r)V/cm ^3451. 79, 3362. 77 (-NH2)，1716. 12(C= 0)，1290. 51，1142. 57 (C-O-C)， 2956. 59, 2871. 60 (-CH3)，1458. 28 (d-0CH2-)，1602. 04, 1565. 54, 1476. 69(C=C)， 1682.88,850.77(C-H，Ar)!1HNMR(400MHz，CDCl3) :5 7. 71 (d，lH，ArH)，7.24 (d，lH，ArH)， 6. 96 (d, 1H,ArH)，4. 28 (t，2H，OCH2)，4. 24 (t，2H，OCH2)，4. 22 (b, 2H, -NH2)， I. 69-1. 64 (m, 4H,OCH2CH2)，I. 43-1. 38 (m, 4H,OCH2CH2CH2)，0? 93 (t, 6H,OCH2CH2CH2CH3)ppm。紅 外、核磁表征結(jié)果表明，DBP半抗原具有-NH2、-0-CH2CH2CH2CH3、苯環(huán)等基團(tuán)的特征吸收峰，證 明制備的DBP半抗原分子中含有氨基官能團(tuán)，最終實驗中成功制備了DBP半抗原。
[0070] 從以上分析可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
[0071] 實施例3、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的制備與鑒宙
[0072] 鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的合成路線圖如圖1所示：
[0073] 稱取IOg(0. 0474mol) 4-硝基鄰苯二甲酸加入到圓底燒瓶中，隨后緩慢加入 30. 3mL(0. 3318mol)正丁醇，邊攪拌邊加入I.54mL(0. 0284mol)濃H2SO4催化，逐漸升溫至 125°C回流加熱6小時，直至薄板層析法（TLC)檢測原料點(diǎn)消失為止（顯色劑：丙酮溶劑中 溶解少量的高錳酸鉀；展開劑，正己烷：乙酸乙酯=5:1);反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀中減壓蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的水，再趁熱將液體倒入冰水中，磁力攪拌 5min后靜置一段時間分層，將下層黃色油狀液體用10%似20)3溶液洗滌至水層呈無色（pH 7. 0-8. 0)，再用無水Na2SOJ^水干燥，得到黃色油狀液體4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP 半抗原中間體。4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯分子式：C16H21NO6;分子量：323. 33;產(chǎn)率：90. 1%; 純度98%。
[0074] 稱取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入234mL(2. 6220mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 86g(0. 0437mol)純鋅粉，攪拌均勻后分次加入8. 4mL 濃HCl(0? 1012mol)，室溫攪拌15min后再次加入2. 86g(0? 0437mol)純鋅粉，室溫攪拌反應(yīng) llh，薄板層析法（TLC)監(jiān)測反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將286mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IMNaOH溶液中和至弱堿性（pH7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C16H23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率90. 3% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0075] (2)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的鑒定
[0076]將制得的半抗原經(jīng)紅外光譜（圖2)、核磁共振光譜（圖3)鑒定，結(jié)果為： IR(KBr)V/cm ^3451. 79, 3362. 77 (-NH2)，1716. 12(C= 0)，1290. 51，1142. 57 (C-O-C)， 2956. 59, 2871. 60 (-CH3)，1458. 28 (d-0CH2-)，1602. 04, 1565. 54, 1476. 69(C=C)， 1682.88,850.77(C-H，Ar)!1HNMR(400MHz，CDCl3) :5 7. 71 (d，lH，ArH)，7.24 (d，lH，ArH)， 6. 96 (d, 1H,ArH)，4. 28 (t，2H，OCH2)，4. 24 (t，2H，OCH2)，4. 22 (b, 2H, -NH2)， I. 69-1. 64 (m, 4H,OCH2CH2)，I. 43-1. 38 (m, 4H,OCH2CH2CH2)，0? 93 (t, 6H,OCH2CH2CH2CH3)ppm。紅 外、核磁表征結(jié)果表明，DBP半抗原具有-NH2、-0-CH2CH2CH2CH3、苯環(huán)等基團(tuán)的特征吸收峰，證 明制備的DBP半抗原分子中含有氨基官能團(tuán)，最終實驗中成功制備了DBP半抗原。
[0077] 從以上分析可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
[0078]實施例4、鄰苯二甲酸二丁醅人工免痔原的合成
[0079] 鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原的合成路線圖如圖1所示：
[0080] 采用重氮化法制備DBP免疫原DBP-BSA，具體合成步驟：將0. 0294g(0.Immol) DBP半抗原用100yLDMF溶解，然后在不斷攪拌的情況下逐滴加入到裝有40yL濃鹽酸 (0. 48mmol)和900yLDMF的混合液的25mL錐形瓶中，待混合物加熱溶解后置冰浴中冷 卻；此時，在4°C低溫攪拌的情況下，逐滴滴加IM亞硝酸鈉溶液400yL(0. 4mmol)，用pH試 紙控制反應(yīng)酸度為2. 0-3. 0,同時用淀粉碘化鉀試紙顯色，顯色時間為滴加后的l-3s，試 紙由白色瞬間變成灰藍(lán)色時停止滴加，再繼續(xù)反應(yīng)60min，加0. 9g(0. 015mol)的尿素以去 除未反應(yīng)的亞硝酸鈉；然后，在4°C低溫攪拌的情況下，將上述重氮鹽逐滴加入到0.OSmM 10mL(0.0008mmol)BSA溶液（0.01MpH9. 18硼酸鈉緩沖液溶解）中，溶液用IM氫氧化鈉溶 液調(diào)節(jié)PH直至逐漸呈橙紅色，繼續(xù)反應(yīng)18h后，將得到的抗原粗品裝入透析袋，置于0.OlM pH7. 40磷酸鹽緩沖液中透析3d，每隔8h換水1次，最后將終產(chǎn)物4000r^min1離線15min， 取其上清液冷凍干燥、分裝并于_20°C保存。
[0081]實施例5、鄰苯二甲酸二丁醅人工免痔原的合成
[0082] 鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原的合成路線圖如圖1所示：
[0083] 采用重氮化法制備DBP免疫原DBP-BSA，具體合成步驟：將0. 0294g(0.ImmoDDBP 半抗原用IOOyLDMF溶解，然后在不斷攪拌的情況下逐滴加入到裝有33yL(0.4mmol) 濃鹽酸和900yLDMF的混合液的25mL錐形瓶中，待混合物加熱溶解后置冰浴中冷卻；此 時，在4 °C低溫攪拌的情況下，逐滴滴加IM亞硝酸鈉溶液500yL(0. 5mmo1 )，用pH試紙 控制反應(yīng)酸度為2. 0-3. 0,同時用淀粉碘化鉀試紙顯色，顯色時間為滴加后的l-3s，試紙 由白色瞬間變成灰藍(lán)色時停止滴加，再繼續(xù)反應(yīng)60min，加0. 96g(0. 016mol)的尿素以去 除未反應(yīng)的亞硝酸鈉；然后，在4°C低溫攪拌的情況下，將上述重氮鹽逐滴加入到0.OSmM 6. 25mL(0. 0005mmol)BSA溶液（0.OlMpH9. 18硼酸鈉緩沖液溶解）中，溶液用IM氫氧化 鈉溶液調(diào)節(jié)PH直至逐漸呈橙紅色，繼續(xù)反應(yīng)12h后，將得到的抗原粗品裝入透析袋，置于 0.OlMpH7. 40磷酸鹽緩沖液中透析3d，每隔8h換水1次，最后將終產(chǎn)物4000r^min1離線 15min，取其上清液冷凍干燥、分裝并于-20°C保存。
[0084]實施例6、鄰苯二甲酸二丁醅人工免痔原的合成
[0085] 鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原的合成路線圖如圖1所示：
[0086] 采用重氮化法制備DBP免疫原DBP-BSA，具體合成步驟：將0. 0294g(0.ImmoDDBP 半抗原用IOOyLDMF溶解，然后在不斷攪拌的情況下逐滴加入到裝有42yL(0.5mmol) 濃鹽酸和900yLDMF的混合液的25mL錐形瓶中，待混合物加熱溶解后置冰浴中冷卻；此 時，在4°C低溫攪拌的情況下，逐滴滴加IM亞硝酸鈉溶液450yL(0. 45mmol)，用pH試紙 控制反應(yīng)酸度為2. 0-3. 0,同時用淀粉碘化鉀試紙顯色，顯色時間為滴加后的l-3s，試紙 由白色瞬間變成灰藍(lán)色時停止滴加，再繼續(xù)反應(yīng)60min，加0.93g(0.0155mol)的尿素以去 除未反應(yīng)的亞硝酸鈉；然后，在4°C低溫攪拌的情況下，將上述重氮鹽逐滴加入到0.OSmM 7. 5mL(0. 0006mmol)BSA溶液（0.OlMpH9. 18硼酸鈉緩沖液溶解）中，溶液用IM氫氧化 鈉溶液調(diào)節(jié)PH直至逐漸呈橙紅色，繼續(xù)反應(yīng)15h后，將得到的抗原粗品裝入透析袋，置于 0.OlMpH7. 40磷酸鹽緩沖液中透析3d，每隔8h換水1次，最后將終產(chǎn)物4000r^min1離線 15min，取其上清液冷凍干燥、分裝并于-20°C保存。
[0087]實施例7、鄰苯二甲酸二丁醅人工免痔原的鑒宙
[0088] 可進(jìn)行人工免疫原鑒定的方法有色譜法、紅外光譜法、紫外光譜法、SDS-PAGE凝膠 電泳等。其中最常用的方法是紫外可見光譜法。一般來說，只要人工免疫原的紫外-可見 光譜與載蛋白和半抗原的紫外光譜不同，即可間接說明半抗原成功與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，人工免 疫原合成成功。因為根據(jù)朗伯-比爾定律，當(dāng)波長一定時，混合物的紫外吸收具有加合性。 采用全波長紫外分光光度計對半抗原、載體蛋白和人工免疫原進(jìn)行掃描，根據(jù)特征吸收峰 的位置確定偶聯(lián)是否成功。元素分析結(jié)果進(jìn)一步證明了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和所設(shè)計的路線一致。
[0089] 人工免疫原的表征：
[0090] 將