余水分，將其裝入錫箔袋中用真空包裝機(jī)抽真空密封，保存于4°C。
2、試劑和儀器準(zhǔn)備
凍干的人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品1瓶每瓶用實(shí)驗(yàn)緩沖液0. 5mL溶解后濃度分別為250、83、27、9、3、lng/mL ；生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II 1瓶；親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶工作液1瓶；顯色劑A :1支；顯色劑B :1瓶，顯色液用前A與BWl 19的比例混合；終止液1瓶；濃縮洗滌液1瓶(30mL)用前用重蒸水1 20倍稀釋；緩沖液1瓶； 加樣器、振蕩器、溫箱。
3、樣品收集、處理及保存方法
血清室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右Q000-3000轉(zhuǎn)/分)。 收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對(duì)收集后當(dāng)天進(jìn)行的標(biāo)本，儲(chǔ)存在4°C備用，如有特殊原因需要周期收集標(biāo)本，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在_20°C或-70°C條件下保存。避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8°C可保存48小時(shí)，-20°C可保存1個(gè)月。-70度可保存6個(gè)月。
血漿應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10% (ν/ ν)抗凝劑(0. IM檸檬酸鈉或1 % heparin或2. 0% EDTA. Na2)混合10-20分鐘后，離心20 分鐘左右O000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
本實(shí)施例選取庫(kù)存150份正常獻(xiàn)血員和患者復(fù)查存留的180份肝癌介入前和介入后患者血清做為實(shí)驗(yàn)樣品。
4、操作步驟
(1)使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
(2)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)SO孔、人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
(3)加入稀釋好后的人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品ΙΟΟμ 1于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品ΙΟΟμ 1于反應(yīng)孔內(nèi)。除空白孔外立即加入100μ 1的生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II。 蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37°C溫育1. 5小時(shí)。
(4)甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
(5)每孔加入200 μ 1的親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，輕輕振蕩混勻，37°C溫育 30分鐘
(6)甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
(7)每孔加入底物工作液200 μ 1，輕輕振蕩混勻，37°C溫育10分鐘。避免光照。
(8)取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μ 1終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)。
(9)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
加樣步驟如下表
權(quán)利要求
1.一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒由固相酶標(biāo)板、人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體、人胰島素樣生長(zhǎng)因子II標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶和輔助試劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述人胰島素樣生長(zhǎng)因子II抗體是由人胰島素樣生長(zhǎng)因子II連接甲狀腺球蛋白后免疫動(dòng)物獲得抗血清，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨分級(jí)純化得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述動(dòng)物為羊、兔或鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述人胰島素樣生長(zhǎng)因子II連接甲狀腺球蛋白的方法為戊二醛法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子II的制備方法如下將人胰島素樣生長(zhǎng)因子II加入到0. lmol/L pH 9. 2的碳酸鹽緩沖液中，在磁力攪拌下，吸取活化生物素溶液加入人胰島素樣生長(zhǎng)因子II溶液中，室溫?cái)嚢琛穒，24h后將其用生理鹽水透析12h，間隔換液4次，將反應(yīng)物移至離心管高速離心，取上清加入等體積甘油，-20°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子II酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒，所述輔助試劑包括顯色液、反應(yīng)終止液、底物工作液、洗滌液和緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒。該試劑盒由固相酶標(biāo)板、人胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ抗體、人胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化人胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶和輔助試劑組成。該試劑盒可靈敏檢測(cè)血清中IGFⅡ水平的差異。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102520190SQ201110421230
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者薛輝, 顏光濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院