與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及庚型肝炎病毒對Hiv-1抑制作用中相互作用蛋白的研究方法和基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與庚型肝炎病毒Ε2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α。
【背景技術(shù)】
[0002]鑒于庚型肝炎病毒(GB Virus C，GBV-C)本身無致病性，但與HIV-1共感染有益于延緩HIV-1患者病程的特點(diǎn)，闡明GBV-C抑制HIV-1的作用機(jī)理將是GBV-C應(yīng)用于HIV-1疾病治療中亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展，GBV-C對HIV-1的抑制作用主要包括以下幾方面=(I)GBV-C的包膜糖蛋白E2通過與HIV-1 Gp41的結(jié)合阻礙HIV的入胞。(2)GBV-C NS5A區(qū)的短肽可能通過抑制T細(xì)胞中HIV-1輔助受體CCR5和CXCR4的表達(dá)，阻礙HIV-1入胞。(3)GBV-C通過降低T細(xì)胞中FAs蛋白的表達(dá)，影響了 FAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，提高了⑶4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)，延緩了 HIV-1患者的病程。(4) GBV-C通過增強(qiáng)T細(xì)胞中Thl型細(xì)胞因子IL-2和IL-12的表達(dá)，進(jìn)而抑制了 Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13和IL-10的表達(dá)，最終阻礙了 HIV--1復(fù)制。(5)GBV_C通過降低T細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中LCK蛋白的表達(dá)，降低T細(xì)胞的活性，導(dǎo)致⑶38、⑶69、⑶25和CCR5分子的表達(dá)明顯下降，影響HIV-1的復(fù)制。(6)目前，研究發(fā)現(xiàn)GBV-C E2蛋白還可通過阻礙HIV-1 GAG蛋白組裝和釋放來抑制HIV-1的復(fù)制。以上研究為闡明GBV-C與HIV-1的相互作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。然而，目前這些研究都具有一定的片面性。因此，GBV-C抑制HIV-1的作用機(jī)理仍無明確的定論。
[0003]確定病毒與共用宿主間直接作用的蛋白及其功能是研究兩病毒間相互作用機(jī)理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前GBV-C抑制HIV-1增殖的作用機(jī)理研究主要集中在GBV-C阻礙了 HIV-1入胞過程和改變了 T細(xì)胞活性兩大方面，盡管已有文獻(xiàn)報(bào)道GBV-C的包膜糖蛋白E2和NS5A短肽可以抑制HIV-1復(fù)制，但究竟GBV-C E2蛋白與其共用宿主上的哪些靶蛋白直接相互作用，從而阻礙了 HIV-1入胞、影響了 T細(xì)胞活性等效應(yīng)的產(chǎn)生，這些靶蛋白的功能又如何，目前仍不明確。因此，展開這些靶蛋白的相關(guān)研究對揭示GBV-C與HIV-1互作機(jī)制有著十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α，所述人類蛋白LT-α的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]所述蛋白LT-α為淋巴毒素a，也被稱為腫瘤壞死因子β (TNF-β)，與腫瘤壞死因子A(TNF-a)及淋巴毒素β (LT- β )同屬于腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)家族。人LT-α基因定位于第6號染色體，LT-α分子由205個(gè)氨基酸殘基組成，含34個(gè)信號肽，成熟型LT-α分子為171個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為25000。LT- α屬于腫瘤壞死因子家族，是細(xì)胞活素類物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，從而影響細(xì)胞凋亡分化。LT- α在HIV-1感染的⑶4+細(xì)胞中能夠活化或誘導(dǎo)NF- κ B，NF- κ B結(jié)合于HIV-1的長末端重復(fù)序列(LTR)的增強(qiáng)子部位，進(jìn)而活化HIV-1基因，可能與HIV-1的發(fā)病有關(guān)。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供編碼上述人類蛋白LT-α的基因，其核酸序列如SEQ IDNO: 2所示。
[0008]本發(fā)明還提供含有上述人類蛋白LT-α基因的載體。
[0009]本發(fā)明還提供含有上述人類蛋白LT-α基因的工程菌。
[0010]本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選與庚型肝炎病毒Ε2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α的方法:利用第四代酵母雙雜交的方法通過庚型肝炎病毒E2蛋白對人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行篩選，獲得與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白，并通過免疫共沉淀的方法對互作進(jìn)行陽性驗(yàn)證，從而篩選得到與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α，所述人類蛋白LT-α的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，包括以下步驟:
(1)編碼庚型肝炎病毒蛋白E2基因的克隆與鑒定:從7型庚型肝炎病毒株中提取RNA，獲得RNA后，再用逆轉(zhuǎn)錄的方法得到cDNA，再通過普通PCR、瓊脂糖凝膠電泳及序列測定分析鑒定目的片段；
(2)含有庚型肝炎病毒E2蛋白目的片段的誘餌質(zhì)粒載體的構(gòu)建:回收目的片段，酶切后與pGBKT7連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，篩選陽性克隆，即構(gòu)建得到可表達(dá)BD-Bait融合蛋白的質(zhì)粒；
(3)人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建；
(4)可表達(dá)AD-Library/prey融合蛋白的質(zhì)粒:構(gòu)建于pGADT7的人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫，購自Clontech公司；
(5)用第四代酵母雙雜交的方法篩選人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫中與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的候選蛋白；
(6)用免疫共沉淀的方法進(jìn)一步驗(yàn)證陽性互作蛋白，從而篩選得到與庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人類蛋白LT-α。
[0011]其中，步驟(6)具體為:將步驟(5)中獲得的候選蛋白與庚型肝炎病毒的Ε2蛋白分別構(gòu)建到pflag-cmv2和pcDNA3.1/myc-His (_)A上，與不同tag標(biāo)簽形成融合蛋白，然后用X-tremeGENE HP DNA Transfect1n Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK239，48-72h后裂解細(xì)胞，與ANT1-FLAG M2 Affinity Gel孵育沉淀，最后通過Western blot檢測分析陽性互作的結(jié)果。
[0012]具體地，本發(fā)明的一種篩選與庚型肝炎病毒相互作用的人類蛋白LT-α的方法，包括以下步驟:
1、庚型肝炎病毒E2基因的克隆與鑒定
所述庚型肝炎病毒E2蛋白從7型庚型肝炎病毒株中提取RNA，獲得RNA后，再用RT-PCR的方法得到cDNA，再通過普通PCR、瓊脂糖凝膠電泳及序列測定，序列比對分析鑒定目的片段;
2、庚型肝炎病毒E2蛋白構(gòu)建誘餌融合蛋白
將上述PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離進(jìn)行回收，對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，并回收純化線性酶切產(chǎn)物；將載體和目的片段按1:4的摩爾比進(jìn)行連接，16°C過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，與抗性培養(yǎng)基上鑒定陽性克??；挑取單克隆培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過PCR、雙酶切和測序鑒定后，確定為庚型肝炎病毒E2基因構(gòu)建的BD-bait融合蛋白質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化酵母鑒定庚型肝炎病毒E2蛋白重組子的自激活和毒性，即可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；
3、從ClonTeCh公司購買的人T淋巴細(xì)胞cDNA文庫，構(gòu)建與pGADT7載體上；
4、分別將誘餌和文庫轉(zhuǎn)到酵母雙雜交系統(tǒng)的兩種酵母中，然后再雜交進(jìn)行文庫篩選；誘餌轉(zhuǎn)化使用的酵母為Y2H Gold酵母株，文庫轉(zhuǎn)化使用的酵母為Y187酵母株，報(bào)告基因系統(tǒng)為:-His、-Ade、AURl-C、MELl ；
(1)制備酵母感受態(tài)細(xì)胞
A、取小部分凍存的酵母細(xì)胞在YPDA瓊脂平皿上劃線培養(yǎng)(若劃線前已解凍，渦旋，以保證酵母細(xì)胞均勻分布)，倒置平皿，30°C溫育至菌落出現(xiàn)(約3d);
B、挑取單菌落(彡4w，2-3mm)，接種5mLYPDA液體培養(yǎng)基于15mL無菌離心管中，30°C振蕩培養(yǎng)12h ;
C、取100μ I培養(yǎng)物于含有50 mL YPDA的250 mL燒瓶中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)4_6h，0D600應(yīng)達(dá)到0.6 ；
D、3000rpm室溫離心5_10min，棄上清，加入3OmL無菌去離子水重懸細(xì)胞沉淀；
E、3000rpm室溫離心5-lOmin，棄上清，加入1.5mL 1.1 X TE/LiAC溶液重懸細(xì)胞，高速離心 12000rpm, 15s ；
F、棄上清，600yL 1.1 X TE/LiAC溶液重懸細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞；
(2)轉(zhuǎn)化baiT和prey于感受態(tài)細(xì)胞
A、分別取0.1yg baitT 和 prey 質(zhì)粒 DNA，5 μ L (0.lmg) Carrier DNA 至無菌的 1.5mLEP管中，混勻，加入50 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞，渦旋混勻；
B、加入0.5mL無菌I XPEG/LiAC混勻，30°C溫育30min，每1min混