專(zhuān)利名稱(chēng)：一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分析領(lǐng)域，特別涉及一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法。
背景技術(shù)：
主要組織相容性復(fù)合體蛋白(MHC)由主要組織相容性復(fù)合體編碼，廣泛存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面的一個(gè)糖蛋白分子大家族。MHC表面有一溝，可與外來(lái)抗原的肽鏈結(jié)合，將其提呈給T細(xì)胞引起免疫反應(yīng)。因此研究MHC與蛋白的相互作用對(duì)于研究一些疾病的致病機(jī)制非常重要。人類(lèi)白細(xì)胞抗原DQ2蛋白(DQ2)是MHC很重要的一種蛋白。生物分析技術(shù)在揭示MHC蛋白和多肽的相互作用中起到了至關(guān)重要的作用。目 前研究MHC蛋白與多肽相互作用的方法主要有高效凝膠過(guò)濾色譜法(HPSEC) (B. J.McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant, et al. J. Mol. Biol. 2005, 350, 170-183),突光偏振法(S. L. De Wall, C. Painter, J. D. Stone, et al. Nat. Chem. Biol. 2006,
2,197-201),核磁共振法(L. Schmitt, J. J. Boniface, Μ. M. Davis, et al. J. Mol.Biol. 1999，286，207-218)等。然而，現(xiàn)在大多數(shù)的分析方法只能測(cè)量單個(gè)多肽和MHC蛋白的結(jié)合過(guò)程，而無(wú)法反應(yīng)在生物體內(nèi)的抗原遞呈過(guò)程的復(fù)雜性一細(xì)胞內(nèi)源多肽和外源抗原同時(shí)存在的這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。毛細(xì)管電泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分離方法開(kāi)發(fā)容易等優(yōu)點(diǎn)，由于具備如此多的優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力，CE成為近年來(lái)發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。尤其是將熒光檢測(cè)與毛細(xì)管電泳相結(jié)合，大大提高了檢測(cè)限，拓展了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用。本試驗(yàn)建立的多肽配體和HLA-DQ2蛋白相互作用的檢測(cè)方法，克服了已有方法存在的缺陷，可滿足大批量檢測(cè)需要，適用范圍較廣，有較高的精確性及較好的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)蛋白多肽相互作用檢測(cè)的不足，本發(fā)明提供一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽(LQPFPQPELPY，SEQIDN0. I)。將外源多肽I熒光標(biāo)記后與DQ2混合，然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)蛋白多肽復(fù)合物和熒光多肽的出峰時(shí)間及熒光強(qiáng)度；將SDQ2_Pep/STotal作為Y軸，以時(shí)間為X軸，得到DQ2與多肽結(jié)合的曲線。其中SDQ2_Pep是DQ2多肽復(fù)合物的熒光峰面積積分，Slotal是整個(gè)電泳普通的熒光峰面積積分。本發(fā)明方法中所述的毛細(xì)管電泳檢測(cè)中，電泳緩沖液優(yōu)選為25 mM硼酸緩沖液，PH9.3。所述硼酸緩沖液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾。本發(fā)明的方法還可以同時(shí)檢測(cè)不同外源多肽及不同外源多肽與DQ2的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。例如，當(dāng)外源多肽為兩種時(shí)，將兩種不同熒光分子標(biāo)記的外源多肽I和外源多肽2與DQ2混合，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，分別記錄兩種熒光標(biāo)記物的熒光變化。將蛋白與多肽混合后，可根據(jù)毛細(xì)管電泳譜圖的變化檢測(cè)蛋白多肽相互作用。該方法還可以檢測(cè)兩種外源多肽與蛋白相互作用的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，所需時(shí)間短；可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光波長(zhǎng)，從而減少了誤差，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。該方法是對(duì)傳統(tǒng)蛋白多肽相互作用檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，建立的一種新的高靈敏蛋白多肽相互作用檢測(cè)技術(shù)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。圖I DQ2與外源多肽相互作用示意圖。
圖2毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)DQ2與多肽P印2的相互作用。其中，a是P印2的電泳 譜圖；b是DQ2與P印2混合物的電泳譜圖，DQ2/Pep2=l: 10 ;c是DQ2與P印2混合物的電泳譜圖，002外印2=10:1。激發(fā)光源λ ex=490 nm。圖3毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)DQ2與多肽P印I的相互作用。其中，a是P印I的電泳譜圖山是002與？印1混合物的電泳譜圖，002外印2=10:1。激發(fā)光源λ ex=490 nm。圖4毛細(xì)管電泳同時(shí)熒光檢測(cè)兩種外源多肽P印2和P印3與DQ2的相互作用。P印2的檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm (檢測(cè)FAM)，P印3的檢測(cè)波長(zhǎng)為670 nm (檢測(cè)Cy5),DQ2:Pep2:Pep3=10:1:1,激發(fā)光源 λ ex=490 nm。圖5毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)P印3多肽與DQ2相互作用的動(dòng)力學(xué)。A，是P印3與DQ2混合后不同時(shí)間檢測(cè)的毛細(xì)管電泳譜圖是SDQ2_Pep3/ST()tal隨時(shí)間變化的曲線。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明原理如圖I所示，下述實(shí)施例中具體操作流程如下
I、首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽。2、將熒光標(biāo)記的外源多肽與步驟I中切除了 α I多肽的DQ2混合。3、進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)
電泳緩沖液:為25 mM硼酸緩沖液(ρΗ9. 3)；
毛細(xì)管為未涂層毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μ m，長(zhǎng)度60 cm，有效長(zhǎng)度35 cm)。電泳檢測(cè)進(jìn)樣電壓12 KV，進(jìn)樣10 S，然后停止加壓。分離電壓18 KV，分離10min，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)通道的熒光強(qiáng)度，收集、分析得到相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。4、將SDQ2_Pep/ST()tal作為Y軸，以時(shí)間為X軸，得到DQ2與多肽結(jié)合的曲線。其中SDQ2-Pep是DQ2多肽復(fù)合物的熒光峰面積積分，Slotal是整個(gè)電泳普通的熒光峰面積積分。DQ2可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得，例如可按照文獻(xiàn)的方法制備(/辦？ Chem Soc 2006;128: 1859-1867)。也可以通過(guò)下述方法得到2升High-Five細(xì)胞(濃度為2_2. 5 r IO6個(gè)/毫升)首先用桿狀病毒感染(感染復(fù)數(shù)MOI為3-5)，4天后離心30分鐘收集上清液?？扇苄訢Q2分子通過(guò)蛋白A-瓊脂糖凝膠柱純化，并用pHll. 5的緩沖液(含有50mM 二乙胺，O. 15M NaCl和2M Tris)洗脫。實(shí)施例I
實(shí)例中使用的儀器及操作條件如下
所用毛細(xì)管電泳為基于熒光顯微鏡自搭毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，高壓電源為上海核物理研究所生產(chǎn)；熒光光譜儀為海洋光學(xué)QE65000 ;自制顯微鏡接口，將顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)口的熒光通過(guò)光纖導(dǎo)入光譜儀。采用電壓進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓12 KV，進(jìn)樣時(shí)間為10 S，電泳電壓為18 KV，電泳10 min。圖2為用毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)DQ2與多肽P印2的相互作用。P印2序列為MATPLLMQALPMGALPQ (SEQ ID NO. 3)，用羧基熒光素(FAM)標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DQ2與多肽P印2的相互作用后在約500 s產(chǎn)生一個(gè)新的熒光峰，而多肽的峰明顯減弱，因此該方法可以用來(lái)檢測(cè)DQ2與多肽的相互作用。 實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1，區(qū)別在用毛細(xì)管電泳檢測(cè)外源多肽P印I與DQ2的相互作用，外源多肽P印I序列為FAM-PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID NO. 2)，用FAM標(biāo)記。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，DQ2與多肽P印I的相互作用后產(chǎn)生一個(gè)新的熒光峰，證明外源多肽P印I可以與DQ2相
互作用。實(shí)施例3
實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1，區(qū)別在用毛細(xì)管電泳同時(shí)檢測(cè)兩種外源多肽P印2和P印3與DQ2的相互作用，外源多肽P印2用FAM標(biāo)記；外源多肽P印3序列為L(zhǎng)QLQPFPQPELPYPQPELPY(SEQID NO. 4),用近紅外菁類(lèi)染料(Cy5)標(biāo)記。如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在同一光源激發(fā)下，可同時(shí)檢測(cè)兩種外源多肽與DQ2的相互作用。實(shí)施例4
實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1，區(qū)別在用毛細(xì)管電泳檢測(cè)P印3多肽(用Cy5標(biāo)記)與DQ2相互作用的動(dòng)力學(xué)，如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DQ2與Pep3復(fù)合物的電泳峰(圖5A，約520 S)，隨時(shí)間的增加而逐漸增加。因此可通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)DQ2與外源多肽的結(jié)合過(guò)程。通過(guò)上述四個(gè)實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法可以實(shí)現(xiàn)蛋白多肽相互作用檢測(cè)，并且靈敏度高，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確。以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。
權(quán)利要求
1.一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于包括以下步驟先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽；再與經(jīng)熒光標(biāo)記的外源多肽混合得混合物，然后對(duì)混合物進(jìn)行毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)混合物中DQ2-多肽復(fù)合物和外源多肽的出峰時(shí)間及熒光強(qiáng)度，得出DQ2與外源多肽結(jié)合的曲線。
2.如權(quán)利要求I所述的一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述外源多肽為兩種或兩種以上，不同的外源多肽分別用不同的熒光分子標(biāo)記，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，分別記錄不同熒光標(biāo)記物的熒光變化。
3.如權(quán)利要求I所述的一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述的毛細(xì)管電泳檢測(cè)中，電泳緩沖液為25 mM硼酸緩沖液，ρΗ9. 3。
4.如權(quán)利要求3所述的一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述硼酸緩沖液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾。
5.如權(quán)利要求I所述的一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述的外源多肽為DQ2的抗原多肽P印I和/或和/或；所述P印I、Pep2和P印3的序列分別如SEQ ID NO. 1-3所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管電泳檢測(cè)蛋白多肽相互作用的方法，屬于生物分析領(lǐng)域。首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的αI多肽(LQPFPQPELPY)。將外源多肽熒光標(biāo)記后與DQ2混合，然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)蛋白多肽復(fù)合物和熒光多肽的出峰時(shí)間及熒光強(qiáng)度。該方法還可以同時(shí)檢測(cè)兩種外源多肽與蛋白相互作用的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，所需時(shí)間短。該方法是對(duì)傳統(tǒng)蛋白多肽相互作用檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，建立的一種新的高靈敏蛋白多肽相互作用檢測(cè)技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102890074SQ20121039008
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車(chē)禮, 夏江 申請(qǐng)人:常州大學(xué)