制備的人工免疫原適當(dāng)稀釋，使其吸光度在0. 1~2之間，以PBS為空白對照， 用紫外分光光度計(jì)在200~500nm分別測定DBP半抗原和DBP-BSA吸光值，繪制紫外吸收 光譜圖，并根據(jù)以下公式計(jì)算偶聯(lián)比：
[0091]
[0092]式中：ODccinjugate 偶聯(lián)物吸光度；ODprotein 蛋白質(zhì)吸光值；ODhapten 半 抗原吸光值；Chapten--半抗原濃度；Cprotein--蛋白質(zhì)濃度；Mhapten--半抗原分子量； Mpr〇tein--蛋白質(zhì)分子量。
[0093] 由圖4的紫外光譜圖可知，DBP半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯有兩個紫外吸收 峰即281nm和308nm，其中308nm處紫外吸收峰為特征峰；BSA有兩個紫外吸收峰，分別位于 227nm和278nm處，其中278nm吸收峰處的吸收值很低；DBP人工免疫原有兩個紫外吸收峰， 分別位于228nm和334nm處。此外，我們可以清晰發(fā)現(xiàn)，半抗原在308nm處的紫外吸收峰發(fā) 生紅移后轉(zhuǎn)移到334nm處，這說明半抗原上的氨基發(fā)生了重氮化后已經(jīng)成功與BSA相互偶 聯(lián)結(jié)合；而BSA紫外吸收峰有所偏移，由227nm處移至228nm處，這說明有一部分氨基酸與 DBP半抗原發(fā)生了偶聯(lián)反應(yīng)，從而使DBP半抗原、BSA與人工免疫原的紫外吸收光譜既有區(qū) 別又有聯(lián)系，綜合得知：免疫原包含了DBP半抗原和蛋白質(zhì)BSA的吸收特征，說明DBP半抗 原已順利偶聯(lián)到載體蛋白表面，人工免疫原的合成制備成功。計(jì)算DBP-BSA中DBP與BSA 的結(jié)合比為30. 0:1。
[0094]實(shí)施例8、鄰苯二甲酸二丁醅免痔原蛋白質(zhì)濃度的測宙
[0095] 根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G250法測定免疫原蛋白質(zhì)濃度?？捡R斯亮藍(lán)G250在游離時為紅 色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后為青藍(lán)色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm處。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，與一定量考馬斯亮藍(lán)G250反應(yīng)后，分別在595nm處測定溶液吸 光度值。標(biāo)準(zhǔn)溶液在0-150yg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在稀釋一定倍數(shù)的免疫原溶液中 加入考馬斯亮藍(lán)染色，在相同波長處測量吸光度值，后與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得制備的免疫原蛋 白質(zhì)濃度為3. 46mg/mL。這些DBP人工免疫原既可以用于免疫動物，通過動物產(chǎn)生的免疫反 應(yīng)得到可以用來做免疫分析的單克隆或多克隆抗體，又可以作為免疫競爭對象而使用。
[0096]實(shí)施例9、動物免痔實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0097] 為證實(shí)DBP半抗原偶聯(lián)合成的人工免疫原具有免疫原性，故通過生物體免疫反應(yīng) 制備抗DBP多克隆抗體，具體如下：選擇2只成年健康雄性新西蘭白兔，合成出的人工免疫 原經(jīng)過與弗氏完全佐劑充分混合后，對大白兔進(jìn)行頸部和背部點(diǎn)狀注射免疫，經(jīng)過7次加 強(qiáng)免疫后，采用間接酶聯(lián)免疫分析法測定抗血清效價，其抗血清效價均已達(dá)到180000,具體 效價變化見圖5。試驗(yàn)顯示交叉反應(yīng)均不明顯，說明其特異性較好。
[0098] 實(shí)施例6、間接競爭BA-ELISA免痔分析方法檢測環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二丁醅
[0099] 間接競爭BA-ELISA免疫分析方法檢測環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二丁酯具體步 驟如下：用用包被緩沖液（0.05MpH9. 60碳酸鹽緩沖液）適當(dāng)稀釋人工包被原溶液， 100yL/孔，加入96孔酶標(biāo)板中，4°C包被過夜；次日倒掉包被液，每孔加入200yL洗滌液 (0.OlMpH7. 40PBST)，重復(fù)洗滌三次，每次3min;用吸水紙拍干酶標(biāo)板后，每孔加入封閉液 200yL，37°C溫育1小時；倒掉封閉液，重復(fù)上述洗滌過程三次，生物素化抗DBP多克隆抗體 (Bio-pAb-DBP)稀釋至適當(dāng)濃度，每孔依次加入50yL生物素化抗體及50yLDBP標(biāo)準(zhǔn)樣品 (用含5%二甲亞砜（DMSO)的PBS(v/v)梯度稀釋），空白孔每孔加入100yLPBS緩沖液， 37°C溫育30分鐘；倒掉抗原-抗體反應(yīng)液，重復(fù)洗滌三次，用PBST適當(dāng)稀釋辣根過氧化酶 (HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素（HRP-SA)，每孔加入100yL，37°C溫育1小時；倒掉HRP-SA溶液， 重復(fù)洗滌五次，每孔加入新鮮配制的顯色液（400yL2.5mg/mL3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺 底物溶液與IOmL磷酸鹽-檸檬酸底物緩沖液、10yL30 %的H2O2混合形成顯色液）100yL/ 孔，室溫下避光反應(yīng)15min;每孔加入50yL終止液（2mol/L硫酸溶液）以終止顯色，然后 用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm和630nm處吸光度值（0D值），以O(shè)D=OD4m-OD63。作為最終讀 數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抑制率來表示，并以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖6所示。其中，抑制率（％) = (1-A/AJX100,其中A 為有樣品存在的孔的OD值，A。為沒有樣品存在的孔的OD值。
[0100] 生物素化抗體的制備如下：用0. 05MpH9. 60碳酸鹽緩沖液將純化后的抗DBP多 克隆抗體稀釋至I.Omg/mL左右，取2mL加入錐形瓶中；用DMSO配制I.Omg/mL生物素-N-琥 珀酰亞胺基酯（BNHS)溶液，向上述錐形瓶中加入BNHS溶液，使BNHS:抗DBP多克隆抗體 的質(zhì)量比為1 :1〇,室溫下攪拌反應(yīng)4小時；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用PBS緩 沖液透析3d，每天換水3次。離心分離去除少量沉淀后，即得相應(yīng)的生物素化抗體溶液 (Bio-pAb-DBP)，抗體溶液小體積分裝后，于-20°C冷凍保存。
[0101] 間接競爭BA-ELISA免疫分析方法檢測鄰苯二甲酸二丁酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 21. 39LgCDBP+59. 52,相關(guān)系數(shù)R2= 0. 9815,其中IC5。表示檢測方法的靈敏度，即抑制率為 50%時對應(yīng)的分析物濃度0. 361yg/LJC1。表示方法的檢測下限，即抑制率為10%時對應(yīng) 的分析物濃度〇. 0053yg/L;IC2Q-ICS。表示線性范圍，即0. 015yg/L~8. 965yg/L。與傳 統(tǒng)儀器分析方法相比，靈敏度提高了 100-500倍。
[0102] 以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA，其特征在于，結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA 的制備方法，其特征在于，所述方法包括采用重氮化法將DBP半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)制備人工免疫原 DBP-BSA。3. 如權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其特征 在于，所述方法具體包括如下步驟： 51、 將所述DBP半抗原溶于非質(zhì)子有機(jī)溶劑中，形成DBP半抗原溶液； 52、 向所述DBP半抗原溶液中依次滴加強(qiáng)酸、亞硝酸鈉溶液，控制pH為2. 0~3. 0,反應(yīng) 結(jié)束后去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉，生成重氮鹽溶液； 53、 將牛血清蛋白BSA溶于0. 01~0. 05MpH9. 18硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白 溶液； 54、 在所述重氮鹽溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用強(qiáng)堿溶液調(diào)節(jié)pH直至溶液逐漸呈 橙紅色，攪拌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述人工免疫原DBP-BSA。4. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其 特征在于，所述DBP半抗原、強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:4~5:4~ 5:0. 005 ~0. 008。5. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其特征 在于，所述強(qiáng)酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸；所述強(qiáng)堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀。6. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其特征 在于，步驟S1中，所述去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉是加入尿素以去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉，所述 尿素與DBP半抗原的摩爾比為150~160:1。7. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其特征 在于，步驟S4中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C低溫磁力攪拌下進(jìn)行；所述攪拌時間為12~ 18小時。8. 如權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其特征 在于，所述步驟S4還包括偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，將上清液裝入透析袋中透析，離心分 離沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步驟。9. 如權(quán)利要求2或3所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA的制備方法，其 特征在于，所述DBP半抗原是通過包括如下步驟的方法制備而得： 4-硝基鄰苯二甲釀與正丁醇在強(qiáng)酸的催化下回流反應(yīng)，生 成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯； 以苯或甲苯為溶劑，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯和鋅粉、強(qiáng)酸發(fā)生還原反應(yīng)，生成 所述DBP半抗原。10. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA在用于痕量塑 化劑鄰苯二甲酸二丁酯檢測中的用途，其特征在于，所述檢測采用免疫檢測法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA制備及用途，所述DBP-BSA的結(jié)構(gòu)式為：其制備方法為通過將DBP半抗原與蛋白質(zhì)分子BSA偶聯(lián)制備獲得。本發(fā)明免疫原制備方法簡單，穩(wěn)定性好，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA通過免疫動物后制備成特異性抗體，為建立親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C07K14/765, C07K1/10, G01N33/53
【公開號】CN105085662
【申請?zhí)枴緾N201510514925
【發(fā)明人】莊惠生, 孫瑞艷
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月20日